一种MPL三乙胺盐、其制备工艺及应用的制作方法

本发明属于医药，具体的，涉及一种mpl三乙胺盐、其制备工艺及应用。

背景技术：

1、mpl(单磷酰酯a，monophosphoryl lipid a，也简称mpla)是来自于革兰氏阴性细菌细胞壁中的内毒素(lps)的最内层脂质体(lipid a)部分。脂肪链结构和磷酸化程度均会影响其活性和内毒素的作用，来自于salmonella minnesota的lipid a分别在1位和4位含有一个磷酸基团，会过度激活先天性免疫应答，从而导致败血性休克等临床症状，副反应强烈。文献报道去掉1位磷酸基团后，其毒性降低且保留了免疫活性，称之为单磷酰酯a(mpl)。

2、作为已上市的新一代疫苗佐剂，mpl临床用途广泛，常见的佐剂系统有：as01(包含qs21与mpl(脂质体佐剂)、as02(含有角鲨烯和α-生育酚的水包油乳液中加入mpl和qs21)、as04(mpl吸附在氢氧化铝)、as15(mpla，qs21，cpg，脂质体)等，而佐剂系统不同的配伍(formulation)会影响到佐剂的免疫应答效果和副作用。已上市的含佐剂的疫苗产品：

3、fendrix tm：由gsk在2004年研制的乙肝疫苗，该疫苗由乙肝病毒(hbv)表面抗原(hbsag)和as04佐剂系统组成。

4、cervarix tm与gardasil tm：前者是由gsk在2009年研制的宫颈癌二价疫苗，由hpv l1表位的病毒样颗粒(vlp)与as04系统组成；后者由默克研发，也含有as04佐剂。

5、shingrix tm：由gsk研制的带状疱疹疫苗，使用as01佐剂系统。

6、由于佐剂系统不同的配伍(formulation)会影响到佐剂的免疫应答效果和副作用，所以mpl需要经过不同类型的制剂工艺后，形成佐剂制剂才能进行使用，因此对于该产品的溶解性质有较高的要求。

7、目前mpl来源主要依靠生物发酵提取，包含四个或五个不同链长的长链酰基结构同系物的复杂混合物。缺点是制备纯化难度大，残留的蛋白及糖异质带来的纯度问题，并且成本较高。例如，一类称为sj-19a的lipid a是从革兰氏阴性细菌液化曲霉中酸性水解而来的，但在酸水解步骤中，可能发生化学降解，不稳定的磷酸键断开从而导致mpl的异质性。

8、合成制备的mpl结构明确，没有糖异质带来的纯度问题，更适于工业化生产，但是其水溶解度差，应用于制剂受限。现有报道的mpl，base(非盐型)和铵盐形式溶解度都比较差，用于液体制剂受限；在水中为混悬液，无法进行过滤除菌。

9、针对现有技术中的上述技术问题，提出本发明。

技术实现思路

1、本发明首先涉及一种mpl三乙胺盐(mpl-tea)的制备方法，所述方法包括如下步骤：

2、(1)mpl粗品溶于氯仿后去除溶剂；

3、(2)加入tea水溶液，常温下超声使mpl均匀混悬在溶液中；

4、(3)将上述溶液转移至纯水中，超声分散均匀；

5、(4)向上述体系中加入tea水溶液，超声，冻干即得。

6、具体的，所述的方法的步骤为：

7、(1)mpl粗品与氯仿(10％，wt)中完全溶解，0.45μm微孔滤膜过滤后去除溶剂，使其均匀分布在圆底烧瓶底部；优选的，去除溶剂使用减压旋蒸法；

8、(2)加入1.0％tea水溶液，常温下超声使mpl均匀混悬在溶液中，优选的，所述的tea水溶液的加入量为mpl粗品的10倍(质量比)；

9、(3)将上述溶液转移至纯水中，超声分散均匀；优选的，纯水的加入量为mpl粗品的40倍(质量比)；

10、(4)向上述体系中加入0.2％tea水溶液，超声溶解完全即得；优选的，0.2％tea水溶液的加入量为mpl粗品的50倍(质量比)。

11、本发明还包括将所述mpl三乙胺盐制备成纳米溶液的步骤，具体的步骤为：

12、(5)将步骤(4)反应溶液通过高压均质机均质后用0.45μm水相微孔滤膜过滤；

13、本发明还包括将所述mpl三乙胺盐纳米溶液进一步冻干的步骤，具体的步骤为：

14、(6)转移至冻干机，按照冻干曲线进行冻干，所述冻干步骤为：

15、预冻：-30.0℃，180min；

16、一次干燥：

17、第一阶段：-15.0℃，降温30min，持续480min；

18、第二阶段：-5.0℃，升温30min，持续240min；

19、第三阶段：0℃，升温15min，持续240min；

20、解析干燥：20.0℃，升温15min，持续480min；

21、冻干结束后，冲氮并密封，保存于2-8℃。

22、最优选的，所述的方法包括如下步骤：

23、取1g mpl粗品10ml氯仿完全溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，加入5ml的甲醇旋转蒸发去除溶剂，使其均匀分布在圆底烧瓶底部。

24、向烧瓶中加入1.0％tea水溶液10ml，25-30℃超声0.5h，使mpl均匀混悬在溶液中。

25、将上述溶液转移至含有40ml纯水的容器中，超声分散均匀10min。

26、将上述体系中加入50ml 0.2％tea水溶液，超声10min。

27、最终得液体100ml，其中mpl 10mg/ml，tea浓度为0.2％。

28、上述溶液通过高压均质机均质两次，d50粒度<100nm，溶液0.45μm水相微孔滤膜过滤，转移至冻干机，按照冻干曲线进行冻干。冻干结束后，向冻干机冲氮，密封瓶塞，取出瓶子，保存于2-8℃。

29、本发明还涉及所述方法制备得到的mpl三乙胺盐。

30、所述的mpl三乙胺盐在水溶液中的溶解度为8mg/ml；

31、所述的mpl三乙胺盐溶解在纯水中制备得到的水溶液的平均粒径分布数据为：平均粒径约900～950nm。

32、所述的10mgmpl三乙胺盐通过1mldmso增溶后，溶于10ml去离子水制备得到的水溶液的平均粒径分布数据为：平均粒径约110～130nm。

33、本发明还涉及所述的制备mpl三乙胺盐的方法或mpl三乙胺盐在制备疫苗佐剂中的应用。

34、所述的疫苗优选为：乙肝疫苗、带状疱疹疫苗、宫颈癌疫苗。

35、所述的疫苗佐剂优选为脂质体或胶束佐剂，更优选的，所述的佐剂是：as01、as02、as04、as15。

36、所述的mpl粗品的化学合成工艺可参见cn202010305764、cn202010306822、cn202010305752、cn202010306826、cn202010305744、cn202010305754。

37、本发明的有益效果是：

38、(1)克服现有mpl在水和常规有机溶剂中溶解性差的问题。通过盐型筛选，发现三乙胺盐具备较好的溶解性，并且稳定性较好，经过高压均质后能够形成纳米溶液，所得的冻干粉具有良好的溶解性，适于疫苗佐剂的制剂处方。

39、(2)本发明操作步骤简单，成盐完全，通过dsc表征含三乙胺5.12％，气相检测三乙胺含量4.7％，理论含三乙胺5.48％；按照冻干参数工艺冻干，粒径减小溶解度明显提高。

40、(3)相比与mpl base，三乙胺盐冻干粉直接复溶在水中即可以形成纳米颗粒，通过少量有机溶剂增溶可以分散成粒径约为125nm的稳定纳米溶液，适用于制备纳米制剂。