一种培养海洋光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法与流程

1.本发明涉及生物制氢领域，具体而言，涉及一种培养海洋光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法。


背景技术：

2.能源短缺和环境污染是人类经济和社会发展所面临的两大难题，开发可再生的绿色能源迫在眉睫。因此我们必须寻找清洁的可再生能源，来替代“化石能源”。由于氢能的能量密度高，运输方便，无污染等特点，最有希望成为未来主要的替代能源之一。但自然界中的氢都是以化合态的形式存在必须通过化学物理法或生物法两种途径才能获取氢气因此也被称为二次能源。而化学物理法生产氢气除电解水制氢外大多要消耗化石能源，在生产过程中往往会造成环境污染并且都要在高温高压或强酸强碱条件下进行反应条件激烈成本高。生物制氢是通过微生物的新陈代谢作用产生氢气，反应条件温和大多还可利用能够大量获得的生物质、工农业废弃物和废水为原料，其制备成本低，在生产氢气的同时又净化了环境。
3.生物制氢主要有光解水产氢、暗发酵产氢和光发酵产氢三种方法。其中暗发酵产氢具有产氢速度快和工艺条件简单的优点，但暗发酵细菌进行放氢时，随着有机物的降解，ph值不断下降，ph的下降会使发酵菌的放氢活性下降，甚至完全失去放氢活性，实际产氢量低于理论值。光发酵菌进行产氢是以紫色非硫细菌为主的光合细菌在光照厌氧条件下能将各种低分子有机底物转化为氢气和二氧化碳的生物制氢技术，但光发酵菌分解大分子有机物的能力不强，甚至不能单独处理有机废物产氢。因此目前两种生物制氢方法均具有较大的缺陷。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种培养海洋光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，此方法可以达到持续产氢的效果。
5.本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
6.本技术实施例提供一种培养海洋光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，包括培养暗发酵菌、培养光发酵菌和光-暗发酵耦联制氢三个步骤；其中，
7.培养暗发酵菌：采用海洋底泥、海水和无机物为暗发酵培养基，培养得到菌群，经富集后得到暗发酵菌的纯菌株；
8.培养光发酵菌：采用海洋底泥、海水和光发酵培养基为底物，在光照条件下培养得到菌群，经富集后得到光发酵菌的纯菌株；
9.光-暗发酵耦联制氢：往暗发酵培养基中加入木薯粉，接种暗发酵菌进行发酵产氢，在暗发酵菌接种50～60h后接种光发酵菌继续制氢。
10.相对于现有技术，本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果：
11.本发明采用海洋底泥和海水作为底物，加入不同的无机物或培养基，单独发酵培
养出暗发酵菌和光发酵菌，然后将暗发酵菌和光发酵菌进行光-暗发酵耦联制氢，暗发酵菌可以利用大分子有机物产生氢气和二氧化碳，同时生成小分子有机酸，小分子有机酸的大量积累限制了氢气的生产而使氢气产率处于较低的水平，在反应50～60h后往培养基中注入光发酵菌，光发酵菌能够利用前期暗反应产生的小分子有机酸来产生氢气，从而消除有机酸积累的影响，提高有机物的去除效率，在光发酵菌进行大量产氢的同时，暗发酵菌利用最后的大分子有机物缓慢产氢，最终实现持续、高效且稳定的产氢能力，创造了协同生长的生存环境，使两种细菌充分发挥共生协同互补作用。
12.在本发明中将光发酵菌制备成颗粒光发酵菌，将光发酵细菌固定在载体上，可以防止其因为体积小沉降差而产生菌体流失的现象，降低了生产成本，提高细菌利用率和对底物的转化效率，延长产氢时间，改善氢气产量和水质净化效率。
13.本发明利用海洋底泥和海水作为发酵和制氢的底物，可以有效解决海水养殖产生的大量有机废物，对其进行资源化利用，改善环境。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
15.图1为本发明实验例不同实验组的产氢对比图。
具体实施方式
16.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
17.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
18.一种培养海洋光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，包括培养暗发酵菌、培养光发酵菌和光-暗发酵耦联制氢三个步骤；其中，
19.培养暗发酵菌：采用海洋底泥、海水和无机物为暗发酵培养基，培养得到菌群，经富集后得到暗发酵菌的纯菌株；
20.培养光发酵菌：采用海洋底泥、海水和光发酵培养基为底物，在光照条件下培养得到菌群，经富集后得到光发酵菌的纯菌株；
21.光-暗发酵耦联制氢：往暗发酵培养基中加入木薯粉，接种暗发酵菌进行发酵产氢，在暗发酵菌接种50～60h后接种光发酵菌并调整光照继续制氢。
22.本发明利用海洋底泥和海水作为发酵和制氢的底物，可以有效解决海水养殖产生的大量有机废物，对其进行资源化利用，改善环境。
23.在本发明的一些实施例中，上述培养暗发酵菌步骤具体为：取海洋底泥进行预处理，置于反应器中，加入海水、无机物和碳源，调整ph，混合均匀，采用氮气对反应器进行排
空，密封制造无氧环境，然后放入摇床进行震荡培养。
24.在本发明的一些实施例中，上述预处理后的海洋底泥与海水的体积比为1：(2.5～4.5)；所述无机物包括：碳酸氢铵5～6g/l、碳酸氢钠6～7g/l、磷酸氢二钾0.1～0.2g/l、六水硫酸锰0.02～0.04mg/l、硫酸亚铁晶体0.04～0.05g/l、氯化锰0.1～0.15g/l和五水硫酸铜0.005～0.01g/l；所述碳源为蔗糖，含量为20～30g/l；所述ph为8～8.5。
25.在本发明的一些实施例中，上述培养光发酵菌具体为：取海洋底泥进行预处理，加入海水后接种在发酵培养基中，混合均匀，采用氮气对反应器进行排空，密封制造无氧环境，调整光照和温度进行发酵培养，发酵培养结束后取上层培养液进行富集培养。
26.在本发明的一些实施例中，上述海洋底泥的预处理为将海洋底泥在90～100℃下热处理80～100min。将海洋底泥进行活化处理，可以提高其培养菌的能力。
27.在本发明的一些实施例中，上述预处理后的海洋底泥与海水的体积比为1：(2.5～4.5)；所述发酵培养基包括：乙酸钠1～3g/l、丁酸钠2～3g/l、氯化铵3～5g/l、蛋白胨0.5～1g/l、牛肉膏1～1.5g/l、磷酸氢二钾0.3～0.6g/l、六水硫酸锰0.2～0.4g/l、无水氯化钙0.05～0.08g/l、四水氯化锰0.02～0.04g/l、五水硫酸铜0.04～0.06g/l、氯化镍0.08～0.12g/l和硼酸0.8～1.2g/l。
28.在本发明的一些实施例中，上述光照为3500～4000lux，所述温度为32～35℃。
29.在本发明的一些实施例中，上述光-暗发酵耦联制氢步骤中木薯粉的加入量为10～20g/l。加入木薯粉可以明显提高暗发酵步骤的产氢速率。
30.在本发明的一些实施例中，上述光-暗发酵耦联制氢步骤中的光发酵菌采用颗粒光发酵菌的形式进行接种；所述颗粒光发酵菌的制备方法为：将光发酵菌的悬液与同等体积的琼脂混匀，在38～42℃的温度下加热5～10min，冷却后得到颗粒光发酵菌。在本发明中将光发酵菌制备成颗粒光发酵菌，将光发酵细菌固定在载体上，可以防止其因为体积小沉降差而产生菌体流失的现象，降低了生产成本，提高细菌利用率和对底物的转化效率，延长产氢时间，改善氢气产量和水质净化效率。
31.在本发明的一些实施例中，上述光-暗发酵耦联制氢步骤中接种的暗发酵菌与光发酵菌的比例为1：(3～8)，光照强度为3500～4000lux。
32.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
33.实施例1
34.一种培养海洋光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，包括以下步骤：
35.培养暗发酵菌：取海洋底泥，在100℃下热处理80min，恢复到室温后后置于培养皿中，加入3倍体积的海水，混匀后，按照体积加入碳酸氢铵6g/l、碳酸氢钠6.5g/l、磷酸氢二钾0.15g/l、六水硫酸锰0.03mg/l、硫酸亚铁晶体0.045g/l、氯化锰0.12g/l、五水硫酸铜0.005g/l和蔗糖25g/l，调整ph为8.2，再次混合均匀，采用氮气对培养皿进行排空，然后密封培养皿制造无氧环境，再放入摇床以200r/min进行震荡培养，培养温度为35℃，经3次重复处理后得到暗发酵菌的菌株。
36.培养光发酵菌：取海洋底泥，在100℃下热处理80min，恢复到室温后后置于培养皿中，加入3倍体积的海水，混匀后，接种在发酵培养基中混合均匀，按体积计算，发酵培养基中含有乙酸钠2g/l、丁酸钠3g/l、氯化铵3.5g/l、蛋白胨0.7g/l、牛肉膏1.2g/l、磷酸氢二钾0.5/l、六水硫酸锰0.3g/l、无水氯化钙0.07g/l、四水氯化锰0.02g/l、五水硫酸铜0.04g/l、
氯化镍0.09g/l和硼酸1g/l，通入氮气对培养皿进行排空，在液面覆盖2cm的灭菌液体石蜡，制造无氧环境，调整光照为4000lux、温度为32℃，进行发酵培养，当培养液变成红褐色或深红色时，吸取上层培养液进行重复富集培养3次，得到光发酵菌的纯菌株。
37.光-暗发酵耦联制氢：往新的暗发酵培养基中加入15g/l木薯粉，接种暗发酵菌进行发酵产氢，温度为35℃，暗发酵菌接种时将光发酵菌的悬液与同等体积的4％浓度的琼脂混匀，在40℃的温度下加热5min，冷却后制得颗粒光发酵菌，在暗发酵菌接种50h后采用注射器注入3倍数量的颗粒光发酵菌，调整光照为3500lux，继续制氢。
38.实施例2
39.一种培养海洋光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，包括以下步骤：
40.培养暗发酵菌：取海洋底泥，在90℃下热处理90min，恢复到室温后后置于培养皿中，加入4倍体积的海水，混匀后，按照体积加入碳酸氢铵5.5g/l、碳酸氢钠6g/l、磷酸氢二钾0.1g/l、六水硫酸锰0.04mg/l、硫酸亚铁晶体0.04g/l、氯化锰0.1g/l、五水硫酸铜0.01g/l和蔗糖30g/l，调整ph为8.5，再次混合均匀，采用氮气对培养皿进行排空，然后密封培养皿制造无氧环境，再放入摇床以150r/min进行震荡培养，培养温度为32℃，经4次重复处理后得到暗发酵菌的菌株。
41.培养光发酵菌：取海洋底泥，在90℃下热处理85min，恢复到室温后后置于培养皿中，加入4倍体积的海水，混匀后，接种在发酵培养基中混合均匀，按体积计算，发酵培养基中含有乙酸钠3g/l、丁酸钠2.5g/l、氯化铵5g/l、蛋白胨0.4g/l、牛肉膏1g/l、磷酸氢二钾0.3/l、六水硫酸锰0.4g/l、无水氯化钙0.08g/l、四水氯化锰0.04g/l、五水硫酸铜0.02g/l、氯化镍0.12g/l和硼酸1.2g/l，通入氮气对培养皿进行排空，在液面覆盖3cm的灭菌液体石蜡，制造无氧环境，调整光照为3500lux、温度为35℃，进行发酵培养，当培养液变成红褐色或深红色时，吸取上层培养液进行重复富集培养4次，得到光发酵菌的纯菌株。
42.光-暗发酵耦联制氢：往新的暗发酵培养基中加入20g/l木薯粉，接种暗发酵菌进行发酵产氢，温度为32℃，暗发酵菌接种时将光发酵菌的悬液与同等体积的3％浓度的琼脂混匀，在45℃的温度下加热5min，冷却后制得颗粒光发酵菌，在暗发酵菌接种60h后采用注射器注入8倍数量的颗粒光发酵菌，调整光照为4000lux，继续制氢。
43.实施例3
44.一种培养海洋光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，包括以下步骤：
45.培养暗发酵菌：取海洋底泥，在95℃下热处理90min，恢复到室温后后置于培养皿中，加入4倍体积的海水，混匀后，按照体积加入碳酸氢铵6g/l、碳酸氢钠5g/l、磷酸氢二钾0.2g/l、六水硫酸锰0.02mg/l、硫酸亚铁晶体0.05g/l、氯化锰0.15g/l、五水硫酸铜0.005g/l和蔗糖20g/l，调整ph为8，再次混合均匀，采用氮气对培养皿进行排空，然后密封培养皿制造无氧环境，再放入摇床以180r/min进行震荡培养，培养温度为32℃，经4次重复处理后得到暗发酵菌的菌株。
46.培养光发酵菌：取海洋底泥，在90℃下热处理80min，恢复到室温后后置于培养皿中，加入4倍体积的海水，混匀后，接种在发酵培养基中混合均匀，按体积计算，发酵培养基中含有乙酸钠2g/l、丁酸钠2g/l、氯化铵3g/l、蛋白胨1g/l、牛肉膏1.5g/l、磷酸氢二钾0.6/l、六水硫酸锰0.2g/l、无水氯化钙0.05g/l、四水氯化锰0.02g/l、五水硫酸铜0.06g/l、氯化镍0.08/g/l和硼酸0.8g/l，通入氮气对培养皿进行排空，在液面覆盖3cm的灭菌液体石蜡，
制造无氧环境，调整光照为3800lux、温度为35℃，进行发酵培养，当培养液变成红褐色或深红色时，吸取上层培养液进行重复富集培养4次，得到光发酵菌的纯菌株。
47.光-暗发酵耦联制氢：往新的暗发酵培养基中加入10g/l木薯粉，接种暗发酵菌进行发酵产氢，温度为32℃，暗发酵菌接种时将光发酵菌的悬液与同等体积的4％浓度的琼脂混匀，在45℃的温度下加热5min，冷却后制得颗粒光发酵菌，在暗发酵菌接种60h后采用注射器注入5倍数量的颗粒光发酵菌，调整光照为3800lux，继续制氢。
48.实施例4
49.一种培养海洋光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，包括以下步骤：
50.培养暗发酵菌：取海洋底泥，在100℃下热处理90min，恢复到室温后后置于培养皿中，加入3倍体积的海水，混匀后，按照体积加入碳酸氢铵6g/l、碳酸氢钠5g/l、磷酸氢二钾0.2g/l、六水硫酸锰0.03mg/l、硫酸亚铁晶体0.05g/l、氯化锰0.12g/l、五水硫酸铜0.005g/l和蔗糖20g/l，调整ph为8，再次混合均匀，采用氮气对培养皿进行排空，然后密封培养皿制造无氧环境，再放入摇床以200r/min进行震荡培养，培养温度为32℃，经4次重复处理后得到暗发酵菌的菌株。
51.培养光发酵菌：取海洋底泥，在100℃下热处理80min，恢复到室温后后置于培养皿中，加入4倍体积的海水，混匀后，接种在发酵培养基中混合均匀，按体积计算，发酵培养基中含有乙酸钠1g/l、丁酸钠2g/l、氯化铵3g/l、蛋白胨1g/l、牛肉膏1.5g/l、磷酸氢二钾0.6/l、六水硫酸锰0.2g/l、无水氯化钙0.05g/l、四水氯化锰0.02g/l、五水硫酸铜0.05g/l、氯化镍0.08/g/l和硼酸0.8g/l，通入氮气对培养皿进行排空，在液面覆盖3cm的灭菌液体石蜡，制造无氧环境，调整光照为4000lux、温度为35℃，进行发酵培养，当培养液变成红褐色或深红色时，吸取上层培养液进行重复富集培养4次，得到光发酵菌的纯菌株。
52.光-暗发酵耦联制氢：往新的暗发酵培养基中加入10g/l木薯粉，接种暗发酵菌进行发酵产氢，温度为35℃，暗发酵菌接种时将光发酵菌的悬液与同等体积的4％浓度的琼脂混匀，在42℃的温度下加热10min，冷却后制得颗粒光发酵菌，在暗发酵菌接种60h后采用注射器注入6倍数量的颗粒光发酵菌，调整光照为3500lux，继续制氢。
53.实验例
54.本实验例探究光发酵菌的加入时间对光-暗发酵菌耦联产氢结果的影响。
55.本实验例中采用实施例1制备得到的光发酵菌和暗发酵菌进行试验，且产氢的培养基和木薯粉均同实施例1。共设置6个实验组，其中实验组1仅采用暗发酵菌进行产氢；实验组2将暗发酵菌和光发酵菌直接混合产氢，产氢环境无光照；实验组3将暗发酵菌和光发酵菌直接混合产氢，产氢环境的光照为3500lux；实验组4在暗发酵菌发酵40min后加入光发酵菌，光发酵菌加入后提供光照；实验组5在暗发酵菌发酵60min后加入光发酵菌，光发酵菌加入后提供光照；实验组6在在暗发酵菌发酵80min后加入光发酵菌，光发酵菌加入后提供光照。采用排水法收集产生的氢气，计算氢气量，如图1所示。
56.从图1中可以看出，实验组1和实验组2中的产氢趋势基本相同，表明在无光照环境下，基本只有暗发酵菌会进行产氢；实验组3中从一开始就进行光照，暗发酵菌几乎不产氢，而光发酵菌对于分解大分子有机物的能力不强，导致产氢量最低；实验组4在发酵40min后加入光发酵菌，此时提供光照，暗发酵菌停止产氢，光发酵菌利用之前暗发酵菌分解的有机酸进行产氢，最终产量较低，原因在于前40min暗发酵菌分解的有机酸有限，因此光发酵菌
的产量总量受限；实验组5和实验组6最终产氢量大致相同，区别在于实验组5中在80h时基本已经完成了产氢，实验组6在100h后基本完成产氢。
57.综上所述，本发明实施例的一种培养海洋光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法。本发明采用海洋底泥和海水作为底物，加入不同的无机物或培养基，单独发酵培养出暗发酵菌和光发酵菌，然后将暗发酵菌和光发酵菌进行光-暗发酵耦联制氢，暗发酵菌可以利用大分子有机物产生氢气和二氧化碳，同时生成小分子有机酸，小分子有机酸的大量积累限制了氢气的生产而使氢气产率处于较低的水平，在反应50～60h后往培养基中注入光发酵菌，光发酵菌能够利用前期暗反应产生的小分子有机酸来产生氢气，从而消除有机酸积累的影响，提高有机物的去除效率，在光发酵菌进行大量产氢的同时，暗发酵菌利用最后的大分子有机物缓慢产氢，最终实现持续、高效且稳定的产氢能力，创造了协同生长的生存环境，使两种细菌充分发挥共生协同互补作用。
58.在本发明中将光发酵菌制备成颗粒光发酵菌，将光发酵细菌固定在载体上，可以防止其因为体积小沉降差而产生菌体流失的现象，降低了生产成本，提高细菌利用率和对底物的转化效率，延长产氢时间，改善氢气产量和水质净化效率。
59.以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。