腈水合酶突变体及其应用

1.本发明属于酶工程和基因工程领域，涉及一种腈水合酶突变体，包含该突变体的基因工程菌及其应用。


背景技术：

2.腈水合酶是一类可以催化腈类物质水合反应转化为酰胺类化合物的金属酶。利用腈水合酶或含腈水合酶的微生物，催化丙烯腈、烟腈水合生产丙烯酰胺和烟酰胺，是工业生物技术替代化学法生产大宗化学品最成功的案例之一。相比于化学法，生物催化法具有反应条件温和、能耗低、操作简单、转化率高、产物浓度高和产物纯度高等优点，目前已成为丙烯酰胺工业生产的主流方法。
3.腈水合酶通常由α和β两个亚基组成(或被称之a和b亚基)，在红球菌属、诺卡氏菌、短杆菌、分枝杆菌和假单胞菌等多种微生物中均有分布。其中，玫瑰色红球菌rhodococcus rhodochrous j1(nagasawa t，et al.applied microbiology and biotechnology，1993,40(2-3)：189-195)、红色红球菌rruber th(ma y，et al.bioresource technology，2010,101(1)：285-291)及其基因工程菌已被成功应用于丙烯酰胺的工业化生产。
4.丙烯腈水合反应过程强烈放热，且后期产物浓度较高，容易导致腈水合酶的快速失活，因此构建高活性、高稳定性的生物催化剂是丙烯酰胺工业生产的重要需求。目前报道的野生型腈水合酶多数都存在催化稳定性较差、催化活性不足等问题。很多研究通过构建盐桥、二硫键、linker或者融合亚基等策略提高了腈水合酶的稳定性(jiao s，et al.applied microbiology and biotechnology，2020,104(3)：1001-1012.)，但同时提高腈水合酶的活性和稳定性的报道较为少见。主要是由于腈水合酶催化机理较为复杂，增加了理性设计和半理性设计的难度，因此关于腈水合酶改造进展较为缓慢。而为了满足工业需求，如何快速高效地获取催化性能提升的新型工业催化剂成为研究的热点和难点。
5.清华大学首次报道了红色红球菌来源的腈水合酶，鉴定了其基因序列和氨基酸序列(专利号：cn200910076710.1)；基于分子模拟结果，对腈水合酶β亚基的141位丝氨酸、143位丝氨酸、144位亮氨酸进行置换，增加盐桥数量，显著提升了腈水合酶的耐热性、丙烯酰胺耐受性和超声耐受性(专利号：cn201110415465.x)；通过在α亚基和β亚基之间引入二硫键，进一步提升了腈水合酶的热稳定性和丙烯酰胺耐受性(专利号：cn201710456875.6)。
6.然而，上述改造的腈水合酶突变体，催化活性仍需提高。针对腈水合酶催化活性的提高进行理性设计改造对于酰胺类化合物的工业生产具有重要意义。


技术实现要素：

7.因此，本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种来腈水合酶突变体。与现有技术相比，本发明的腈水合酶突变体在具有更好的热稳定性和耐受性的同时，还具有更好的活性。本发明还提供了所述腈水合酶突变体的用途，具体地所述腈水合酶突变体催化合成多种具有重要应用价值的酰胺类化合物，包括丙烯酰胺和烟酰胺的用途。
8.本发明的发明构思如下：发明人从野生型腈水合酶出发，通过酶分子的理性设计，构建了腈水合酶突变体库，获得了一系列催化活性提升的突变株，相比母本活性得到显著提升；在此基础上，发明人将有益突变位点引入到稳定性和耐受性提高的改良型腈水合酶中，意外的获得了本发明所述的腈水合酶组合突变体，其能在改良型腈水合酶的基础上，进一步发挥协同调控效应，在具有更好的热稳定性和耐受性的同时，显著地提高了活力。
9.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
10.一方面，本发明提供了一种腈水合酶突变体或其片段，与野生型腈水合酶相比，所述突变体或其片段包含以下的突变：
11.突变i：位于野生型腈水合酶β亚基的起始端的二级结构域α螺旋-1和α螺旋-2之间的结构域上的疏水性氨基酸突变；
12.突变ii：距离活性催化残基-c(s/t)lcsc(t/y)范围内的无规则卷曲结构域上的极性氨基酸突变。
13.根据本发明所述的腈水合酶突变体或其片段，其中所述野生型腈水合酶来源于玫瑰色红球菌、嗜吡啶红球菌、红色红球菌或诺卡氏菌。
14.具体地，所述野生型腈水合酶具有选自以下的序列：
15.野生型红色红球菌(rhodococcus ruber th)的腈水合酶，其β亚基的氨基酸序列如seq id no：1所示，α亚基的氨基酸序列如seq id no：2所示，表达相关的结构基因和调控基因序列详见专利号zl200910076710.1的中国发明专利，通过引用将其全部内容并入本文作为参考。红色红球菌rhodococcus ruber有时也译作赤红球菌。
[0016][0017][0018]
来源于玫瑰色红球菌j1(rhodococcus rhodochrous j1)的腈水合酶，其β亚基在uniprot archive数据库中的upi编号为p21220，α亚基为p21219，通过引用将其全部内容并入本文作为参考。
[0019]
来源于玫瑰色红球菌m8(rhodococcus rhodochrous m8)的腈水合酶，其β亚基的genbank登录号为aat79339.1，α亚基为aat79340.1，通过引用将其全部内容并入本文作为参考。
[0020]
来源于嗜吡啶红球菌(rhodococcus pyridinivorans)的腈水合酶，其β亚基在uniprot archive数据库中的upi编号为q2uzq6，α亚基为q2uzq5，通过引用将其全部内容并入本文作为参考。
[0021]
来源于红球菌属(rhodococcus sp.)的腈水合酶，其β亚基在uniprot archive数
据库中的upi编号为q59785，α亚基为q59786，通过引用将其全部内容并入本文作为参考。
[0022]
来源于诺卡氏菌(nocardia sp.jbrs)的腈水合酶，其β亚基在uniprot archive数据库中的upi编号为q8ge66，α亚基为q8ge67，通过引用将其全部内容并入本文作为参考。
[0023]
根据本发明所述的腈水合酶突变体或其片段，其中，突变i中，所述结构域包含片段1：-g(m/i)sw；优选地，所述突变为其中的甲硫氨酸、异亮氨酸或色氨酸突变；更优选地，所述甲硫氨酸突变为半胱氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸，或
[0024]
所述异亮氨酸突变为半胱氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸；和/或
[0025]
所述色氨酸突变为丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸或组氨酸。
[0026]
根据本发明所述的腈水合酶突变体或其片段，其中，突变ii中，所述结构域包括选自以下的片段中的至少一个：
[0027]
片段2：-(s/t)(s/t)(s/a)(e/d)(i/l/v/m/t)-；
[0028]
片段3：-g(y/f)(a/s/t)(g/s)(e/r)(q/h)(a/g)(h/e)-；
[0029]
片段4：-h(d/g)tggmtgy-；
[0030]
片段5：-k(n/s)mnpl(g/e)htr-。
[0031]
任选地，所述突变选自以下的一种或多种：
[0032]
片段2中，一个或多个苏氨酸突变为丝氨酸和/或一个或多个丝氨酸突变为甘氨酸和/或天冬氨酸或谷氨酸突变为苏氨酸。
[0033]
片段3中，酪氨酸突变为苏氨酸或丝氨酸和/或谷氨酰胺突变为天冬酰胺和/或苏氨酸突变为丝氨酸和/或谷氨酸突变为天冬氨酸；
[0034]
片段4中，天冬氨酸突变为半胱氨酸或缬氨酸和/或苏氨酸突变丙氨酸和/或酪氨酸突变为苏氨酸或丝氨酸；
[0035]
片段5中，一个或多个天冬酰胺突变为丙氨酸和/或苏氨酸突变为丝氨酸和/或精氨酸突变为缬氨酸和/或赖氨酸突变为半胱氨酸；
[0036]
根据本发明所述的腈水合酶突变体或其片段，其中，与野生型腈水合酶相比，所述突变体或其片段进一步包含突变iii和/或突变iv：
[0037]
突变iii：位于野生型腈水合酶β亚基的起始端的二级结构域α螺旋-7和β螺旋-1之间的结构域中的引入盐桥键；同时在位于野生型腈水合酶β亚基的二级结构α螺旋-10和β螺旋-4之间的结构域引入二硫键；
[0038]
优选地，突变iii中，引入盐桥键的结构域包括片段6：-sfslg-；更优选地，所述突变为将其中的丝氨酸突变为赖氨酸和亮氨酸突变为谷氨酸；
[0039]
和/或，
[0040]
所述突变iii中，引入二硫键的结构域包括片段7：-gngkd-，片段8：-vadp-；更优选地，所述突变为将其中的天冬氨酸和脯氨酸突变为半胱氨酸；
[0041]
和/或
[0042]
突变iv：位于野生型腈水合酶β亚基的二级结构β螺旋-2结构域中的极性氨基酸突变；优选地，其包括片段9：-rnkig；更优选地，所述突变iv为将其中的冬酰胺突变为丝氨酸。
[0043]
本发明的第二方面提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码所述腈水
合酶突变体或其片段的核苷酸序列；
[0044]
优选地，所述核苷酸序列为在野生型腈水合酶的序列基础上，通过碱基置换获得。
[0045]
本发明的第三方面提供了一种表达载体，其包含本发明第二方面中所述的分离的核酸分子。本发明选择的表达载体可以在原核或真核细胞的各种宿主中稳定存在并可自主复制，如本领域中的常规质粒(pet系列)、穿梭载体pnv18.1、噬菌体或病毒载体等，优选载体为pet-28a和pnv18.1。
[0046]
在一个具体的实施方案中，通过酶切、连接等分子生物学操作，将野生型腈水合酶的核苷酸序列插入到pet-28a或pnv18.1中，构建得到重组表达质粒，分别命名为pet28a-nh，pnv18.1-nh；将本发明所述的腈水合酶突变体的编码基因，构建到重组表达质粒，分别命名为pet28a-nh
mutant
，pnv18.1-nh
mutant
。
[0047]
本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，其包含本发明第二和三方面中所述的分离的核酸分子或表达载体。所述宿主细胞选自大肠杆菌、红球菌、诺卡氏菌、丙酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌。本发明优选红色红球菌和大肠杆菌。将本发明第二方面所述的分离的核酸分子直接插入宿主菌的染色体，或采用氯化钙法或电穿孔转化法将所述表达载体导入宿主菌。
[0048]
本发明的第五方面提供包含本发明第一方面所述的腈水合酶突变体或其片段的催化剂及其制备方法。所述催化剂包括全细胞催化剂、游离蛋白催化剂及固定化酶催化剂三种形式。全细胞催化剂是指经本发明第四方面构建的宿主细胞经富集培养和目标蛋白的诱导表达后所获的全细胞；游离蛋白催化剂是将全细胞经超声破碎或高压匀浆破碎并通过离心后获得的粗酶液，亦包括通过蛋白纯化手段获得的纯酶。固定化酶催化剂即为选择不同的固定化载体，将游离蛋白催化剂进行固定化操作，从而获得不同形式的固定化腈水合酶突变体。
[0049]
本发明的第六方面提供本发明第一方面中所述的腈水合酶突变体在催化腈类化合物发生水合反应制备酰胺类化合物中的应用，所述腈类化合物包括丙烯腈、烟腈、2-氰基吡嗪、肉桂腈、苯乙腈、对羟基苯乙腈等，所述酰胺类物质包括丙烯酰胺、烟酰胺、吡嗪酰胺、肉桂酰胺、苯乙酰胺和对羟基苯乙酰胺。
[0050]
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优势：
[0051]
发明人的有益突变位点显著提高了腈水合酶活性；将有益突变位点进一步引入到稳定性和耐受性提高的改良型腈水合酶中，意外的获得了本发明所述的腈水合酶组合突变体，其能在改良型腈水合酶的基础上，发挥协同调控效应，在具有更好的热稳定性和耐受性的同时，进一步显著地提高了活力。
附图说明
[0052]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将结合附图详细说明本发明的技术方案：
[0053]
图1示出为本发明的来源于红色红球菌野生型腈水合酶的三维结构模型，其中图1a为野生型腈水合酶的三维晶体结构及其催化活性中心和底物通道；图1b为底物与野生型腈水合酶的分子结合模式。
[0054]
图2示出为本发明的来源于红色红球菌的野生型腈水合酶的二级结构域特征，其
中图2a为野生型腈水合酶α亚基的二级结构域特征，图2b为野生型腈水合酶β亚基的二级结构域特征。
[0055]
图3示出为本发明不同来源的野生型腈水合酶α亚基的二级结构域特征。
[0056]
图4示出为本发明不同来源的野生型腈水合酶β亚基的二级结构域特征。
具体实施方式
[0057]
下面将详细描述本发明的各个方面的特征和示例性实施例。本发明所列举的具体实施例只作为本发明的范例，本发明并不限制于下文所描述的具体实施例。
[0058]
对于本领域技术人员而言，任何对下文所述的实施例进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。
[0059]
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。如无特殊说明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值和数值范围，应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。
[0060]
定义
[0061]
在本文的所有讨论中，使用针对氨基酸的标准单字母代码。也使用标准的取代记法，即qβ45r意指从β亚基起始n端处第45位的q被r置换；或qα42r意指从α亚基起始n端处第42位的q被r置换。
[0062]
对于特定位置处的不同氨基酸通过/符号分隔的本文段落中，/符号意指“或”。举例来说，q87r/k意指q87r或q87k。
[0063]
对于特定位置处的不同氨基酸通过/符号分隔的本文段落中，并用括号包括，其中/符号意指“或”，()符号表明同一位置处的氨基酸。举例来说，(y/f)(a/s/t)意指两个氨基酸残基可以为ya、ys、yt、fa、fs或ft。
[0064]
在不同位置处通过/符号分隔的本文段落中，/符号意指“和”以使得y51/n55是y51和n55。
[0065]
术语“野生型”是指与天然存在的来源分离的基因或基因产物。野生型基因是群体中最常观察到的基因，并且因此被任意设计为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“经修饰的”，“突变体”或“变体”是指与野生型基因或基因产物相比显示序列的修饰(例如，取代、截短或插入)，翻译后修饰和/或功能特性质(例如，改变的特性)的基因或基因产物。注意，天然存在的突变体可以被分离；通过与野生型基因或基因产物相比其具有改变的特性这一事实来鉴定这些突变体。用于引入或取代天然存在的氨基酸的方法在本领域是众所周知的。举例来说，可通过在编码突变单体的多核苷酸中的相关位置处用精氨酸的密码子(cgt)置换甲硫氨酸的密码子(atg)，而用精氨酸(r)来取代甲硫氨酸(m)。用于引入或取代非天然存在的氨基酸的方法在本领域也是众所周知的。
[0066]
野生型腈水合酶
[0067]
腈水合酶(nitrile hydratase，nhase)是一种金属依赖性酶，活性中心含有非血红素铁原子或钴原子，可分为fe-型和co-型两种。目前已知的腈水合酶均有α和β两个亚基(或被称之a和b亚基)以异源多聚体形式存在，活性中心的氨基酸残基较为保守(-c(s/t)lcsc(t/y)-)。本研究选择co-型腈水合酶为研究对象。
[0068]
具体地，发明人选取了来源于玫瑰色红球菌、嗜吡啶红球菌、红色红球菌或诺卡氏菌的多种野生型腈水合酶。
[0069]
腈水合酶突变体
[0070]
在现有的野生型腈水合酶的的基础上，通过结构分析和理性设计，申请人获得了多个有益突变体。并进一步发现这些有益的突变都集中于野生型腈水合酶的特定的二级结构域中。申请人首先解析了来源于红色红球菌的腈水合酶晶体结构(图1a)，通过结构分析确定其活性中心的氨基酸残基，包括(-ctlcscy)，并对二级结构域进行了分析。在结构基础上利用分子对接模拟底物与酶分子的结合状态，并通过分子动力学模拟，研究了底物与酶分子的结合过程，分析底物与酶分子间的相互作用力，确定了影响可能影响酶催化活性的氨基酸位点及其空间结构位置。随后基于底物结合口袋的重塑，增大口袋体积，设计突变体，并进行活力测定，筛选出多个催化性能提升的突变体，结果表明所获得有益突变位点都集中于野生型腈水合酶的特定的二级结构域中。
[0071]
随后以来源于红色红球菌的腈水合酶为模板，通过同源建模获得不同来源的腈水合酶的结构模型，通过结构比对发现这些腈水合酶中特定二级结构域具有很高的保守性，因此本发明同样考察了所获的的有益突变位点在其他来源的腈水合酶的调控作用。这些腈水合酶包括：
[0072]
来源于红色红球菌(rhodococcus ruber th)的腈水合酶，其β亚基的氨基酸序列如seq id no：1所示，α亚基的氨基酸序列如seq id no：2所示，表达相关的结构基因和调控基因序列详见专利号zl200910076710.1的中国发明专利，通过引用将其全部内容并入本文作为参考。
[0073]
来源于玫瑰色红球菌j1(rhodococcus rhodochrous j1)的腈水合酶，其β亚基在uniprot archive数据库中的upi编号为p21220，α亚基为p21219，通过引用将其全部内容并入本文作为参考。
[0074]
来源于玫瑰色红球菌m8(rhodococcus rhodochrous m8)的腈水合酶，其β亚基的genbank登录号为aat79339.1，α亚基为aat79340.1，通过引用将其全部内容并入本文作为参考。
[0075]
来源于嗜吡啶红球菌(rhodococcus pyridinivorans)的腈水合酶，其β亚基在uniprot archive数据库中的upi编号为q2uzq6，α亚基为q2uzq5，通过引用将其全部内容并入本文作为参考。
[0076]
来源于红球菌属(rhodococcus sp.)的腈水合酶，其β亚基在uniprot archive数据库中的upi编号为q59785，α亚基为q59786，通过引用将其全部内容并入本文作为参考。
[0077]
来源于诺卡氏菌(nocardia sp.jbrs)的腈水合酶，其β亚基在uniprot archive数据库中的upi编号为q8ge66，α亚基为q8ge67，通过引用将其全部内容并入本文作为参考。
[0078]
进一步地，发明人还发现，在上述突变的基础上，如果进一步引入盐桥改造、二硫
键，通过组合突变获得了催化性能更为优良的突变体。
[0079]
与野生型腈水合酶相比，本发明的腈水合酶突变体或其片段包含以下的突变：
[0080]
突变i：位于野生型腈水合酶β亚基的起始端的二级结构域α螺旋-1和α螺旋-2之间的结构域上的疏水性氨基酸突变；
[0081]
突变ii：距离活性中心残基-c(s/t)lcsc(t/y)范围内的无规则卷曲结构域上的极性氨基酸突变。
[0082]
根据本发明所述的腈水合酶突变体或其片段，其中，突变i中，所述结构域包含片段1：-g(m/i)sw；优选地，所述突变为其中的甲硫氨酸、异亮氨酸或色氨酸突变；更优选地，所述甲硫氨酸突变为半胱氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸，或
[0083]
所述异亮氨酸突变为半胱氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸；和/或
[0084]
所述色氨酸突变为丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸或组氨酸。
[0085]
根据本发明所述的腈水合酶突变体或其片段，其中，突变ii中，所述结构域包括选自以下的片段中的至少一个：
[0086]
片段2：-(s/t)(s/t)(s/a)(e/d)(i/l/v/m/t)-；
[0087]
片段3：-g(y/f)(a/s/t)(g/s)(e/r)(q/h)(a/g)(h/e)-；
[0088]
片段4：-h(d/g)tggmtgy-；
[0089]
片段5：-k(n/s)mnpl(g/e)htr-。
[0090]
任选地，所述突变选自以下的一种或多种：
[0091]
片段2中，一个或多个苏氨酸突变为丝氨酸和/或一个或多个丝氨酸突变为甘氨酸和/或天冬氨酸或谷氨酸突变为苏氨酸。
[0092]
片段3中，酪氨酸突变为苏氨酸或丝氨酸和/或谷氨酰胺突变为天冬酰胺和/或苏氨酸突变为丝氨酸和/或谷氨酸突变为天冬氨酸；
[0093]
片段4中，天冬氨酸突变为半胱氨酸或缬氨酸和/或苏氨酸突变丙氨酸和/或酪氨酸突变为苏氨酸或丝氨酸；
[0094]
片段5中，一个或多个天冬酰胺突变为丙氨酸和/或苏氨酸突变为丝氨酸和/或精氨酸突变为缬氨酸和/或赖氨酸突变为半胱氨酸；
[0095]
根据本发明所述的腈水合酶突变体或其片段，其中，与野生型腈水合酶相比，所述突变体或其片段进一步包含突变iii和/或突变iv：
[0096]
突变iii：位于野生型腈水合酶β亚基的起始端的二级结构域α螺旋-7和β螺旋-1之间的结构域中的引入盐桥键；同时在位于野生型腈水合酶b亚基的二级结构α螺旋-10和β螺旋-4之间的结构域引入二硫键；
[0097]
优选地，突变iii中，引入盐桥键的结构域包括片段6：-sfslg-；更优选地，所述突变为将其中的丝氨酸突变为赖氨酸和/或亮氨酸突变为谷氨酸；
[0098]
和/或，
[0099]
所述突变iii中，引入二硫键的结构域包括片段7：-gngkd-，片段8：-vadp-；更优选地，所述突变为将其中的天冬氨酸和脯氨酸突变为半胱氨酸；
[0100]
和/或
[0101]
突变iv：位于野生型腈水合酶β亚基的二级结构β螺旋-2结构域中的极性氨基酸突变；优选地，其包括片段9：-rnkig；更优选地，所述突变iv为将其中的冬酰胺突变为丝氨酸。
[0102]
本发明的腈水合酶氨基酸序列中缺失、置换或附加有1个或多个、具体而言1～20个、优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～2个的氨基酸而成的氨基酸序列且具有腈水合酶活性的蛋白质也包括在本发明的腈水合酶中。
[0103]
腈水合酶的催化活性的测定
[0104]
腈水合酶活性是指催化腈化合物水合产生酰胺类化合物的活性。将底物(腈类化合物)与腈水合酶在一定条件下进行反应，在单位时间内测定底物的消耗量和产物的增加量计算腈水合酶的活性。作为底物，只要腈水合酶发生反应，则不论怎样的腈化合物都可以使用，优选丙烯腈和烟腈。反应条件是水合反应的通用条件，只要能够保证腈水合酶具有催化活性即可，底物的消耗量和产物的增加量可通过hplc和gc进行检测和定量分析。
[0105]
腈类化合物的通式如(1)所示：
[0106]
r-cn
ꢀꢀꢀ
(1)
[0107]
此处，r基团为任选被取代的碳原子数1～10的直链状或者支链状的烷基或烯基、任选被取代的碳原子数3～18的环烷基或芳基、或者任选被取代的饱和或不饱和杂环基。
[0108]
酰胺类化合物的通式如(2)所示：
[0109]
r-conh2ꢀꢀꢀ
(2)
[0110]
此处，r基团为任选被取代的碳原子数1～10的直链状或者支链状的烷基或烯基、任选被取代的碳原子数3～18的环烷基或芳基、或者任选被取代的饱和或不饱和杂环基。
[0111]
3.腈水合酶突变体的重组载体、转化体
[0112]
根据宿主细胞的不同，编码腈水合酶突变体的核苷酸序列可以构建到不同类型的重组载体，也可以直接整合到宿主菌的染色体中。作为使用的载体，可列举出质粒dna、噬菌体dna、反转录转座子dna、人工染色体dna等。以大肠杆菌和红色红球菌为例，优选pet系列载体和pnv系列载体。
[0113]
本发明的转化体能使用的宿主只要能够在导入上述重组载体或编码腈水合酶突变体的核苷酸序列后表达目标腈水合酶，就没有特别限定，例如可以使用红球菌、大肠杆菌等细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。
[0114]
作为向细菌导入重组载体的方法，只要是向细菌中导入dna的方法，就没有特别的限定。例如可列举出使用钙离子的方法、电穿孔法等。
[0115]
作为向细菌中整合编码腈水合酶突变体的核苷酸序列的方法，只要是向细菌中导入dna的方法，就没有特别的限定。例如可列举出使用同源重组、基因编辑法等。
[0116]
实施例
[0117]
实施例1腈水合酶突变体的序列
[0118]
在红色红球菌来源的野生型腈水合酶的基础上，发明人设计了如下突变体，其中，所述红色红球菌来源的野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如seq id no：1所示，α亚基的氨基酸序列如seq id no：2所示，所述突变体详见表1：
[0119]
表1
[0120][0121]
[0122]
[0123][0124]
突变体1：在野生型腈水合酶的基础上，具有片段1中mβ45c(1)，表示片段1中的甲硫氨酸突变为半胱氨酸。
[0125]
实施例2腈水合酶重组表达载佳的构建
[0126]
发明人将编码腈水合酶的核苷酸序列两端设计bamh i和ecor i酶切位点，以质粒pet-28a为载体，使用内切酶bamh i和ecor i对该质粒和本实施例中腈水合酶的核苷酸序列进行双酶切，利用核酸电泳(1.0％琼脂糖)和试剂盒回收酶切后的基因片段，然后将酶切后的目的基因片段连接到酶切后的质粒载体中。
[0127]
20μl连接体系包括：
[0128]
2μl 10
×
t4 dna连接酶buffer(takara公司)；
[0129]
5μl目的基因片段；
[0130]
5μl质粒片段；
[0131]
2μl t4 dna连接酶；
[0132]
8μl ddh2o；
[0133]
在16μ连接过夜，转化至dh5α感受态细胞内，挑取单克隆子测序验证，提取测序正确的重组质粒，获得包含腈水合酶编码基因的重组表达载体，并以此作为母本进行后续改造。
[0134]
实施例3腈水合酶突变体的构建
[0135]
本发明采用全质粒pcr的方法构建含有腈水合酶突变基因的重组质粒，首先设计含有突变位点的上下游引物，以质粒pet28a-nh为模板，使用primestar hs dna polymerase(takara公司)进行全质粒扩增。通过pcr扩增出含有编码腈水合酶基因序列发生突变的重组质粒。
[0136]
20μl的pcr反应体系包括：
[0137]
1μl pet28a-nh质粒模板(约100ng/μl)；
[0138]
10μl 2
×
primestar hs dna聚合酶；
[0139]
1.5μl正向引物(10μm)；
[0140]
1.5μl反向引物(10μm)；
[0141]
6μl ddh2o。
[0142]
所述正向引物为针对不同突变体构建过程中所使用的特定引物。所述反向引物为针对不同突变体构建过程中所使用的特定引物。该处限于篇幅不一一赘述，但是本领域技术人员应该知晓，在已知序列的基础上设计引物并获得目的产物是本领域技术人员的常规技术手段。
[0143]
pcr反应的条件如下：
[0144]
(1)98℃预变性1min；
[0145]
(2)98℃变性30s；
[0146]
(3)引物的tm-5℃退火10s；
[0147]
(4)72℃延伸7min；
[0148]
上述步骤(2)-(4)共进行30个循环，最后72℃延伸10min。
[0149]
pcr原液经dpni酶消化去除模板序列后，利用热激法转化到ecoli top 10感受态细胞中，并涂布于含有卡那霉素(50μg/ml)的lb平板中，置于37℃培养箱中倒置培养约12h。挑取单克隆子进行测序验证，测序正确后用20％(v/v)的甘油进行保菌，置于-70进冰箱内保存。
[0150]
实施例4腈水合酶组合突变体的构建
[0151]
腈水合酶组合突变体是通过多轮定点突变的方式获得的，在获取单个点突变体后，以含有该突变位点的重组质粒为模板，设计突变位点的上下游引物，进行全质粒pcr扩增，通过pcr扩增出含有编码腈水合酶组合突变体基因序列的重组质粒。
[0152]
20μl的pcr反应体系包括：
[0153]
1μl母本/含有单个突变位点质粒模板(约100ng/μl)；
[0154]
10μl 2
×
primestar hs dna polymerase；
[0155]
1.5μl正向引物(10μm)；
[0156]
1.5μl反向引物(10μm)；
[0157]
6μl ddh2o。
[0158]
所述正向引物可以使用针对不同突变体构建过的特定引物，该处限于篇幅不一一赘述，但是本领域技术人员应该知晓，在已知序列的基础上设计引物并获得目的产物是本领域技术人员的常规技术手段。
[0159]
pcr反应的条件如下：
[0160]
(1)98℃预变性1min；
[0161]
(2)98℃变性30s；
[0162]
(3)(引物的tm-5)℃退火10s；
[0163]
(4)72℃延伸7min；
[0164]
上述步骤(2)-(4)共进行30个循环，最后72℃延伸10min。
[0165]
pcr原液经dpni酶消化去除模板序列后，利用热激法转化到ecoli top 10感受态细胞中，并涂布于含有卡那霉素(50μg/ml)的lb平板中，置于37℃培养箱中倒置培养约12h。挑取单克隆子进行测序验证，测序正确后用20％(v/v)的甘油进行保菌，置于-70进冰箱内保存。
[0166]
实施例5腈水合酶及其突变体的大肠杆菌基因工程菌构建及催化剂的制备
[0167]
将实施例3和4中制备的重组表达载体利用热激法转化至感受态细胞e.coli bl21(de3)中，涂布含卡那霉素(50μg/ml)的lb平板，37℃，培养过夜后，挑取单菌落转接含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养中，37℃培养12h，送样进行测序，将正确的克隆子保存到-70℃冰箱，以此获得大肠杆菌为宿主的基因工程菌。
[0168]
将包含腈水合酶及其突变体的编码序列的基因工程菌接种到含有卡那霉素抗性的lb液体培养基(蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为去离子水，ph＝7.0)中，在含有lb培养基的试管(4ml，含终浓度50μg/ml卡那霉素)中，置于37℃摇床内，200rpm转速下培养10～12h，得到种子液。
[0169]
在超净工作台中将试管内的种子液转接到含有lb培养基的摇瓶(100ml，含终浓度50μg/ml卡那霉素)中。将含有种子液的lb培养基置于37℃摇床内，200rpm转速下培养2～3h。待培养液的od
600
值达到0.6～0.8时，添加终浓度为0.1～0.8mm的iptg和0.1-0.8mm co
2+
离子进行诱导表达，诱导温度为16～37℃。优选的iptg浓度为0.2mm，优选钴离子浓度为0.2mm，优选的诱导温度为16℃。在优选条件下诱导24h后，离心收集细胞，获得腈水合酶的大肠杆菌细胞催化剂，置于-70℃冰箱内保存。
[0170]
称取10g冻存湿细胞，加入到100ml的缓冲液a(25mm tris-hcl，ph 8.0；300mm nacl，10mm咪唑，375μl/l巯基乙醇)中，终浓度为10g/l，放置在室温融解，过滤去除未完全溶解的块状菌体。然后使用高压匀浆机进行破碎，压力控制在700-800bar，破碎过程中利用低温循环设备进行降温，循环破碎2-3次即可。将收集到的破碎液离心，收集上清液，获得游离的腈水合酶催化剂。
[0171]
称取适量固定化氨基树脂材料，用磷酸钾缓冲液(100mm，ph 7.0)平衡，将处理好的树载体加入到缓冲液中，载体与溶液的比例为1/5(w/v)，然后加入戊二醛溶液(50％v/v)至终浓度为2％。在振荡器中(16℃，200rpm)活化2-3h后，使用去离子水清洗活化后的载体，去除残余的戊二醛。称取适量活化后的固定化载体置于缓冲液中，加入酶溶液，载体和酶溶液的比例仍为1/5(w/v)。将其置于恒温摇床或振荡器中(16℃，200rpm)进行固定化，时间为8h。然后用缓冲液清洗固定化酶以除去残余的酶液，然后将其置于4℃冰箱内保存备用。
[0172]
实施例6腈水合酶突变体的红球菌体系构建及催化剂的制备
[0173]
分别以实施例3和4中制备的重组表达载体为模板，设计腈水合酶的通用引物，该通用引物序列中包含优化版的自杀质粒pysacb的同源片段和腈水合酶基因片段，通过pcr扩增出含有突变位点的腈水合酶基因序列。该优化版的自杀质粒pysacb1是在自杀质粒
pysacb的基础上添加了腈水合酶基因上下游两端的各1000bp左右的同源臂序列。
[0174]
同源重组双交换实验流程
[0175]
1)以甲基化酶缺陷型大肠杆菌e.coli trans110为宿主，构建并提取自杀质粒ps18mobsacbopt-amie，转化r.ruber th，复苏培养后涂布于含50μg/ml壮观霉素的平板培养基上，28℃培养3天长出菌落。
[0176]
2)挑取单菌落，菌落pcr验证(一个引物在基因组上，位于上游同源臂的上游；一个引物在质粒上，位于下游同源臂的下游)，确保自杀质粒整合到正确位置。
[0177]
3)单交换成功的菌落，接种到不含抗生素的种子培养基中，28℃、200rpm培养1天，稀释10～100倍，取200μl涂布于含100g/l蔗糖的平板上，28℃培养2～3天长出菌落。
[0178]
4)挑取单菌落，进行菌落pcr(引物在基因组上，一个位于上游同源臂的上方，一个位于下游同源臂的下方)，验证是否发生基因敲除或者回复突变。
[0179]
pcr反应的条件如下：
[0180]
(1)98℃预变性1min；
[0181]
(2)98℃变性30s；
[0182]
(3)(引物的tm-5)℃退火10s；
[0183]
(4)72℃延伸2min；
[0184]
上述步骤(2)-(4)共进行30个循环，最后72℃延伸10min。
[0185]
通过gibson assembly无缝克隆试剂盒，将获得的腈水合酶突变基因与酶切后的自杀质粒pysacb进行连接，
[0186]
10μl的连接体系包括：
[0187]
2μl目标基因；
[0188]
3μl自杀质粒载体；
[0189]
5μl连接试剂；
[0190]
50℃下连接30min，将连接液转换至top 10感受态细胞内，挑起单克隆测序验证后，提取重组自杀质粒，将构建成功的重组自杀质粒利用电转化法，转化至红球菌r.ruber th9的感受态细胞内，复苏培养后涂布于含50μg/ml壮观霉素的平板培养基上，20-37℃下培养；然后挑取单菌落，菌落pcr验证，验证自杀质粒整合到红球菌基因组中的正确位置；将单交换成功的菌落，接种到不含抗生素的种子培养基中，20-37℃下培养12h，稀释100倍，取200μl涂布于含100g/l蔗糖的平板上，28℃培养，待长出单菌落后，进行菌落pcr，验证腈水合酶基因序列整合到基因组上，并送测序公司，将测序正确的菌株置于-70℃冰箱保存备用。
[0191]
pcr反应的条件如下：
[0192]
(1)98℃预变性1min；
[0193]
(2)98℃变性30s；
[0194]
(3)(引物的tm-5)℃退火10s；
[0195]
(4)72℃延伸3min；
[0196]
上述步骤(2)-(4)共进行30个循环，最后72℃延伸10min。
[0197]
将上述构建的包含腈水合酶突变体的编码序列的红球菌接种到种子培养基中，培养至菌体od
600
达到30左右。此时按初始od
600
＝3.0的接种量将种子培养基接入50ml发酵培
养基中，对于腈水合酶的诱导表达，需向发酵培养基中加入终浓度为0.08mm c0
2+
，诱导表达48h后，离心收集细胞，获得腈水合酶红球菌细胞催化剂。
[0198]
称取10g冻存湿细胞，加入到100ml的缓冲液a(25mm tris-hcl，ph 8.0；300mm nacl，10mm咪唑，375μl/l巯基乙醇)中，终浓度为10g/l，放置在室温融解，过滤去除未完全溶解的块状菌体。然后使用高压匀浆机进行破碎，压力控制在1200-1500bar，破碎过程中利用低温循环设备进行降温，循环破碎2-3次即可。将收集到的破碎液离心，收集上清液，获得游离的腈水合酶催化剂。
[0199]
称取适量固定化载体，用磷酸钾缓冲液(100mm，ph 7.0)平衡，将处理好的树载体加入到缓冲液中，载体与溶液的比例为1/5(w/v)，然后加入戊二醛溶液(50％)至终浓度为2％v/v。在振荡器中(16℃，200rpm)活化2-3h后，使用去离子水清洗活化后的载体，去除残余的戊二醛。称取适量活化后的固定化载体置于缓冲液中，加入酶溶液，载体和酶溶液的比例仍为1/5(w/v)。将其置于恒温摇床或振荡器中(16℃，200rpm)进行固定化，时间为8h。然后用缓冲液清洗固定化酶以除去残余的酶液，然后将其置于4℃冰箱内保存备用。
[0200]
实施例7腈水合酶活力测定方法
[0201]
腈水合酶对底物丙烯腈活性测定方法如下：取50～100μl催化剂(细胞、游离酶、固定化酶)加入离心管中，加入10mmpbs(ph＝7.0)补足至4.5ml，在28℃水浴锅中放置10分钟使温度稳定。加入200μl丙烯腈，混匀后反应5分钟，加入200μl的3mol/l盐酸终止反应。取1ml反应液13000
×
g离心2分钟后，取500μl上清液与500μl的内标溶液(40g/l乙酰胺)混匀后，进行气相色谱分析。测定丙烯酰胺与乙酰胺的面积比，利用内标法测定产物丙烯酰胺的浓度，计算活力。
[0202]
通过气相检测产物的生成量，检测条件为：气相色谱分析条件如下：美国赛默飞trace 1300气相色谱仪；abel bondedab-i nowax色谱柱(内径0.25mm，长度30m，膜厚0.25μm)；fid检测器。柱温、进样口温度、检测器温度分别19℃、26℃、26℃；载气为氮气，恒压模式，分压10
8 kpa；进样体积为1μl，分流进样，分流比为50∶1。
[0203]
所述腈水合酶的活力计算方式如下：
[0204][0205]
k为内标常数，其数值为0.6001；c
ac
为乙酰胺浓度40g/l；v总为总体积，其数值为5ml；v为实际加入的催化剂体积；t为反应时间；mw为丙烯酰胺，分子量71；u为总酶活，单位为μmol丙烯酰胺/(min
·
ml菌液)。
[0206]
所述酶活力(u)定义为：在上述反应条件下，每分钟催化1μmol底物所需要的酶量为一个酶活单位，用u表示。
[0207]
实施例8腈水合酶热稳定性和耐受性评价
[0208]
将实施例5和6中获得的腈水合酶催化剂，用10mm pbs缓冲液进行重悬(ph＝7.0，10g/l)，在50℃恒温水浴中静止放置，每间隔15分钟取出样品，按照实施例7中的方法测定残余活力，并绘制出失活曲线，根据线性拟合出催化剂的半衰期，半衰期值越高说明稳定性越好，以此衡量腈水合酶的热稳定性。
[0209]
同样，将实施例5和6中获得的腈水合酶催化剂，用10mm pbs缓冲液进行重悬(ph＝7.0，10g/l)，各取10ml重悬的催化剂分别放置于50ml三角瓶中，添加丙烯酰胺至终浓度为
40％(v/v)，在30℃恒温水浴中静止放置1h后测定残余活力，并根据初始活力，计算活力相对值，当活力相对值越高说明耐受性越好，以此衡量腈水合酶的产物耐受性。
[0210]
实施例9腈水合酶实变体的活力测定结果
[0211]
如实施例3和4中所构建的突变体，按照实施例7的方法进行活力测定，结果见表2，在腈水合酶(nh)中引入所设计突变位点后，突变体1-6、8-12、15-19、21-27、29-31、33-36、38-40和突变体61的催化活力提高倍数为1.0-2.0倍；突变体7、13、14、20、28、32、37、41、42-44、49、59、61、64和突变体66的催化活力提高倍数为2.0-4.0倍；突变体45-48、52-58、63和突变体69的催化活力提高倍数为3.0-6.0倍；突变体50、51、60、65、67、68、70-73、75、79-82的催化活力提高倍数为6.0-8.0倍，突变体74、76-78的催化活力提高倍数为8.0-10.0倍。通过结构对比和底物结合口袋分析，有益突变体的口袋体积增大和极性环境的改变，有利于底物与酶的结合，是其催化活力提升的主要原因。
[0212]
表2
[0213]
archive数据库中的upi编号为q8ge66，α亚基为q8ge67。
[0225]
获得的突变腈水合酶的催化活性和稳定性都同时得到了提高，说明这些突变位点对于不同来源的腈水合酶活力均具有协同调控效应。
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230]
[0231]
[0232]