一种具有在低温条件下降解石油功能的菌群及其应用的制作方法

1.本发明属于石油及石油产品污染环境的生物修复技术领域，具体涉及一种具有在低温条件下降解石油污染物功能的菌群及其应用。


背景技术：

2.近年来，随着人类对石油资源的开采和运输，溢油事故频繁发生，造成了严重的生态环境破坏和经济损失。因此，寻找一种友好且低成本的溢油清除策略是当前环境治理急需解决的问题。从20世纪80年代开始，人类就开始使用各种方法来治理石油污染。
3.目前国际上处理石油污染的方法主要可以分为物理法、化学法和生物法三种方法。其中物理法和化学法在实际应用中往往只有溢油初期能发挥比较好的除油作用，但是成本高，容易造成二次污染，而生物法与其他方法相比，具有清洁、高效、低廉的优点，故而被认为是最有潜力的石油污染修复手段。
4.据统计，自然界中可降解石油的微生物有100多个属，超过200种，分别属于细菌、霉菌、放线菌等，主要包括红球菌属(rhodococcus)、假单胞菌属(pseudomonas)、乳球菌属(lactococcus)和拉恩氏菌属(rahnella)等。分离筛选出具有高效石油降解能力的菌株，是开展石油污染微生物修复的前提。
5.研究发现微生物的石油降解效率受到温度的影响。李英利等研究了常温、40、50、60℃对微生物降解石油的影响，发现在40℃时微生物对石油降解效率最高；龚汉意等从含油泥浆中筛选出一株优势石油降解菌bacillus sp.sw-1，研究其在25～40℃下温度对菌株降解石油的影响，发现在30℃下菌株达到最大降解率；田秀梅等从天津大港油田废弃钻井附近的油污染土壤筛选出一株原油降解菌acinetobacter sp.yqj-1，研究了在20～40℃下菌株的石油降解效率，发现在35℃时原油降解效率最高。以上研究都表明石油降解菌在中高温环境下才能发挥较高的降解效果，但在实际应用中，微生物修复石油污染的过程往往需要经过漫长的中低温期，特别是处于中高纬度的寒带地区的石油修复过程。低温条件下，微生物的代谢会受到抑制，对高分子量烷烃和芳烃的降解效率降低，而高分子量组分相对浓度增高，也会对微生物产生较强的毒性作用，从而降低了石油污染物微生物修复的效果。所以如何获得低温高效石油降解菌资源，是石油污染生物修复技术应用的关键。
6.有研究表明，与单一的纯培养菌株相比，多菌株共培养获得的微生物菌群对石油污染物具有更好的降解效率，一方面，是由于物种之间的高度互补性驱动了功能之间产生积极作用，即群落中的微生物依赖于其他微生物的活动来生长、适应和繁殖。另一方面，菌群中多种细菌包含了更多的代谢途径以及更广的酶种类，从而扩增了碳氢化合物降解的代谢范围，这种协同降解作用提高了石油降解率。因此，菌群比单个菌株具有更高效的石油降解潜力，近年来研究人员将石油污染生物修复研究的重点放在了石油降解菌群的构建上，以解决单株细菌降解率低的问题。
7.南极地区夏季平均温度为0℃，内陆以及冬季平均温度为-30℃。尽管南极的环境条件恶劣，但是南极拥有非常丰富的微生物资源，并具有独特的适应低温的代谢机制。近些
年，人类活动对南极地区造成了一定的石油污染，这不仅改变了土壤的微生物生存环境，也为从中筛选低温石油降解微生物，并应用于生物修复提供了新的思路。


技术实现要素：

8.本发明提供一种具有在低温条件下降解石油功能的菌群及其应用，所提供的菌群中包含有两株低温石油降解菌，具有在低温条件下(不高于10℃)高效降解大分子量油污的特点；可用于高纬度地区的石油污染环境(包括土壤、沉积物、水体)的生物修复。
9.本发明首先提供一种具有在低温条件下降解石油污染物功能的菌群，所述的菌群中包含有樊庆笙氏红球菌(rhodococcus qingshengii)nj-xfw-6-a和乳酸乳球菌乳亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)nj-ccz-10-a；
10.所述的樊庆笙氏红球菌(rhodococcus qingshengii)nj-xfw-6-a，其于2021年09月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.23403；
11.所述的乳酸乳球菌乳亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)nj-ccz-10-a，其于2021年09月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.23406；
12.本发明还提供所述的菌群的一种用途，是在对石油污染环境进行治理中的应用；
13.所述的石油污染环境，包括石油污染的土壤、沉积物或水体。
14.本发明再一个方面提供一种治理石油污染的方法，是使用上述的菌群进行治理。
15.本发明所提供的菌群可以在低温条件下对石油污染物进行高效降解，其降解率比自然风化降解极显著的提高；相对与其组成中的单一细菌，石油降解率也有显著性的提高。特别是对于毒性大、难降解的高分子量烷烃和多环芳烃，具有更高的降解效果。
附图说明
16.图1：樊庆笙氏红球菌的培养照片图；
17.图2：乳酸乳球菌乳亚种nj-ccz-10-a培养照片图；
18.图3：重量法测定菌株的石油降解率图；
19.图4：石油降解菌对烷烃的降解率图；
20.图5：降解后剩余石油中烷烃的含量图，其中nc：自然风化，nc09～nc35代表不同碳链长度的正构烷烃，pr：姥姣烷，py：植烷；
21.图6：石油降解菌对多环芳烃的降解率图；
22.图7：降解后剩余石油中多环芳烃的含量图，其中nc：自然风化；nap、flu、phe、dbt、chr分别指萘、芴、菲、二苯并噻吩、屈；c1-c4表示在相应碳原子上修饰的烷基。
具体实施方式
23.本发明在中国南极科考中获得南极菲尔德斯半岛受石油污染的土壤样品分离出低温石油降解菌株，并构建降解菌群提高石油降解率，以期用于高纬度寒冷地区的石油污染环境的生物修复。
24.本发明所使用的培养基的具体组分记载如下：
cagagtttgatcctggct-3'和1540r：5'-aggaggtgatccagccgca-3'，或者27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'和1492r：5'-tacggctaccttgttacgactt-3'。pcr体系(50l)：提取物2l，正反向引物各1l，dntp 4l，dna聚合酶1l，buffer 5l，ddh2o 36l。pcr条件：98℃预变性3min，98℃10s，55℃15s，72℃20s，35个循环，72℃延伸5min。扩增后的产物经凝胶电泳后送至青岛擎科生物进行测序。随后，将测序得到的16s rrna基因序列用ezbiocloud中的16s-basedid工具进行比对。进行比对去重后，使用mega 7.0软件进行多重序列比对，选择邻位相接法(neighbour-joining method，nj)构建系统发育树，并通过自举分析进行置信度检测，自举数选择1000，与已知菌株相似度达98％以上的，确定为同种水平。
43.确定的高效石油降解菌nj-xfw-6-a的16s rrna基因的序列信息如下：
44.ggtgcatcattctacgcttcgtccaatcgccgatcccaccttcgacggctccctcccacaaggggttaagccaccggcttcgggtgttaccgactttcatgacgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcagcgttgctgatctgcgattactagcgactccgacttcacggggtcgagttgcagaccccgatccgaactgagaccagctttaagggattcgctccacctcacggtctcgcagccctctgtactggccattgtagcatgtgtgaagccctggacataaggggcatgatgacttgacgtcgtccccaccttcctccgagttgaccccggcagtctcttacgagtccccaccataacgtgctggcaacataagataggggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcaccacctgtataccgaccacaaggggggccacatctctgcagctttccggtatatgtcaaacccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaatccacatgctccgccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcggggcgcttaatgcgttagctacggcacggattccgtggaaggaacccacacctagcgcccaccgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccacgctttcgttcctcagcgtcagttactgcccagagacccgccttcgccaccggtgttcctcctgatatctgcgcatttcaccgctacaccaggaattccagtctcccctgcagtactcaagtctgcccgtatcgcctgcaagccagcagttgagctgctggttttcacaaacgacgcgacaaaccgcctacgaactctttacgcccagtaattccggacaacgcttgcaccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggtgcttcttctgcaggtaccgtcacttgcgcttcgtccctgctgaaagaggtttacaacccgaaggccgtcatccctcacgcggcgtcgctgcatcaggctttcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccggtcaccctctcaggtcggctacccgtcgtcgccttggtaggccattaccccaccaacaagctgataggccgcgggcccatcctgcaccgataaatctttccaccacccaccatgcgataggaggtcatatccggtattagacccagtttcccaggcttatcccgaagtgcagggcagatcacccacgtgttactcacccgttcgccgctcgtgtaccccgaaaggccttaccgctcgactgcatagtagacagcatctcaccttggt(seq id no:1)
45.通过比较，确定nj-xfw-6-a与rhodococcus属的菌株相似性最高，最终命名为樊庆笙氏红球菌(rhodococcus qingshengii)nj-xfw-6-a株。
46.确定的高效石油降解菌nj-ccz-10-a的16s rrna基因的序列信息如下：
47.attgaatttagcggccgcgaattggcccttagagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagttgagcgctgaaggttggtacttgtaccgactggatgagcagcgaacgggtgagtaacgcgtggggaatctgcctttgagcgggggacaacatttggaaacgaatgctaataccgcataaaaactttaaacacaagttttaagtttgaaagatgcaattgcatcactcaaagatgatcccgcgttgtattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgatgatacatagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtaggaaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaaactctgttggtagagaagaacgttggtgagagtggaaagctcatcaagtgacggtaactaccc
agaaagggacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtcccgagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggtggtttattaagtctggtgtaaaaggcagtggctcaaccattgtatgcattggaaactggtagacttgagtgcaggagaggagagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaggaacaccggtggcgaaagcggctctctggcctgtaactgacactgaggctcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctagatgtagggagctataagttctctgtatcgcagctaacgcaataagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactcgtgctattcctagagataggaagttccttcgggacacgggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctattgttggttgccatcattaagttgggcactctaacgagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagtcgcgagacagtgatgtttagctaatctcttaaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgggagttgggagtacccgaagtaggttgcctaaccgcaaggagggcgcttcctaaggtaagaccgatgactggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtaaagggccaattcgtttaaacctgcaggactagtccctttagtg(seq id no:2)；
48.通过比较，确定nj-ccz-10-a与lactococcus属的菌株相似性最高，最终命名为乳酸乳球菌乳亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)nj-ccz-10-a株。
49.樊庆笙氏红球菌(rhodococcus qingshengii)nj-xfw-6-a，其于2021年09月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.23403；
50.乳酸乳球菌乳亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)nj-ccz-10-a，其于2021年09月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.23406。
51.实施例2：单菌株和菌群降解石油效果的检测
52.将菌株nj-xfw-6-a和nj-ccz-10-a在液体培养基中培养至对数生长期(od
600
＝0.8)后，分别按3％的接种量接种到100ml的石油培养基中，其中各单菌组nj-xfw-6-a和nj-ccz-10-a分别接种单菌3ml；菌群组nj-xfw-6-a+nj-ccz-10-a按菌株nj-xfw-6-a：nj-ccz-10-a的接种比例为1～9:9～1混合，接种总量为3ml；空白对照(自然风化)选择未添加菌液的石油培养基，每组设置三个平行。
53.1、重量法计算石油降解率
54.将以上单菌和菌群实验组在10℃、150rpm下培养28天，用50ml二氯甲烷溶液萃取经过28天降解后的总残余油污。从二氯甲烷相吸取20ml萃取液于玻璃平皿中，常温挥发并称重，通过以下公式计算石油降解能力。
[0055][0056]
式(1)中，m0为最初加入培养基中石油的重量，m为萃取后残余油污重量，2.5为50ml萃取液中取20ml的比例。
[0057]
2、总烷烃和总芳烃的降解率
[0058]
为检测单菌和菌群对石油中正构烷烃的降解特性，采用gc-ms分析上述的萃取液。
使用氘代正二十四烷溶液作为正构烷烃定量用内标，浓度为100μg/ml，氘代三联苯溶液作为多环芳烃定量用内标，浓度为10μg/ml。样品用6890a气相色谱仪(安捷伦)和hp-5ms毛细血管柱(30m
×
250μm内径，0.22μm厚度)分离毛细管柱与配有四级轴检测器的5973质谱仪相连。具体参数如下：
[0059]
气相色谱条件：色谱柱hp-5ms(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)；进样口温度为260℃，载气为高纯he(纯度99.999％)，流速为1.0ml
·
min-1，恒流模式，不分流进样1μl。柱温箱采用升温程序：起始50℃，保持5min，以6℃
·
min-1升温到300℃，维持20min。
[0060]
质谱条件:接口温度280℃，电子轰击(ei)离子源，电子能量70ev，离子源230℃，四级杆150℃，溶剂延迟3min。采用选择离子扫描模式(sim)进行烷烃和多环芳烃的分析，特征离子质量碎片(m/z)为85。
[0061]
石油总正构烷烃降解率和总多环芳烃降解率计算公式见式(2)～(3)。
[0062][0063][0064]
式中,d
alkane
、d
pah
分别为石油总正构烷烃和总多环芳烃的降解率，(c
alkane
)
control
和(c
pah
)
control
分别为空白组石油中剩余正构烷烃和多环芳烃浓度，(c
alkane
)
sample
和(c
pah
)
sample
分别为实验组石油中剩余正构烷烃和多环芳烃浓度。
[0065]
3、实验结果
[0066]
3.1利用重量法评价低温石油降解菌降解效果
[0067]
石油降解效果如图3所示，在10℃条件下，降解28天后，相较于空白组(自然风化)，单菌nj-xfw-6-a和nj-ccz-10-a石油降解率分别为44％与36.6％，而菌群nj-xfw-6-a+nj-ccz-10-a的石油降解率为64.4％，而空白对照仅10％左右，可以看到两株单菌组合成菌群后，降解率提高了近一倍。由于本发明所使用的石油为中质原油，其油品中的重组分要高于轻质原油，且更接近于风化原油。所以低温条件(10℃)下，四周时间菌群的石油降解率比空白对照提高了54.4％，相对于已报道的研究结果来看，降解能力有了极大提高。
[0068]
3.2利用gc-ms法评价低温石油降解菌降解特性
[0069]
3.2.1石油降解菌降解烷烃的特性
[0070]
将重量法得到的萃取液进行gc-ms分析，统计所有的正构烷烃的含量，计算降解率，结果如图4所示，单菌nj-xfw-6-a和nj-ccz-10-a总正构烷烃降解率分别为72％与76.38％，而菌群nj-xfw-6-a+nj-ccz-10-a的总正构烷烃降解率达到92.62％，几乎能全部降解正构烷烃。
[0071]
分析主要正构烷烃(nc09～35，09～35数字表示c的个数)的降解情况，结果如图5所示，除nc09、nc14、姥姣烷(pr)、植烷(py)、nc19外，从nc10-nc28，单菌nj-xfw-6-a对单个烷烃的降解率在31％-90％之间，单菌nj-ccz-10-a对单个烷烃的降解率在60％-89％之间，菌群nj-xfw-6-a+nj-ccz-10-a对单个烷烃的降解率均在90％以上。而随着c数的增加，单菌、菌群的单个烷烃降解率逐渐减少，对于高分子量烷烃nc29-nc35，单菌nj-xfw-6-a的降解率在10％～24％之间，单菌nj-ccz-10-a的降解率在23％～53％之间，菌群nj-xfw-6-a+
nj-ccz-10-a的降解率则高达42％～82％之间。除此之外，菌群对姥姣烷(pr)、植烷(py)这两类难降解生物标志物的降解率分别为27.17％和32.71％，而单菌对这两种物质基本无降解效果。
[0072]
3.2.2石油降解菌降解多环芳烃的特性
[0073]
将重量法得到的萃取液进行gc-ms分析，统计所有的多环芳烃含量，计算降解率，结果如图6所示，单菌nj-xfw-6-a和nj-ccz-10-a总多环芳烃降解率分别为27.72％与27.40％，而菌群nj-xfw-6-a+nj-ccz-10-a的总多环芳烃的降解率为47.56％。
[0074]
从单个多环芳烃的含量来看(图7)，菌群nj-xfw-6-a+nj-ccz-10-a对萘系、芴系、菲系、二苯并噻吩系和屈系的降解率在45％-57％之间，单菌nj-xfw-6-a对萘系、芴系、菲系、二苯并噻吩系和屈系的降解率在24％-40％之间，单菌nj-ccz-10-a对萘系、芴系、菲系、二苯并噻吩系和屈系的降解率在13％-30％之间。整体而言，菌群nj-xfw-6-a+nj-ccz-10-a除对c1-nap、c1-phe降解率在40％以下外，对其余多环芳烃系列物降解率均在40％以上。
[0075]
实施例3：石油降解菌产表面活性剂能力
[0076]
采用排油圈法测定单菌nj-xfw-6-a和nj-ccz-10-a及菌群nj-xfw-6-a+nj-ccz-10-a的产表面活性剂能力：在锥形瓶中加入10ml液体石蜡，然后加入1g苏丹iii染料。将20ml蒸馏水加入玻璃培养皿，之后在液面中心加100μl已加入染料的液体石蜡，静置等待液体石蜡均匀分布于水面中央，形成直径大于30mm的油膜，之后在石蜡中心缓缓滴加50μl菌株培养液，在油膜中心形成排油圈。若产生排油圈，则测量培养皿中添加培养液后所形成的排油圈的大小。空白对照选择不接菌的液体培养基。
[0077]
结果表明两株单菌均有产生表面活性剂的能力(表1)，菌株nj-ccz-10-a和nj-xfw-6-a排油圈直径分别达到35mm和15mm，构建的菌群nj-xfw-6-a+nj-ccz-10-a排油圈直径高达47mm，可以看出其产表面活性剂能力是两株单菌能力的叠加，正是由于具有高的产生表面活性剂能力，使得中质原油在低温下也能被快速乳化，易于生物降解。
[0078]
表1：细菌产表面活性剂能力表
[0079][0080]
本发明的低温石油降解菌群可以用于高纬度寒冷地区受到石油污染的土壤、近岸沉积物和水体的生物修复。