一株交替赤杆菌N1及其用途和一种降解芘的方法

一株交替赤杆菌n1及其用途和一种降解芘的方法
技术领域
1.本发明属于环境微生物学领域，具体涉及一株交替赤杆菌及其在共代谢降解芘中的应用和一种降解芘的方法。


背景技术：

2.芘是由四个苯环稠合而成的结构稳定的有机化合物，芘作为高分子量多环芳烃的代表化合物，普遍存在于油田废水、炼化废水及焦化废水中，具有致癌、致畸、致突变、难生物降解的特点。随着我国油气勘探开发力度的不断深入及煤化工产业的不断发展，在原油开采、加工、运输、储存以及焦化废水的处理过程中常因多环芳烃的残留造成水体的污染。
3.目前，对废水的主要包括物理法、化学法、微生物法。经处理后，废水中绝大多数的低分子量有机污染物可被有效去除，但高分子量多环芳烃因溶解度低、生物降解难度大，通常残留在水体中，其中芘的残留量尤为突出，对生态环境和人类健康具有极大的危害。目前，芘的去除主要依赖于微生物的共代谢作用，即向污染土壤中添加外源营养物作为共代谢底物，微生物利用外加营养提高自身的代谢性能，同时降解芘。但随着外加营养物的耗尽，微生物的代谢活性随之降低，因而限制了芘的降解。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的问题，获取能以饱和烃、芳烃、酚类化合物作为共代谢底物的芘降解菌，是实现石油污染土壤及焦化废水中芘高效降解的关键，因此，本发明提供一株用于降解芘的交替赤杆菌，具体为交替赤杆菌(alterrythrobacter sp.)n1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是cgmcc no.23607，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
5.使用上述的交替赤杆菌n1，可以降解原油、石油和/或酚类化合物污染的土壤或水体中的芘。具体的，所述酚类化合物为苯酚和/或间甲基苯酚。
6.作为常见的污染形式，所述土壤为石油污染的土壤，所述水体为焦化废水或油田废水。
7.本发明还提供一种降解芘的方法，具体是在含芘的原油、石油和/或酚类化合物污染的土壤或水体中接种上述的交替赤杆菌，在水体中交替赤杆菌n1的接种量为4％(体积比)，菌液中菌浓度为1
×
10
6-2
×
108个/ml。
8.本发明的有益效果：
9.本发明筛选的菌种可以在不添加外源营养物的条件下实现芘的持续降解，可以有效降解石油污染土壤、焦化废水、油田废水中的芘；其中以石油烃为共代谢基质，30d芘降解率达76％，以苯酚、间甲基苯酚为共代谢基质，30d芘降解率达65％。
附图说明
10.图1为本发明的交替赤杆菌n1的菌落照片；
11.图2为本发明的交替赤杆菌n1的透射电镜照片；
12.图3为本发明交替赤杆菌n1的16s rdna序列的系统发育树；
13.图4为本发明交替赤杆菌n1在饱和烃、芳烃原油作为共代谢基质中对芘的降解效果；
14.图5为本发明交替赤杆菌n1在苯酚、间甲基苯酚作为共代谢基质中对芘的降解效果。
具体实施方式
15.在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
16.实施例1
17.菌种的筛选
18.(1)采用逐步提高芘含量的方法富集芘降解菌。
19.2020年9月于胜利油田沾三区块采油井附近采集土壤表面油泥。在含芘100mg/l的无机盐培养基中加入10g土壤表层油泥，在35℃、150rpm条件下，于空气浴恒温振荡器中培养7d。培养结束后，取上层培养液转接于含有300mg/l芘的无机盐培养基中继续培养7d。重复以上操作，依次以芘浓度500mg/l和700mg/l的无机盐培养基转接富集。
20.(2)富集结束后，将0.1ml培养液梯度稀释后涂布于含有芘的无机盐固体培养基上，待长出菌落，挑取菌落大小及形态不同的单菌落并划线分离。
21.其中，
22.lb培养基：酵母粉5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，氯化钠10.0g/l，ph＝7.0。
23.无机盐培养基(msm)：kh2po
4 1.0g/l，cacl
2 0.01g/l，k2hpo
4 1.0g/l，feso
4 7h2o 0.1g/l，mgso
4 0.5g/l，nh4no
3 1.0g/l，ph＝7.0，加入2％琼脂粉即可作为固体培养基，121℃高压灭菌20min。
24.菌种鉴定及形态学分析
25.采用平板涂布法在lb固体培养基上培养菌株，观察菌落形态(如图1所示)。菌株的菌落在芘固体无机盐培养基呈淡黄色，菌落呈圆形、表面光滑、有光泽。采用透射电镜观察菌体形貌(如图2所示)，菌体大小约1.2μm，呈棒状，无鞭毛。
26.使用细菌基因组dna提取试剂盒(本实施例使用的是：美国omega)提取细菌基因组。用于16srdna扩增的引物序列为27f(5'-agtttgatcmtggctcag-3')和1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3')。反应混合物(25μl)为：2μl细菌dna，1μl 10μ/l引物，12.5μl 2
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taq pcr母液。pcr扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸90s(35个循环)，72℃延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，经测序后，用mega 7.0进行序列相似性分析，依据邻接法构建系统进化树(如图3)，推断菌株为交替赤杆菌，命名为交替赤杆菌n1(altererythrobacter sp.n1)，并在2021年10月15日将菌种提交到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.23607。
27.(3)全基因组测序
28.将交替赤杆菌n1菌株接种到50毫升lb培养基中，在35℃和180rpm的摇床中培养7天，以10000rpm离心5分钟收集细胞。按照说明书的方法，使用qiagen dna试剂盒(德国希尔
登)提取基因组dna。提取的dna的质量采用qubit fluorometer、nanodrop进行评估。将高质量的dna样本剪切到500bp或6kb的平均片段大小后，分别制备两个片段大小的全基因组测序文库，并采用illumina miseq和pacbio测序系统对文库进行测序。下机数据经进行基因组预估、序列组装、结果评价等分析，得到交替赤杆菌n1菌株的基因组序列。全基因组分析显示，交替赤杆菌n1的基因组包含3520个基因，全长3536970bp，g+c含量为60.95％。
29.实施例2
30.(1)以饱和烃、芳烃、原油为共代谢基质对芘的降解
31.分别以饱和烃、芳烃、原油为共代谢基质，分析交替赤杆菌n1对芘的共代谢性能。
32.原油经四组分分离获得饱和烃、芳烃，组分的分离参照中华人民共和国石油天然气行业标准(sy/t 5119-2006)《岩石中可溶有机物及原油族组分分析》。
33.分别在含芘100mg/l的无机盐培养基中加入100mg/l的饱和烃、芳烃和原油作为共代谢基质，以只含有100mg/l芘的无机盐培养基作为对照，接种对数生长期的交替赤杆菌n1后于35℃，接种量4％(体积比)，菌液中菌浓度是2
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106个/ml，150rpm下培养，利用乙酸乙酯萃取降解液中的芘，采用气相色谱法以十氟联苯为内标，测定7d和30d萃取液中芘的含量，并计算芘降解率。
34.如图4所示，原油组和饱和烃组7天芘的降解率最高，分别为23.6％、22.4％，而芳烃只有16.7％，表明以饱和烃和原油作为共代谢基质的降解效果要强于芳烃。30天降解率的总趋势与7天降解率相同，且降解率显著提高，以原油为共代谢基质芘的降解率高达76％，表明交替赤杆菌n1能够利用原油中的饱和烃和芳烃作为共代谢基质，提高芘的降解率。
35.(2)以苯酚、间甲基苯酚为共代谢基质对芘的降解
36.分别以苯酚、间甲基苯酚、苯酚+间甲基苯酚为共代谢基质，分析交替赤杆菌n1对芘的共代谢性能。
37.苯酚和间甲基苯酚为焦化废水中含量较高的污染物，其中，苯酚含量最高，间甲基苯酚次之，且间甲基苯酚的毒性高于苯酚。以苯酚和间甲基苯酚模拟焦化废水酚类污染物，分别在含芘100mg/l的无机盐培养基中加入100mg/l的苯酚、100mg/l的间甲基苯酚、50mg/l的苯酚+50mg/l的间甲基苯酚作为共代谢基质，以只含有100mg/l芘的无机盐培养基作为对照，接种对数生长期的交替赤杆菌n1后于35℃，接种量4％(体积比)，菌液中菌浓度是2
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106个/ml，150rpm下培养，利用乙酸乙酯萃取降解液中的芘，采用气相色谱法以十氟联苯为内标，测定7d和30d萃取液中芘的含量，并计算芘降解率。
38.结果如图5所示，其中：苯酚组、苯酚+间甲基苯酚组7天芘的降解率分别为26.6％和29.4％，高于间甲基苯酚组的降解率，表明以苯酚、苯酚+间甲基苯酚作为共代谢基质的降解效果要强于间甲基苯酚。30天降解率显著提高，以苯酚组、苯酚+间甲基苯酚组为共代谢基质时芘的降解率达69％和65％，表明多种酚共存的情况下，仍可达到较高的芘降解率，且交替赤杆菌n1能够利用焦化废水中的苯酚和间甲基苯酚作为共代谢基质，提高芘的降解率。
39.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所
作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。