一种用于癫痫患者无创诊断的肠道微生物基因标志物及其应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于癫痫患者无创诊断的肠道微生物基因标志物及其应用。


背景技术：

2.粪便菌群作为肠道微生态系统的主要组成部分，在人类健康和疾病中起着重要的作用，也是影响宿主疾病风险的环境因素的重要调节器。肠道微生物群与人体的各个器官和系统密切相关并相互作用，包括大脑、肺、肝、骨、心血管系统等。随着测序和代谢组学技术的改进和成本的降低，肠道微生物受到了越来越多的关注和研究。越来越多的临床和临床前证据表明，肠道菌群通过免疫、循环、内分泌和神经途径调控中枢神经系统的发育和稳态，在焦虑、抑郁、自闭症、阿尔茨海默病、多发性硬化症、帕金森病和中风等神经精神疾病中发挥关键作用。在一项关于婴儿神经发育的研究中发现，2岁时的认知功能与1年前的微生物群组成显著相关。无菌小鼠实验也表明基本的神经过程依赖于菌群的组成。肠道微生物群也可能通过调节小胶质细胞活化在衰老和神经退行性变中发挥关键作用。
3.癫痫(epilepsy)是一种以反复发作为特征的慢性神经系统疾病。流行病学统计表明，全世界有5000多万人患有这种疾病(世界卫生组织，2016年)，这与医疗费用的高比率有关。在过去20年里，中国的癫痫患病率增加了一倍多，据估计，每年有240多万人患有癫痫。遗传和环境因素都可以影响个体对癫痫的易感性，但大多数癫痫患者的确切病因尚不清楚。此外，约30％的癫痫患者对传统抗癫痫药物有耐药性，这表明对癫痫研究的新疗法和生物标志物的需求仍未满足。根据中国癫痫临床诊疗指南(2015)，新的癫痫定义有三个要素:至少一次发作；反复发作的倾向和易感性；以及相应的神经生物学、认知、心理和社会影响和障碍。详细的临床病史和对癫痫发作的可靠目击者描述是诊断的基础。这种诊断是由一系列临床特征决定的，包括发病年龄、发作类型、共病、脑电图(eeg)和影像学特征。其中，脑电图是非常关键的诊断工具，癫痫发作往往伴有脑电图表现异常，当不能捕捉习惯性发作时，常使用发作间期癫痫样放电，如尖波、棘波等，支持癫痫的诊断。然而，常规脑电图中没有发作间期癫痫样放电并不排除癫痫的可能性，只有约50％的有癫痫史的患者在常规测试中有癫痫样放电。这种方法依赖于主观描述，没有提供足够的预警信息，对癫痫的发病和预防作用非常有限。癫痫的复杂病因和可靠的人类生物标志物的缺乏迫使我们迫切地寻求新的策略。
4.近年来，随着测序技术的发展，人们对微生物组的组成、功能和代谢潜力与疾病的关系进行了广泛的研究。肠道微生物群对各种神经发育、神经精神和神经退行性疾病的诊断潜力已被令人瞩目的研究证实，但只有少数研究突出了癫痫患者和健康对照组的粪便微生物群之间的区别，肠道微生物群可能在癫痫发作中发挥重要作用，因此可能成为药物治疗的新靶点或生物标志物，肠道微生物群对癫痫的诊断潜力有待进一步评估。本研究的目的是调查癫痫患者和健康对照者的粪便微生物组成的差异，使用几种检测到的生物标志物
建立诊断模型，并验证粪便微生物作为癫痫诊断工具的有效性。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种用于区别癫痫患者和健康人群的肠道微生物基因标志物，由seq id no:1-22所示的22种微生物基因组成，所述微生物基因在人体肠道中富集。
6.22种微生物基因序列如下：
7.》otu2
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27.》otu73
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43.》otu331
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45.》otu995
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47.》otu2364
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49.》otu2944
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51.另外本发明还提供了一种用于检测试剂，包括用于检测seq id no:1-22所示的22种微生物基因的引物，所述引物序列为seq id no:23-24。
52.引物primers
53.测序区域v3+v4：341f-805r
54.上游引物：341f cctacgggnggcwgcag
55.下游引物：805r gactachvgggtatctaatcc
56.本发明还提供了检测试剂在建立一种区别癫痫患者和健康人群的肠道微生物模型(所述肠道微生物模型为用于区分癫痫患者与健康人群的肠道微生物基因标志物集合)中的应用，所述检测试剂适用于检测seq id no:1-22所示的22种微生物基因。
57.所述微生物区别模型适用于区别癫痫患者和健康人群。
58.对所述对象的粪便进行检测，以便确定该样本是否包含所述的微生物基因，是否可以建立区别癫痫患者和健康人群的微生物基因模型。
59.通过收集入组对象的粪便样本，抽提微生物总dna，完成微生物dna的16s rdna miseq测序，检测是否存在权利要求1所述的22种微生物基因。
60.进一步的，通过收集入组对象的粪便样本，抽提微生物总dna，进行肠道菌群的16s rdna miseq测序。基于高通量测序数据，在训练集中建立癫痫患者和健康人群的微生物区别模型，建立癫痫患病率(probability of disease，pod)指数；pod指数在验证集中计算其区别能力，进行验证。
61.具体包括：
62.(1)收集入组对象(癫痫患者和健康人群)的粪便样本，按照dna的标准抽提方法完成粪便样本中微生物总dna的抽提，在illumina miseq平台完成肠道菌群的16s rdna高通量测序工作；
63.(2)基于高通量测序数据，在微生物区别模型的训练集中，在13例癫痫患者和37例健康对照之间，基于一个随机森林模型，通过一个五倍交叉验证的算法，鉴定了用于该模型
的最佳的22个微生物基因标志物。
64.(3)基于22个微生物基因标志物，通过使用随机生成的决策树的比率来计算癫痫患病率的患病率(probability of disease,pod)指数。
65.(4)该微生物区别模型在13例癫痫患者和37例健康对照之间的区别能力达到97.71％，pod指数在癫痫患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)。
66.(5)在验证集中，该微生物区别模型在11例癫痫患者和13例健康对照之间的区别能力达到99.3％；pod指数在癫痫患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)。
67.因此，本发明的微生物基因区别模型在癫痫患者和健康对照人群中实现了良好的区别能力。
68.另外，还提供了一种用于区别癫痫患者和健康人群的肠道微生物模型的试剂盒，包括用于检测权利要求1所述的seq id no:1-22所示的22种微生物基因的引物。
69.本发明的具体操作步骤如下：
70.(1)按照前瞻性临床试验的设计原则，本发明的研究设计如图1所示。该研究方案得到了郑州大学第一附属医院伦理委员会的批准。所有入组的患者签署研究方案知情同意书和临床样本收集知情同意书。
71.(2)每一个入组的癫痫患者和健康人群提供一份新鲜的粪便样本，研究实验人员将样本在70℃灭活1小时，然后按照每份200mg的重量分装成5份，并立即冻存于-80℃冰箱。粪便细菌总dna的抽提方法按照试剂盒的说明书进行。
72.(3)完成粪便细菌总dna样本的扩增和dna文库构建，在illuminamiseq测序平台完成16s rdna测序。所有的输出序列完成基本的预处理和基本的生物信息学分析。
73.(4)从所有样本中随机抽选等量的序列数，按照uparse传递途径拼接成对应的16s rdna基因序列分类单元(operational taxonomy units,otus)。按照微生物基因标志物训练集和微生物基因标志物验证集，将产生的所有样本的otus基因序列收集整理。基于微生物基因序列，使用rdp分类器2.6版本注释。
74.(5)基于高通量测序数据产生的代表性序列，计算出微生物基因标志物发现集的otus频率文件和验证集的otus频率文件。这些otus用于一个相关性研究来鉴定在癫痫患者和健康人群之间差异明显的otus丰度。使用wilcoxon检验方法统计分析癫痫患者和健康人群之间差异的微生物基因标志物。选择出的22个otus微生物基因标志物做进一步的分析。
75.(6)在微生物区别模型的训练集中，包括13例癫痫患者和37例健康对照，使用筛选出的otus丰度文件，在一个随机森林模型(r软件3.4.1和随机森林软件包4.6
–
12)中采用五倍交叉验证的算法(除了设置“importance＝true”之外，软件参数默认)进行微生物基因标志物的筛选。采用五倍交叉验证的5次试验，获得了交叉验证错误曲线，其中最小的交叉验证错误点作为cut-off值使用。最小的交叉验证错误值加上对应值的标准差为cut-off值。筛选出小于cut-off值的错误率的22个以下的otus标志物的集合，选择最小数目otus的集合作为最佳的微生物基因标志物的集合，最终鉴定了用于该模型的最佳的22个微生物基因标志物(图2)。选择出的22个微生物otus标志物的基因序列见seq id no:1-22。
76.(7)通过使用随机生成的决策树的比率来计算患病率(probability of disease,pod)指数。决策树预测样本为“e”，设置的参数预测为：proximity＝t,norm.votes＝t,predict.all＝true。在loo模式中构建的随机森林模型用于预测验证集中每一个样本的
pod指数，最终计算每一个样本的平均预测的pod指数。
77.(8)使用r 3.3.0程序包中的proc工具计算受试者工作曲线(roc)，用来评估微生物区别模型，曲线下面积(auc)用于指定roc的效应值。
78.(9)该微生物区别模型在13例癫痫患者和37例健康对照之间的区别能力达到97.71％(图4)，pod指数在癫痫患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)(图3)。
79.(10)在验证集中，pod指数在11例癫痫患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)(图5)，该微生物区别模型在11例癫痫患者和13例健康对照之间的区别能力达到99.3％(图6)。
80.因此，本发明在癫痫患者和健康对照者中实现了良好的区别能力。
附图说明
81.图1.一种用于区别癫痫和健康人群的肠道微生物模型的研究设计和临床应用。
82.图2.基于随机森林模型采用五倍交叉验证法鉴定的最佳的肠道微生物基因标志物。
83.图3.在13例癫痫患者和37例健康对照的训练集中，患病率(pod)指数在两组之间的表达差异；
84.图4.在13例癫痫患者和37例健康对照的训练集中，微生物基因区别模型实现的区别效能；
85.图5.在验证集中，与13例健康对照人群相比，患病率(pod)指数在11例癫痫患者的表达差异；
86.图6.在验证集中，患病率(pod)指数在13例健康对照和11例癫痫患者之间的区别能力；
具体实施方式
87.下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明的保护内容不仅限于这些实施例。
88.下列实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。下列实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为公开商业途径获得。
89.本发明通过收集入组对象的粪便样本，抽提微生物总dna，进行肠道菌群的16s rdna miseq测序。基于高通量测序数据，在训练集中建立癫痫患者和健康人群的微生物区别模型，建立癫痫患病率(probability of disease，pod)指数；pod指数在验证集中计算其区别能力，进行验证。
90.其操作步骤如下：
91.(1)按照前瞻性临床试验的设计原则，本发明的研究设计如图1所示。该研究方案得到了郑州大学第一附属医院伦理委员会的批准。所有入组的患者签署研究方案知情同意书和临床样本收集知情同意书。
92.(2)每一个入组的癫痫患者和健康人群提供一份新鲜的粪便样本，研究实验人员将样本在70℃灭活1小时，然后按照每份200mg的重量分装成5份，并立即冻存于-80℃冰箱。
粪便细菌总dna的抽提方法按照试剂盒的说明书进行。
93.(3)完成粪便细菌总dna样本的扩增和dna文库构建，在illuminamiseq测序平台完成16s rdna测序。所有的输出序列完成基本的预处理和基本的生物信息学分析。
94.(4)从所有样本中随机抽选等量的序列数，按照uparse传递途径拼接成对应的16s rdna基因序列分类单元(operational taxonomy units,otus)。按照微生物基因标志物训练集和微生物基因标志物验证集，将产生的所有样本的otus基因序列收集整理。基于微生物基因序列，使用rdp分类器2.6版本注释。
95.(5)基于高通量测序数据产生的代表性序列，计算出微生物基因标志物发现集的otus频率文件和验证集的otus频率文件。这些otus用于一个相关性研究来鉴定在癫痫患者和健康人群之间差异明显的otus丰度。使用wilcoxon检验方法统计分析癫痫患者和健康人群之间差异的微生物基因标志物。选择出的otus微生物基因标志物做进一步的分析。
96.(6)在微生物区别模型的训练集中，包括13例癫痫患者和37例健康对照，使用筛选出的otus丰度文件，在一个随机森林模型(r软件3.4.1和随机森林软件包4.6
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12)中采用五倍交叉验证的算法(除了设置“importance＝true”之外，软件参数默认)进行微生物基因标志物的筛选。采用五倍交叉验证的5次试验，获得了交叉验证错误曲线，其中最小的交叉验证错误点作为cut-off值使用。最小的交叉验证错误值加上对应值的标准差为cut-off值。筛选出小于cut-off值的错误率的otus标志物的集合，选择最小数目otus的集合作为最佳的微生物基因标志物的集合，最终鉴定了用于该模型的最佳的22个微生物基因标志物(图2)。选择出的22个微生物otus标志物的基因序列见seq id no:1-22。
97.(7)通过使用随机生成的决策树的比率来计算患病率(probability of disease,pod)指数。决策树预测样本为“e”，设置的参数预测为：proximity＝t,norm.votes＝t,predict.all＝true。在loo模式中构建的随机森林模型用于预测验证集中每一个样本的pod指数，最终计算每一个样本的平均预测的pod指数。
98.(8)使用r 3.3.0程序包中的proc工具计算受试者工作曲线(roc)，用来评估微生物区别模型，曲线下面积(auc)用于指定roc的效应值。
99.(9)该微生物区别模型在13例癫痫患者和37例健康对照之间的区别能力达到97.71％(图4)，pod指数在癫痫患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)(图3)。
100.(10)在验证集中，pod指数在11例癫痫患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)(图5)，该微生物区别模型在11例癫痫患者和13例健康对照之间的区别能力达到99.3％(图6)。