肌萎缩侧索硬化症分子诊断标志物及其应用

本发明涉及疾病诊断预防，更具体地，涉及肌萎缩侧索硬化症分子诊断标志物及其应用。

背景技术：

1、肌萎缩侧索硬化症(als)是一种致命的神经系统疾病，其特征是皮质、延髓和脊髓运动神经元(mns)的逐渐丧失。als通常在发病后3至5年内导致死亡。全世界约有45万人患有als，其中约10％的患者有该疾病的家族史，而其余患者为孢子状。然而，肌萎缩侧索硬化症的潜在机制尚不清楚，也没有诊断试验和有效治疗。强大的生物标志物将有助于提高诊断和预后方法，并提供疾病发病机制的见解。

2、现有报道的关于肌萎缩侧索硬化症诊断标志物依然较少，例如：中国专利公开了一种用于散发性肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病早期诊断的生物标志物及其应用，所述生物标志物为lncrnas。iddo magen等(2021)公开了mir-181是肌萎缩性侧索硬化症的预后生物标志物(hornstein e,magen i,coenen-stass a,et al.circμlating mir-181is aprognostic biomarker for amyotrophic lateral sclerosis[j].natureneuroscience.)；léon beyer等(2020)公开了tdp-43蛋白作为结构生物标记物在肌萎缩侧索硬化诊断中的应用(léon beyer,renégünther,koch j c,et al.tdp as structure-based biomarker in amyotrophic lateral sclerosis[j].annals of clinical andtranslational neurology.)，因此需要提供更多可靠的als生物标志物供临床选择。

3、神经颗粒素(neurogranin，ng)是一种新发现的由78个氨基酸组成的脑特异性蛋白，主要分布于人类或动物的大脑皮层、海马和嗅球等脑区的神经突触后。作为calpacitin蛋白家族中的一员，ng是蛋白激酶c的天然作用底物及钙调蛋白(cam)的储库。在生理状态下，ng与cam结合形成复合体，而在蛋白激酶c或氧化剂的作用下，ng可被磷酸化、氧化及谷胱甘肽化等化学修饰，降低其与cam的亲和力，从而参与对cam及cam2激活的蛋白酶，如cam2依赖性no合酶、cam2依赖性蛋白激酶ii(camkii)及cam2依赖性腺苷酸环化酶的调节。同时，由于cam2依赖性蛋白酶大多参与长时程增强(ltp)和长时程抑制(ltd)的诱导，并且ng的基因表达和蛋白质合成与神经元的突触形成、分化同步，因此，ng可能在学习、记忆、神经系统发育(可塑性)等生理性变化中具有重要作用。此外，一些研究表明，ng还可能参与甲状腺机能减退、睡眠剥夺、衰老及脑低氧预适应等病理生理学变化所造成的神经系统功能的改变。血小板膜糖蛋白(glycoprotein，gp)是胶原、凝血酶、血管性假性血友病因子、纤维蛋白原和二磷酸腺苷等受体的成分，参与血小板黏附、聚集和活化反应，是生理性止血和病理性血栓形成的始动环节。gp1bβ是糖蛋白ibβ亚基，与细胞附着，细胞表面受体连接信号转导等相关。然而目前，关于ng和gp1bβ或其编码基因nrgn和gp1bb在肌萎缩侧索硬化症诊断中的应用，还未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种肌萎缩侧索硬化症分子诊断标志物。

2、本发明的第二个目的在于提供所述分子诊断标志物或检测所述分子诊断标志物的试剂的应用。

3、本发明的第三个目的在于提供一种肌萎缩侧索硬化症诊断的产品。

4、本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

5、本发明提供一种肌萎缩侧索硬化症分子诊断标志物，包括nrgn和/或gp1bb基因或其编码蛋白ng和/或gp1bβ。

6、发明人研究发现als中的外周白细胞可以提供识别潜在生物标志物的线索。通过高通量白细胞深层rna序列和qrt pcr验证，我们确定了als患者和对照组中表达显著不同的基因nrgn和gp1bb。进一步elisa测定als患者和对照组的血浆，证实als患者和对照组的ng和gp1bβ蛋白表达显著不同。ng单独诊断als的准确性曲线下面积达到80.6％，gp1bβ单独诊断als的准确性曲线下面积达到71％，gp1bβ和ng水平的联合应用在识别对照组als患者方面的准确率为87.5％，auc为0.94。通过扩大患者样本量，我们发现血浆ng水平与als进展率显著正相关，尤其是与患者在出现症状的第一个里程碑的进展率显著正相关，ng的表达与als发展进程显著相关，pcc达到0.57(p-value＝3.4×10-6)，尤其ng的表达与早期als的进展率显著相关pcc＝0.45(8.8×10-3)。上述结果表明，血浆中ng、gp1bβ或其结合是als诊断的可靠生物标志物同时血浆中ng水平也与als进展率呈显著正相关，这表明ng在预测患者生存率方面的应用潜能，可用于als疾病进程预测。

7、因此，本技术请求保护nrgn和/或gp1bb基因或其编码蛋白ng和/或gp1bβ，或检测nrgn和/或gp1bb基因或其编码蛋白ng和/或gp1bβ的试剂在以下方面的应用：

8、nrgn和/或gp1bb基因或其编码蛋白ng和/或gp1bβ作为分子诊断标记物在制备肌萎缩性侧索硬化症早期诊断产品中的应用。

9、nrgn基因或其编码蛋白ng作为分子诊断标记物在制备肌萎缩性侧索硬化症疾病进程预测产品中的应用

10、检测nrgn和/或gp1bb基因或其编码蛋白ng和/或gp1bβ的试剂在制备肌萎缩性侧索硬化症早期诊断产品中的应用。

11、检测nrgn基因或其编码蛋白ng的试剂在制备肌萎缩性侧索硬化症疾病进程预测产品中的应用。

12、优选地，所述检测nrgn和/或gp1bb基因的试剂为pcr试剂或southern blot试剂，包括但不限于普通pcr、荧光定量pcr、荧光探针等。

13、优选地，所述检测ng和/或gp1bβ的试剂为酶联免疫分析试剂，优选为酶联免疫吸附试验用试剂。

14、优选地，所述检测ng和/或gp1bβ的试剂为western blot试剂。

15、优选地，所述检测ng和/或gp1bβ的试剂为蛋白芯片检测方法用试剂。

16、本发明还提供一种用于肌萎缩性侧索硬化症早期诊断和疾病进程预测的产品，含有检测nrgn和/或gp1bb基因或其编码蛋白ng和/或gp1bβ的试剂。

17、优选地，所述检测nrgn和/或gp1bb基因或其编码蛋白ng和/或gp1bβ的试剂的是检测人血浆白细胞中的nrgn和/或gp1bb基因或其编码蛋白ng和/或gp1bβ的试剂。

18、进一步优选地，所述检测nrgn和/或gp1bb基因的试剂为pcr试剂或southern blot试剂，包括但不限于普通pcr、荧光定量pcr、荧光探针等。

19、进一步优选地，所述检测ng和/或gp1bβ的试剂为酶联免疫分析试剂，优选为酶联免疫吸附试验用试剂。例如：人ng elisa试剂盒、人gp1bβelisa试剂盒。

20、进一步优选地，所述检测ng和/或gp1bβ的试剂为western blot试剂。

21、进一步优选地，所述检测ng和/或gp1bβ的试剂为蛋白芯片检测方法用试剂。

22、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

23、本发明提供了新的肌萎缩侧索硬化症分子诊断标志物ng和/或gp1bβ，本发明研究表明ng和/或gp1b蛋白在血浆中特异性显著上调表达，ng单独诊断als的准确性曲线下面积达到80.6％，gp1bβ单独诊断als的的准确性曲线下面积达到71％，ng与gp1bβ联合诊断als的准确性曲线下面积达到94％，特异性85％。同时，ng的表达与als发展进程显著相关，pcc达到0.57(p-value＝3.4×10-6)，尤其ng的表达与早期als的进展率显著相关pcc＝0.45(8.8×10-3)，表明ng还可以作为als病程进展速率分子诊断标记物，用于预测患者生存率。本发明可以实现als早期诊断和发展进程预测，能广泛应用于医疗行业als的辅助诊断和治疗。