一种筛选稻瘟病抗性材料的篦子筛及其应用

1.本发明属于抗性育种技术领域，具体涉及一种筛选稻瘟病抗性资源(材料) 的篦子筛及其应用。


背景技术：

2.水稻是地球上70％人口的主粮。稻瘟病是严重影响水稻产量和品质的世界性流行毁灭性病害，直接威胁水稻安全生产。种植抗病品种是有效控制病害发生为害、减少化学农药投入使用从而降低投入、保护生态环境提高生活质量的有效措施。但抗病品种的培育需要广谱抗病资源，需要掌握当地稻瘟病菌的毒力水平进而有针对性地选择抗病资源，作为供体改善当家品种的抗性水平。抗稻瘟病广谱资源的挖掘是育种工作中的一个瓶颈问题，需要掌握矛盾主体病原菌的致病性为前提。利用生理小种鉴别寄主开展稻瘟病菌致病性分化研究，国内外先后建立了多套体系并为病原菌致病性遗传分化和指导抗病育种研究发挥了积极作用。利用国际水稻所(irri)以粳稻丽江新团黑谷(lth)为受体培育的 23份抗稻瘟病广谱单基因品种，为系统开展稻瘟病病原菌致病性分化研究提供了有效工具，便于国际间开展抗病种质资源的合作与交流。
3.水稻品种与稻瘟病菌互作，遵循“基因对基因”学说，即品种中的一个抗病基因如果与病原菌中的一个无毒基因相对应或并列存在，这样的品种与病原菌即使在最适宜的发病情况下也不表现症状，表现不亲和。如果病原菌中存在多个这样的无毒基因，品种中恰好存在对应的抗病基因，这样的品种表现广谱抗性。这是培育抗病品种的终极目标和有效途径。而现实水稻抗稻瘟病育种工作中，侧重于单一广谱抗病基因的鉴定和利用，由于稻瘟病菌存在较高的产孢量和变异特性，导致依靠单一抗病基因的品种极易丧失抗性。
4.因此，如何提供一种能够筛选多抗病/广谱性品种(材料)工具和方法是本领域亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明公开了一种筛选稻瘟病抗性材料的篦子筛及其应用。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.利用avrpi12(t)、avrpi19、avrpi9、avrpiz或avrpi20在吉林省筛选、评价和挖掘抗稻瘟病水稻品种(资源)中的应用或在制备吉林省水稻抗稻瘟病筛选、评价和挖掘制品中的应用；
8.一种筛选稻瘟病抗性篦子筛的篦子筛，包括：
9.含有avrpi12(t)、avrpi19、avrpi9、avrpiz或avrpi20任意一种或多种基因的稻瘟病筛选评价载体；和
10.含有avrpi12(t)、avrpi19、avrpi9、avrpiz或avrpi20z任意一种基因的稻瘟病筛选评价载体的两种及以上的任意组合中的一种或多种。
11.作为优选的技术方案，稻瘟病筛选评价载体为稻瘟病原菌；
12.一种筛选稻瘟病抗性基因材料的篦子筛，包括201932菌株、201729菌株、 201948菌株、20020817菌株、201782菌株和201640菌株的一种或多种；
13.所述201932菌株于2021年9月13日，保藏于地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其分类命名为稻梨孢(pyricularia oryzae)，保藏编号为cgmcc no.23255；
14.所述201729菌株于2021年9月13日，保藏于地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其分类命名为稻梨孢(pyricularia oryzae)，保藏编号为cgmcc no.23253；
15.所述201948菌株于2021年9月13日，保藏于地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其分类命名为稻梨孢(pyricularia oryzae)，保藏编号为cgmcc no.23256；
16.所述20020817菌株于2021年9月13日，保藏于地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmc c)，其分类命名为稻梨孢(pyricularia oryzae)，保藏编号为cgmcc no.2 3251；
17.所述201782菌株于2021年9月13日，保藏于地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其分类命名为稻梨孢(pyricularia oryzae)，保藏编号为cgmcc no.23254；
18.所述201640菌株于2021年9月13日，保藏于地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其分类命名为稻梨孢(pyricularia oryzae)，保藏编号为cgmcc no.23252；
19.根据基因对基因假说，筛选得到与广谱抗病基因对应的优势无毒基因菌株： 201932菌株、201729菌株、201948菌株、20020817菌株、201782菌株和2016 40菌株
20.所述201932菌株含有avrpi12(t)，所述201729菌株含有avrpi19，所述20 1948菌株含有avrpi9，所述20020817菌株含有avrpiz，所述201782菌株含有 avrpi20，所述201640菌株同时含有avrpi120、avrpi12(t)和avrpi19；
21.作为优选的技术方案，所述篦子筛用于吉林省水稻广谱抗病性基因型的筛选；
22.上述的篦子筛在水稻抗稻瘟病筛选、评价和挖掘中的应用或在制备水稻抗稻瘟病筛选、评价和挖掘制品中的应用；
23.一种筛选稻瘟病抗性基因材料的篦子筛的使用方法，包括以下步骤：
24.将权利要求3或4所述的篦子筛稻瘟病菌孢子调解至105/ml，接种5叶龄的水稻，7天后根据发病情况确定确定水稻抗性；
25.作为优选的技术方案，其特征在于，所述培养湿度为95-100％，培养温度为 26-30℃；
26.作为优选的技术方案，还配合有基因水平检测。
27.综上所述，本发明公开了一种筛选稻瘟病抗性的篦子筛及其应用，本技术通过大量实验筛选出与稻瘟病抗病基因对应的标准的优势无毒基因菌株篦子，能够定向给予水稻稻瘟病抗性压力，筛选出定向稻瘟病抗性的水稻品种，为水稻稻瘟病广谱抗性育种打下基础。
附图说明
28.图1为篦子筛标准菌株模式样板图；
29.图2为吉林省稻瘟病菌优势无毒基因株组成篦子筛实例；
30.图3为水稻品种吉粳88、九稻44和庆林511与含稻瘟病菌20020817(avrpiz)互作亲和型表现；构成篦子筛稻瘟病菌株筛选条件:按广谱抗病基因抗谱由高到低排序，即a》b》c》d》e》f》g；篦子筛中目标基因表现不亲和(抗病r，resistant)，抗谱下降，其它菌株致病性尽可能为亲和型(感病即s，susceptible)；
具体实施方式
31.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.实施例1篦子筛标“准菌”株筛选过程
33.自1996年，吉林农业科学院水稻病害团队每年采集北方粳稻区稻瘟病常发区代表性菌株标样(叶片或茎秆)100余份，至2020年采集标样近2500份。经分离单孢、保存。2001年起，该团队利用国际水稻所(irri)培育的31份含有23个抗稻瘟病单基因系品种(分别含有抗病基因pia，pib，pii，pik，pik-h，pik-m，pik-p，pik-s，pish，pit，pita，pita-2，piz，piz-t，pi1，piz-5，pi3，pi5(t)，pi7(t)，pi9，pil2(t)，pi19和pi20)，与历年收集的稻瘟病菌单孢培养物人工接种互作，通过亲和性表现型确病原菌的致病型，具体如下：
34.(1)采集稻瘟病标样在实验室开展病原菌单孢子分离、保存和扩繁；
35.稻瘟菌单孢分离：挑选典型的单个稻瘟病梭形病斑标样，每个病斑分离出1个有效单孢。具体步骤如下：取病样在次氯酸钠溶液中漂洗2分钟，无菌水漂洗三次，用无菌吸水纸将吸干后平铺在2％含四环素的水琼脂板上，28℃光照培养2-5d，培养叶段或茎秆边缘和病斑周围可长出大量的分生孢子。振落单孢到5％琼脂培养基上，再在25℃条件下培养24h，在显微镜下用挑针挑单孢子，转入pda培养基培养备用。
36.燕麦琼脂培养基的制备：称取45g燕麦粉和18g琼脂粉，自来水定容1l。121℃、灭菌60min后，倒平板备用。将单孢分离物用移植针转移至燕麦平板培养基上，在28℃、黑光灯和日光灯下(12h/12h)诱导产孢。
37.稻瘟菌单孢分离物的保存：称取17g秸秆粉和18g琼脂粉，蒸馏水1l。121℃、灭菌60min后，倒平板备用。在平板上铺无菌滤纸片，将单孢分离物用移植针转移至秸秆琼脂培养基上。待待滤纸片长满菌丝将纸片完全干燥后，放入收集管和保鲜盒于-20℃低温(或常温干燥)保存。
38.人工接种及抗性评价：利用0.1％的gelatin的无菌溶液配兑105/ml浓度稻瘟病菌孢子，在26-30℃温室内，采用手动喷雾器喷雾，用量为30ml/m2，人工接种5叶龄的水稻抗稻瘟病单基因品种，经过7天充分显症后调查病斑型(或病斑面积)。病级分为0-9级，其中0-3级别为抗病型(r)，4-9级为感病型(s)。抗性评价可以采用病斑型评价互作程度，也可以采用发病面积评价。根据具体情况做出选择，如抗性资源筛选或病原菌致病性分析，可根据病斑类型评价(表1)；如果从事抗性遗传分析，则按照发病面积评价(表2)。
39.表1.按照病斑型及为害程度调查标准.
[0040][0041]
表2.按照发病病斑面积病情调查标准.
[0042][0043]
通过亲和性(建立发病关系)菌株比例确定(品种)广谱抗病基因型和病原菌优势无毒基因型。每次接种试验至少独立开展2次，每次2个重复，以发病重的调查数据为互作结果，确保评价数据可重复。
[0044]
(2)篦子筛“标准”菌株的选择：选择互作表现非亲和比例(病原菌优势无毒基因型)从大到小、对含某特异抗病单基因品种表现不致病、同时对其他抗病单基因品种表现致病、且相比产孢量尽可能多的稻瘟病菌株，为篦子筛模型候选“标准”菌株。
[0045]
分析2000余株明确无毒基因型特征的稻瘟病菌，avrpi12(t)、avrpi19、avr pi9、avrpiz、avrpi20依次为吉林省水稻稻瘟病菌优势无毒基因型，换言之，pi 12(t)、pi19、pi9、piz、pi20等依次为当地品种广谱抗病基因型。在大量菌株群体中筛选符合特征要求
的、本地域的菌株作为箅子筛候选菌株、且筛选得到的菌株只针对含某特异抗病基因品种表现无毒、而对其他抗病基因型表现有毒的稻瘟病菌组成箅子筛。基于以上条件，构成“标准”菌株组成篦子筛模式(如图1所示)。
[0046]
实施例2吉林省稻瘟病菌篦子筛标准菌株的筛选
[0047]
根据稻瘟病单孢分离物与单基因品种互作评价结果，确定稻瘟病菌优势无毒基因型(或品种广谱抗病基因型)；再按病原菌优势无毒基因型从大到小排序篦子筛无毒基因型“标准”菌株：由互作数据，avrpi12(t)、avrpi19、avrpi9、 avrpiz、avrpi20吉林省水稻广谱抗病基因型，按此顺序排序篦子筛模式。
[0048]
筛选针对含特异抗病基因表现无毒、而对其他抗病基因型表现有毒的稻瘟病菌无毒基因型菌株组成箅子筛。依据广谱抗病基因型的抗谱从高到低顺序，排列对应无毒基因标准菌株，筛选得到含有avrpi12(t)的菌株编号201932菌株、含有avrpi19的菌株编号201729、含有avrpi9的菌株编号201948菌株、含有a vrpiz的菌株编号20020817和含有avrpi20的菌株编号201782菌株；同时含有a vrpi120、avrpi12(t)和avrpi19的菌株编号201640，结果如图2所示。
[0049]
再在当地选择符合条件的菌株作为候选“标准”菌株(杜绝外源病原菌引进使用组成篦子筛菌株，避免扩散产生超毒毒性稻瘟病菌株)。最终，根据菌株产孢能力强等特性，选择篦子筛标准菌株，用于筛选抗病资源材料。
[0050]
针对不同地域，如不同省份或不同国家，按照此模式组建篦子筛并选出“标准”菌株，用于筛选抗稻瘟病品种资源(材料)。
[0051]
入选篦子筛“标准”菌株保存情况：
[0052]
针对吉林粳稻区广谱抗病基因型对应的稻瘟病菌无毒基因篦子筛“标准”菌株，已于2021年9月13日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，并登记入册。具体菌株代号及保藏编号如下：
[0053]
201932菌株：保藏编号为cgmcc no.23255；
[0054]
201729菌株：保藏编号为cgmcc no.23253；
[0055]
201948菌株：保藏编号为cgmcc no.23256；
[0056]
20020817菌株：保藏编号为cgmcc no.23251；
[0057]
201782菌株：保藏编号为cgmcc no.23254；
[0058]
201640菌株：保藏编号为cgmcc no.23252。
[0059]
于2021年10月18日由该中心负责人签发受理通知书和存活性报告书(具体见附件)。该中心将保存篦子筛“标准”菌株30年。
[0060]
实施例3篦子筛的应用
[0061]
吉粳88号是以日本高产优质品种奥羽346号为母本、以抗逆性强、大穗、少蘖的长白9号为父本配制杂交组合。曾创单产记录。2005～2008年期间，在吉林省吉粳88品种种植面积超过总种植面积50％，由于种植面积增加和推广时间延长，其抗性逐渐丧失。经分析其抗性基因背景发现其缺乏某些广谱抗病基因，比如piz，pi9等，基于此以吉粳88为母本、以九稻44为父本通过杂交组合，辅助基因型和表型鉴定改善品种对稻瘟病抗性，精准改良吉粳88品种抗性，培育出庆林511抗病优质品种。除庆林511外，庆林611、711和811品种也是以吉粳88为母本，经过杂家系选、基因型和表型鉴定辅助筛选改善吉粳88品种对稻瘟病抗性，
遗传背景及繁育过程都未做报道。
[0062]
庆林511：
[0063]
通过含有无毒基因稻瘟病菌株jlavr20020817(含有avrpiz)作为筛选菌株，辅助piz分子连锁标记，获得了庆林511品种。
[0064]
(1)根据吉林省稻瘟病菌优势无毒基因群，选择含有无毒基因稻瘟病菌株20020817(含有avrpiz)当做箅子筛；
[0065]
(2)保存20020817菌株滤纸片经过实验室燕麦扩繁；
[0066]
(3)以吉粳88为母本、九稻44为父本的f1代在温室内育苗；
[0067]
(4)在95-100％湿度和26-30℃温度条件下，在105/ml稻瘟病菌孢子浓度下接种5叶龄的水稻抗稻瘟病单基因系品种；
[0068]
(5)经过7天显症后调查，通过病斑型确定亲和性(发病关系)数量，确定品种资源的抗感型，选择抗性强的植株，并以相应抗病基因的分子标记进行辅助育种。抗性评价采用病斑型评价发病程度(表1)，0-3级别为抗病(r，r esistant)，4-9级别为感病(s，susceptible)。
[0069]
具体如下：
[0070]
选配组合：工作研究发现，吉粳88水稻品种是吉林省超级稻品种，种植面积达到全省可种植区域面积的50％，曾获吉林省科技进步一等奖，以高产、优质而著称，其审定之初抗病性评价为ms(中感)，随着种植面积的扩大，可侵染菌株群体剧增，品种抗性逐渐丧失。所以，很多育种工作者设法提高其抗性。九稻44品种抗性强，经鉴定分析含piz基因发挥了积极作用。选用亲本为吉粳 88(母本)和九稻44(父本)做杂交组合，杂交后采用自交方式连续繁殖。
[0071]
抗病表型鉴定：自2008-2013年起在选种圃种植f3世代材料，结合抗病表型和基因型筛选理想单株型，抗感性表型鉴定利用致病力较强的标准菌株jlavrpiz20020817(对含piz品种不致病的菌株)。参考王继春(2015，crop protection)方法进行苗期人工接种鉴定：菌株经过燕麦培养基产孢后，利用0.1％的 gelatin的溶液清洗孢子，调至孢子浓度为2
×
105个/ml，接种4-5叶龄世代材料的叶片。人工接种后温度控制在25℃、黑暗保湿16h后，继续保持在25℃、90％相对湿度的温室内显症。抗病表型评价采用王继春等(2013，crop protection) 抗感评价方法进行(0-9级病斑型评价，见本文表1)。利用标准无毒基因菌株接种后，统计f2-3材料的抗性和抗感比例(128：39)。杂交世代材料自f2进行抗性表型和基因型筛选，保留阳性植株。
[0072]
目的基因筛选：选择抗感分型植株提取叶片dna，通过pcr扩增检测目的基因的条带。抗病基因特异连锁标记引物为jcppiz-f：5
’‑
cgttgtataggaca gtttcatt-3’,jcppiz-r:5
’‑
aatctaggcactcaagtgttc-3’。扩增阳性产物送公司测序，通ncbi数据库对比分析产物信息。
[0073]
预试、区试和生产试验：自2016年参送吉林省水稻中早熟筛选试验，2017、 2018年送吉林省水稻中早熟区域试验，检验适宜种植地区；与2018年参加吉林省水稻中早熟生产试验。经过抗病型、丰产性及综合农艺性状考核评估，该材料于2020年初通过吉林省水稻品种审定委员会审定，命名为庆林511。审定当年在东三省抗性跟踪检测抗谱在90％以上，表现出稳定抗性表型。利用篦子筛菌株jlavr20020817，对亲本品种吉粳88(母本)、九稻44(父
本)和庆林51 1，在水稻5叶期再次进行温室人工接种鉴定，吉粳88(母本)表现感病，而九稻44(父本)和庆林511表现抗病，其抗性情况如图3所示，。
[0074]
该研究具体过程及方法见：辅助基因型和表型鉴定改善品种对稻瘟病抗性，王继春等，分子植物育种，2020，18(20)：6762-6768。
[0075]
庆林611(目标基因为pib，篦子筛菌株含有有无毒基因avrpib)、庆林711(p ikh，avrpikh)和庆林811(pizt，avrpizt，2014-45菌株满足)品种，都是以吉粳 88品种为受体，分别以不同抗性背景材料为供体，经过标准菌株表型鉴定和目标基因分子连锁标记双重筛选获得的材料，同年2020年经过吉林省水稻品种审定委员会审定为新品种。
[0076]
实施例3
[0077]
利用吉林省稻瘟病菌标准菌株组成篦子筛，2019年从吉林省农业科学院水稻算资源库640余份材料中筛选出不同抗病型材料，其中60余份表现广谱抗性，可用于当地抗稻瘟病育种。
[0078]
利用吉林、辽宁和黑龙江代表菌株组成标准菌株篦子筛，2021年利用这套箅子筛对中国农业科学院作物研究所委托的430余份世代材料作抗性评价，吉林菌株篦子筛选出56份抗病材料，利用黑龙江省菌株篦子筛选出51份抗病材料，利用辽宁菌株组成篦子筛筛选出146份抗病材料，筛选材料分别占材料总数的12.9％、11.8％和33.7％。同时经三地不同篦子筛菌株筛选出同时表现抗病的材料20份，占材料总数的4.6％。因涉及商业合作合同(保密原则)，有关具体方法和结果不便公开。
[0079]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0080]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。