一种小叶兜兰菌根真菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种小叶兜兰菌根真菌及其应用。


背景技术：

2.在自然条件下，兰花在生命周期的早期依赖菌根真菌。兰花的种子很小，一颗果荚包含数以百万计的种子，由于缺乏发育成熟的胚乳，种子仅含有少量复合碳水化合物作为营养来源。因此，几乎所有兰花物种都依赖与真菌的共生来促进种子萌发、原球茎发育及种苗生长。兰花菌根真菌分为菌根真菌和非菌根真菌两种。据报道，兰科丝核菌主要为胶膜菌科(tulasnellaceae)、角担菌科(ceratobasidiaceae)和蜡壳耳科(sebacinaceae)，它们都能促进兰花的种子萌发、原球茎发育和幼苗的生长。然而，据前期研究报道，并非所有经兰花分离得到的菌根真菌都能促进兰花的种子萌发、幼苗发育和生长。因此，筛选和鉴定兰花中有益菌根真菌至关重要。
3.小叶兜兰（paphiopedilum barbigerum）原产于中国西南和越南北部，为我国国家一级保护珍稀濒危植物。虽然在贵州和广西都有分布，近几年越南也有发现，但其在贵州的分布也极其稀少，属于小居群分布。许多研究结果表明，兰科植物对其菌根真菌是严格专一的。如果菌根真菌只局限于某一地区，那些与这类专一共生的兰科植物也可能变得稀有。菌根真菌的分布和专一性影响着兰科植物的分布，进而导致兰花的稀有性，这个问题已被广泛讨论。因此，我们有必要了解此物种与其相应菌根真菌之间互惠互利共生关系的建立和维持，以保育受威胁物种的野生种群，为小叶兜兰的居群恢复及野生资源保育奠定基础。人工繁殖技术可以实现兜兰的大规模繁殖，而菌根真菌的使用有助于克服培养过程中存在的成活率低、移栽后生长缓慢、抗性差等问题。因此，为了给小叶兜兰的人工快繁和野外种群保育提供技术支持，开展菌根真菌对小叶兜兰种子萌发和幼苗生长影响与作用的研究，筛选出小叶兜兰人工育苗过程中的促进种子萌发及幼苗生长的有益菌根真菌及最佳共生培养基十分必要。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明的目的在于，提供一株促进小叶兜兰种子萌发及幼苗生长的小叶兜兰菌根真菌及其应用。
5.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一株小叶兜兰菌根真菌,命名为epulorhiza sp. fqxy019，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctcc no：m 20211513；保藏日期：2021年11月29日；保藏地址：中国武汉武汉大学。
6.进一步的，所述小叶兜兰菌根真菌,经过形态学和分子鉴定后，它的菌落特征为：在pda培养基上菌落呈乳黄色，中心环乳白色，边缘不规则，锯齿状；菌丝生长紧贴培养基，早期无气生菌丝；后期，菌落变成蜡质和浅棕色，中心环凹陷及小球点状凸起；菌丝呈直角或近直角分枝，直径5.39-10.04μm；念珠状细胞椭圆形，大小16.79-23.82
×
34.35-45.38μ
m，由6-13个以上的念珠状细胞组成，聚集形成密集的念珠状细胞链簇，形成簇状结构。
7.本发明提供了一株小叶兜兰菌根真菌在促进小叶兜兰种子萌发中的应用。该应用具体为：将epulorhizasp. fqxy019与小叶兜兰种子共生培养。
8.本发明还提供了一株小叶兜兰菌根真菌在促进小叶兜兰幼苗生长中的应用。该应用具体为：将epulorhizasp. fqxy019与小叶兜兰种子共生培养，直至种子萌发成幼苗并生根。
9.一种小叶兜兰菌根真菌与小叶兜兰种子共生培养方法，包括以下步骤为：s1.将epulorhiza sp. fqxy019接种到pda培养基上，所述pda培养基体积为30ml并放置于直径为90mm的培养皿内；s2.培养2周后，观察培养皿中菌丝生长情况，待菌株长满培养皿为止；s3.选择小叶兜兰已成熟且长势良好的种子荚先用70%乙醇表面消毒30s，然后0.1%升汞消毒6 min，无菌蒸馏水冲洗5次；采用解剖刀和镊子将种子从种子荚中取出；s4.然后在每个装有epulorhiza sp. fqxy019-pda培养基的培养皿中播种约100粒种子；培养温度为22-24℃，光照强度为1200lux，光暗比是18：6；s5.培养2周后，监测并观察记录种子萌发、原球茎形成和幼苗生长情况。萌发率：萌发种子数/接种种子数
×
100%。
10.所述pda培养基由200 g马铃薯、10 g琼脂、20 g葡萄糖和1 l蒸馏水制成。
11.一种用于菌根真菌epulorhiza sp. fqxy019与小叶兜兰幼苗共培养的最佳培养基筛选方法，包括以下步骤：s1. 选用的培养基分别为pda培养基、ms培养基、b5培养基、oma培养基、ck培养基；s2. 分别在pda、ms、b5、oma上接种epulorhiza sp. fqxy019，以不接种epulorhiza sp. fqxy019的pda培养基作为幼苗培养对照（ck）；所述培养基均含有20 g/l葡萄糖和10 g/l琼脂，取等量30ml培养基倒置于相同体积的无菌组培瓶内；s3. 将所述菌根真菌fqxy019分别接种于ms、b5、oma和pda的中心位置，pda-菌根真菌fqxy019菌块大小为0.5
×
1 cm2；恒温28℃黑暗培养2周后，观察组培瓶中菌丝生长情况，待菌株长满组培瓶为止；s4. 将供试幼苗接种到所述的fqxy019-pda、fqxy019-ms、fqxy019-b5、fqxy019-oma及ck培养基中；最后，将组培瓶密封，培养温度为22℃-24℃，光照强度为1200 lux，光暗比为18：6；s5.培养90d后，观察并记录所有处理对应的幼苗生长情况，筛选出长势最好的幼苗并确定最佳培养基为pda培养基。
12.本发明的有益效果在于：本发明首次从小叶兜兰根系中分离筛选得到epulorhiza sp. fqxy019，该真菌能与小叶兜兰种子和幼苗形成了良好的共生关系，对小叶兜兰种子萌发和幼苗生长发育具有良好的促进作用，为小叶兜兰的人工繁殖和野外种群保育提供技术支持；本研究从小叶兜兰根系中分离到127株菌根真菌，经过127株菌根真菌与种子共生萌发试验对比，筛选得出epulorhizasp. fqxy019与小叶兜兰共生培养于pda培养基上的种子萌发及幼苗生长效应最好。小叶兜兰种子及幼苗与菌根真菌共生培养的方法，操作只需要相对简单的培养基配方，既经济又省时；此外，共生苗比非共生苗具有更多优势，因为接种菌根真菌的幼苗生长
更好，且具有更强的抗性。
附图说明
13.下面结合附图对本发明做进一步详细说明。
14.图1为菌根真菌epulorhiza sp. fqxy019的早期菌落形态图；图2为菌根真菌epulorhiza sp. fqxy019的后期菌落形态图；图3为菌根真菌epulorhiza sp. fqxy019的菌丝结构图；图4为菌根真菌epulorhiza sp. fqxy019处理小叶兜兰种子30d后形成原球茎时的状态图；图5为菌根真菌epulorhiza sp. fqxy019处理小叶兜兰种子50d后小叶兜兰出现第一片叶片时的状态图；图6为菌根真菌epulorhiza sp. fqxy019处理小叶兜兰种子80d后小叶兜兰幼苗生根时的状态图；图7为菌根真菌epulorhiza sp. fqxy019与不同培养基共培养对小叶兜兰幼苗生长影响的柱状对比图；图中*表明接菌培养基和无接菌培养基（ck）的幼苗生长指标之间表现出显著差异（p《0.05），**则表明表现出极显著差异（p 《0.01）；图8为在pda培养基上培养的共生菌苗分别与在oma培养基、b5培养基、ms培养基、无接菌pda培养基（ck）上培养的共生菌苗的对比图；图9为在接种epulorhiza sp. fqxy019的pda培养基、oma培养基、b5培养基、ms培养基、无接菌pda培养基（ck）上培养的幼苗的生长对比图；图10为无菌小叶兜兰幼苗接种epulorhiza sp. fqxy019共生培养90 d后，根系纵切面观察到的菌丝团，箭头表示菌丝团。
具体实施方式
15.下面由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
16.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均来自常规生化试剂商店购买得到的。
17.实施例一：菌根真菌epulorhiza sp. fqxy019的获取一、小叶兜兰菌根真菌的分离1.选取健壮的小叶兜兰根系，连同土壤和其他附着物一起放入保鲜袋中。
18.2.将收集的根系样本在自来水下冲洗4-6 h，并切成4-6 cm长的根段。
19.3.将根段置于装有无菌蒸馏水的培养皿中，用手术刀在超净工作台上轻轻刮去根毛、根被、表皮及其他附着物。
20.4.显微镜检，选择含有菌丝团的棕色区域，用无菌蒸馏水冲洗3次，先用70%乙醇表面消毒30 s，再用0.1%升汞消毒4 min，最后用无菌蒸馏水冲洗5次。
21.5.将带有菌丝团的根段切割成2 cm小段,然后用解剖刀和镊子刮取根段，使菌丝团从皮层细胞中释放出来，扩散到装有10 ml无菌蒸馏水的60 mm培养皿中。
22.6.从外胚层到内胚层，对根皮层细胞中的菌丝团进行3次梳理。
23.7.然后将菌丝团置于24℃恒温培养箱黑暗培养。24小时后显微镜检查菌丝团萌发情况，使用移液枪将已萌发菌丝团液转接至1cm2的pda培养皿中，并在24℃恒温培养箱中培养至观察到菌丝生长。
24.8.在显微镜下观察pda培养基上萌发的菌丝团和菌丝，然后从pda培养基上切下这些已萌发的菌丝，转接至pda平板上，24℃恒温培养箱中培养直到观察到菌丝生长。
25.9.当菌丝生长至1 cm长时，切取做边缘菌丝转接至90 mm的pda培养皿中。重复此操作，直到获得纯菌株并试管4℃保存。
26.将分离到的一株菌命名为epulorhiza sp. fqxy019。
27.二、epulorhiza sp. fqxy019的鉴定1. 形态鉴定将纯化的epulorhiza sp. fqxy019接种在pda培养基上，24℃恒温培养箱中培养。每天观察和记录菌株的菌落特征，包括菌落形状和颜色。
28.epulorhizasp. fqxy019的形态：菌落呈乳黄色，中心环乳白色，边缘不规则，锯齿状；菌丝生长紧贴培养基，早期无气生菌丝（见图1）。后期，菌落变成蜡质和浅棕色，中心环凹陷及小球点状凸起（见图2）。菌丝呈直角或近直角分枝（直径5.39-10.04μm）；培养过程中菌丝会形成椭圆形念珠状细胞，念珠状细胞大小16.79-23.82
×
34.35-45.38μm，由6-13个以上的念珠状细胞组成，聚集形成密集的念珠状细胞链簇，形成簇状结构（念珠状细胞的微观特征见图3）。
29.2. 分子鉴定（1）使用ctab法提取真菌菌株的dna：取适量epulorhiza sp. fqxy019菌体加入800ul ctab提取液研磨成浆状，转移至2ml离心管，65℃水浴30-40min；加入800ul 体积比24:1的氯仿:异戊醇溶液，摇匀静置15min，12000 r/min离心10 min；将上清液转移至灭菌离心管，加入1ml 95%冰冻乙醇，用手轻摇2min，-20℃冷冻至少0.5h，12000 r/min离心10 min；弃上清，沉淀加入1ml70%乙醇，静置5min，12000 r/min离心10 min，弃上清；在洁净工作台中干燥，重溶于50ul te缓冲液中。
30.（2）以基因组dna为模板，采用its1/its4引物在热循环仪上 pcr扩增核糖体its特定dna片段。
31.引物采用通用引its1和its4，分别为：its1（5
′‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3
′
）its4（5
′‑
tcctccgcttattgatatgc-3
′
）。
32.聚合酶链式反应（pcr）体积为30 μl，包含1μl dna、1μl下游和上游引物、12μl ddh2o和15μl 2
×
power taq pcr master mix。扩增程序：95
°
c下变性5min，95
°
c下变性30s，35次循环；58
°
c退火30s，72
°
c下延伸1min，35次循环；72
°
c延伸5min。
33.(3)采用北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司(dingguo，beijing，china)的dna片段快速纯化试剂盒 (purification/recover kit)进行纯化后，用bigdye循环测序试剂盒，结合abi 3730自动测序仪(applied biosystems，foster city，ca)测序。
34.dna完整性通过1%琼脂糖凝胶电泳分析。步骤（3）可由外部服务提供商纯化并测序，测序结果如序列表所示。将测序结果在genbank中进行blast搜索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，与genbank epulorhiza sp.no.gu166409.1的相似性最高，为97.93％。
35.根据菌落宏微观特征和分子序列特征，本发明鉴定epulorhizasp. fqxy019菌体为瘤菌根菌属(epulorhiza)的成员。菌株epulorhiza sp. fqxy019已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctcc no：m 20211513；保藏日期：2021年11月29日；保藏地址：中国武汉武汉大学。
36.实施例二：epulorhiza sp. fqxy019在促进小叶兜兰种子萌发及幼苗生长中的应用pda培养基由200 g马铃薯、10 g琼脂、20 g葡萄糖和1 l蒸馏水制成。
37.1.接种epulorhiza sp. fqxy019（1）将epulorhiza sp. fqxy019接种到pda培养基上，所述pda培养基体积为30ml并放置于直径为90mm的培养皿内；（2）培养2周后，观察培养皿中菌丝生长情况，待菌株长满培养皿为止；2. 接种小叶兜兰种子（1）选择小叶兜兰已成熟且长势良好的种子荚先用70%乙醇表面消毒30 s，然后0.1%升汞消毒6 min，无菌蒸馏水冲洗5次；采用解剖刀和镊子将种子从种子荚中取出；（2）然后在装有epulorhiza sp. fqxy019-pda培养基的培养皿中播种约100粒种子；培养温度为22-24℃，光照强度为1200lux，光暗比是18：6；3.种子萌发与幼苗生长情况的观察培养2周后，监测并观察记录种子萌发、原球茎形成和幼苗生长情况。萌发率：萌发种子数/接种种子数
×
100%。萌发情况如表1所示：表1 小叶兜兰种子接种菌根真菌fqxy019与未接种的萌发生长情况对比表1中以常规灭菌（未接种epulorhiza sp. fqxy019及其他真菌）的小叶兜兰种子作为对照 (ck)如表1所示，在小叶兜兰种子萌发与幼苗的形成和生根的四个阶段中，epulorhiza sp. fqxy019都具有明显的促进作用。
38.如图4，在pda培养基上（培养皿直径90mm）培养15 d后，接种epulorhiza sp. fqxy019的小叶兜兰种子变成浅棕绿色；种皮因胚膨大而破裂（第1阶段），培养30d后形成原球茎（第2阶段）。
39.如图5所示，幼苗的第一片叶子在培养50 d后出现（第3阶段）。
40.如图6所示，在培养80 d后幼苗进一步生长以及生根（第4阶段）。
41.结果表明，epulorhiza sp. fqxy019能促进小叶兜兰种子萌发与幼苗的形成及生根。
42.实施例三：菌根真菌epulorhiza sp. fqxy019与不同培养基共培养对小叶兜兰幼苗生长的影响选用的培养基分别为pda培养基、ms培养基、b5培养基、oma培养基、ck培养基（以下分别简称pda、ms、b5、oma、ck），所述培养基都为目前普遍使用的培养基。
43.1.接种epulorhiza sp. fqxy019（1）分别在pda、ms、b5、oma上接种epulorhiza sp. fqxy019，以不接种epulorhiza sp. fqxy019的pda培养基作为幼苗培养对照（ck），试验设6个重复；上述培养基均含有20 g/l葡萄糖和10 g/l琼脂；所述pda、ms、b5、oma、ck体积相同，取等量30ml培养基倒置于相同体积的无菌组培瓶内；（2）将所述菌根真菌fqxy019分别接种于ms、b5、oma和pda的中心位置，pda-菌根真菌fqxy019菌块大小为0.5
×
1 cm2。恒温28℃黑暗培养2周后，观察组培瓶中菌丝生长情况，待菌株长满组培瓶为止。
44.2. 幼苗接种将供试幼苗接种到所述的fqxy019-pda、fqxy019-ms、fqxy019-b5、fqxy019-oma及ck培养基中。最后，将组培瓶密封，培养温度为22℃-24℃，光照强度为1200 lux，光暗比为18：6。
45.培养90d后，观察并记录所有处理。
46.如图7-图10所示，经过观察可知与fqxy019-ms、fqxy019-b5、fqxy019-oma培养基和ck相比，fqxy019-pda显著增加了幼苗鲜重、叶长和根长（p 《0.01）。此外，与fqxy019-ms、fqxy019-b5、fqxy019-oma培养基和ck相比，fqxy019-pda培养基显著促进根数和叶数（p 《0.05）。值得注意的是，fqxy019-ms和fqxy019-b5培养基显著抑制了小叶兜兰幼苗的根生长（分别为p 《0.01和 p 《0.05）。因此，小叶兜兰种苗及菌根真菌epulorhiza sp. fqxy019共培养最佳的共生培养基为pda培养基。由此可知，不同培养基与菌根真菌共培养对小叶兜兰幼苗的生长具有不同的促进作用。
47.本发明其它未详尽之处均为本领域技术人员所公知的常规技术。
48.需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包含一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
49.本发明的保护范围不限于具体实施方式所公开的技术方案，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同替换、改进等，均落入本发明的保护范围。