1.本发明属于水产遗传育种
技术领域：
：，具体涉及一种东星斑抗病良种培育的基因组选择方法。
背景技术：
：：2.东星斑，学名豹纹鳃棘鲈(plectropomusleopardus)，隶属鲈形目，鮨科，石斑鱼亚科，鳃棘鲈属。东星斑肉质细腻、味道鲜美，通体呈靓丽红色，具有很高的经济价值和观赏价值，为海水名贵养殖鱼类。由于市场需求量大，野生种群数量因过度捕捞大幅下降，导致东星斑成为市场上一种稀缺的鱼类。近年来，随着东星斑人工养殖技术的突破和发展，养殖范围和规模逐渐扩大。不过，由于高密度养殖模式盛行，加之东星斑养殖环境恶化和种质退化，养殖过程中病害频发，造成了巨大的经济损失。其中，由哈维氏弧菌(vibrioharveyi)引起的“烂身病”成为了困扰养殖户的一大难题。例如海南地区曾在2011年爆发过以哈维氏弧菌为优势菌的细菌性疾病，病鱼大量死亡并出现尾部溃烂、全身发白等症状。通常养殖户应对疾病多以预防为主，出现疾病后往往采用全池泼洒抗生素，如土霉素、恩诺沙星和诺氟沙星等药物进行治疗。但大面积使用抗生素不仅影响水产品质量，还会造成食品安全问题、影响商品鱼价值，给消费者带来潜在的危害。因此，培育东星斑抗病良种，提高东星斑养殖群体自身的抗病力十分必要。3.如何准确挑选具有育种潜力的个体进行繁育是培育良种的核心问题。在水产抗病育种中，若有可用的家系材料则采用人工感染特定病原测定家系抗病力，然后使用基于系谱信息的最佳线性无偏预测(p-blup)估算受试家系的育种值(ebv)。为避免病原垂直传播的风险，人工感染中存活的个体一般不用作繁育亲本，而是从育种值ebv高的家系中选择未感染的健康个体进行繁育。因此，选择效率不高，每年可获得的遗传进展有限；若没有可用的家系材料，则多依据表型和经验选择，导致选择效率大幅降低。4.目前，东星斑的人工繁育主要依靠自然产卵和自然受精的方式进行，育苗场将数条性腺发育成熟的亲鱼置于同一网箱中，使其自然产卵和受精。由于缺少挑选具有育种潜力东星斑亲本的有效手段，因此难以培育抗病的东星斑良种。技术实现要素：5.本发明的目的是提供一种东星斑抗病良种培育的基因组选择方法，即一种基于非家系群体的东星斑抗病良种培育的基因组选择方法，以克服传统选育中缺少家系材料、缺失系谱信息和选择准确性较低的问题。为培育东星斑抗病良种提供分子育种方法，提高东星斑养殖群体抗病力，推动东星斑抗病良种培育进程。6.本发明所提供的东星斑抗病良种培育的基因组选择方法，所述的方法包括如下步骤：7.1)使用不同地理来源的东星斑幼鱼构建东星斑抗病参考群体，将具有抗病表型、但未纳入参考群体的个体作为验证群体；8.其中用于构建抗病参考群体的东星斑幼鱼是通过抗病力筛选后获得的；9.2)对参考群体和验证群体进行全基因组重测序，捕获基因组范围内高质量单核苷酸多态性(snp)位点；10.3)通过比较基因组最佳线性无偏预测(g-blup)和bayescπ两种方法预测抗病性状基因组估计育种值(gebv)的准确性随snp标记数减少的变化趋势来挑选预测验证个体gebv的snp数目和预测方法；11.4)根据步骤3)得到的结果，选出用于计算东星斑验证群体gebv的snp标记，12.所述的snp标记包含了与东星斑抗病性状相关的snp位点；13.5)利用步骤4)中挑选出的snp位点和构建好的东星斑抗病参考群体预测验证群体的抗病gebv，若存活的验证个体的平均gebv大于死亡个体的平均gebv则表明gebv与个体的抗病力存在正相关关系，gebv高的个体抗病力也强，用gebv对备选亲本进行挑选，获得抗病力强的个体用于抗病良种培育。14.本发明还提供与东星斑抗病相关的snp位点；15.所述的与东星斑抗病相关的snp位点位于序列seqidno:1—30中任一个序列的第36位。16.本发明所提供的基于全基因组选择技术的东星斑抗病良种培育方法可用于筛选抗病力强的亲本，选出的亲本可直接用于东星斑选育，为提高东星斑养殖群体的存活率提供了高效的技术手段。附图说明17.图1：东星斑参考群体和验证群体共有位点缺失率箱线图；18.图2：g-blup和bayescπ预测东星斑抗病性状gebv准确性变化曲线图；19.图3：用于估算验证群体gebv的20ksnp密度分布图；20.图4：验证群体中存活个体和死亡个体抗病gebv均值比较图。具体实施方式21.本发明建立了一种基于非家系群体的东星斑抗病良种培育的基因组选择方法，旨在为培育东星斑抗病高产良种提供一种新的分子选育技术。22.下面对结合实施例和附图对本发明的方法进行详细描述。23.实施例1：建立东星斑抗病参考群体24.从海南和山东养殖规模较大的多个养殖场收集东星斑幼鱼，将收集到的幼鱼运送至可进行人工感染实验的场所，通过腹腔注射哈维氏弧菌菌液的方式对这些幼鱼进行人工感染。将注射菌液的时间视为起点(0时)，每8小时观察一次注射后幼鱼的存活情况，及时移出死亡个体，记录个体信息(如全长、体重和死亡时间等)并剪取尾鳍鳍条存于无水乙醇中。实验共进行5天，结束后采集存活个体的尾鳍鳍条存于无水乙醇中并记录个体来源、全长、体重和死亡时间等数据。从中选取部分个体进行全基因组重测序，以构建东星斑抗哈维氏弧菌参考群体(表1)。将受试东星斑幼鱼在人工感染实验中的存活状态作为抗病表型，用于后续分析。将抗病表型定义为二分类性状，即：0表示在感染实验中死亡的幼鱼；1表示实验期间存活的幼鱼。25.实验中，将收集到的幼鱼分为6组，注射后分别置于相同规格的玻璃钢水槽。来自山东的东星斑幼鱼平均体重和平均体长均大于来自海南的东星斑幼鱼，单因素方差检验表明6组实验的感染存活率不存在显著性差异(p＝0.05)，感染后存活率范围为31.85％～43.41％，共选取534尾东星斑幼鱼构建参考群体(表1)。26.表1：东星斑人工感染实验及参考群体信息[0027][0028]实施例2：东星斑抗病参考群体全基因组重测序及筛选高质量snp[0029]1、参考群体全基因组重测序及变异检测[0030]使用dna提取试剂盒(tiangen，北京)提供的标准流程提取、纯化东星斑抗病参考群体的基因组dna。除参考群体基因组dna外，还提取了298尾具有抗病表型的东星斑的基因组dna，用于验证本发明所述方法的效果。使用纯化的基因组dna建立illumina双端文库，之后采用illuminahiseq2000测序平台测序，滤去低质量的测序读段(reads)后使用软件bwa将这些reads比对至东星斑参考基因组。使用软件gatk检测变异信息(snp和indel)。最终，在参考群体中，498个个体成功测序，个体测序数据量为10g，共获得34,026,719个变异，染色体上的变异为28,789,387个，非染色体上的变异为5,237,332个，个体平均测序深度为7.66x，变异结果存于文件“variances.ref.vcf.gz”。在验证群体中，298个个体成功测序，个体测序数据量为5g，共获得12,452,483个变异，染色体上的变异为11,355,373个，非染色体上的变异为1,097,110个，个体平均测序深度为3.66x变异结果存于文件“variances.val.vcf.gz”。[0031]2、筛选高质量snp变异位点[0032]按下述步骤过滤上述变异，保留高质量的snp位点后填充缺失的位点信息。[0033]在linux环境下运行以下命令：[0034][0035][0036][0037]bpgen‑‑outsnps.imputed[0046]##使用plink2统计等位基因频率[0047]plink2‑‑bpfilesnps.imputed‑‑autosome-num24‑‑freq‑‑outsnps.imputed[0048]##在r中运行以下代码，准备输出基因型所需文件[0049]library(data.table)[0050]freq《-fread(“snps.imputed.afreq”)[0051]alleles《-rbind(freq[alt_freqs《＝0.5,c(“id”,“alt”)],freq[alt_freqs》0.5,c(“id”,“ref”)],use.names＝f)[0052]write.table(alleles,“export.a.txt”,sep＝“\t”,col.names＝f,quote＝f)[0053]运行后，剩余1,211,259个高质量snp和796个个体供后续分析，其中，抗病参考群体498个个体，验证群体298个个体。[0054]#使用r从参考群体中提取包含不同snp数量的子集并以二进制形式储存，snp数量分别为500、700、1k、2k、8k、10k、20k、50k、80k和100k[0055]##使用plink2生成以0/1/2方式编码基因型aa/aa/aa的文件[0056]plink2‑‑bpfilesnps.imputed‑‑autosome-num24‑‑export-alleleexport.a.txt‑‑keepindiv.ref.txt‑‑exporta‑‑outgeno.ref[0057]##输出个体编号[0058]awk‘{print$2}’geno.ref.raw|sed‘1d’》iid.ref.txt[0059]##在r中运行以下脚本提取snp子集并以二进制方式保存[0060]library(data.table)[0061]den.snp《-c(5e2,7e2,1e3,2e3,8e3,1e4,2e4,5e4,8e4,1e5)[0062]geno《-fread(paste(“geno.ref.raw”))[0063]geno[,c(1:6):＝null][0064]geno《-as.matrix(geno)[0065]for(iin1:length(den.snp)){[0066]coor《-floor(seq(from＝1,to＝ncol(geno),length.out＝den.snp[i]))[0067]m《-geno[,coor][0068]save(m,file＝paste(“ref.snp.s”,i,“.bin”,sep＝“”))[0069]}[0070]运行后，所有snp子集均已二进制形式储存，便于后续读取。[0071]2、评估g-blup的预测准确性[0072]在asrreml-r中使用以下模型拟合表型数据，并评估g-blup的预测准确性。[0073]yijk＝φ(ori.locationi+b.weightj+ak)[0074]上述模型中，yijk为表型值，表示个体k采自地点i，在体重为j时进行感染时的表型；ori.locationi为固定效应，表示受试个体的采样地点；b.weightj为协变量，表示受试个体进行感染实验时的体重；ak为个体的随机加性效应；φ表示标准正态分布累计函数。在linux环境中运行以下命令：[0075][0076][0077][0078][0079][0080]3、评估bayescπ的预测准确性[0081]使用与g-blup相同的模型，在r中评估bayescπ的预测准确性。由于贝叶斯方法较为耗时，因此为每个snp子集指定一条命令，下面以snp子集“s1”为例说明如何估算bayescπ的预测准确性。在linux环境中运行以下命令：[0082][0083][0084]运行后，文件“ref.results.cv.bc.s1.csv”中最后一行的信息即为使用snp子集“s1”时bayescπ预测抗病的准确性。运行上述脚本10次(i的取值为1～10)得到bayescπ随snp数目变化时的预测东星斑抗哈维氏弧菌病gebv的准确性(图2)。[0085]4、比较两种全基因组选择方法随snp数目变化时的预测准确性[0086]gblup和bayescπ随snp数目变化时预测东星斑抗哈维氏弧菌gebv的准确性变化趋势示于图2，从中可知：随snp数目减少，g-blup和bayescπ的预测准确性呈下降趋势；当snp数为50k时，g-blup和bayescπ的预测准确性最高，分别为0.670和0.681；当snp标记数由20k降至3k时，g-blup和bayescπ的预测准确在可接受范围内下降；当标记数少于2k时，两种方法的预测准确性快速下降至0.606和0.611。总体而言，bayescπ的预测准确性略优于g-blup，因此使用bayescπ可产生较好的选择效果。[0087]实施例4：挑选用于预测东星斑候选个体gebv的snp标记[0088]基于实施例3的结果，同时考虑计算时间和基因分型成本，本发明认为使用20k覆盖东星斑基因组的snp标记既可保证基因组选择方法有较好的预测准确性，也可适当降低基因分型成本、节约计算耗时。此外，本发明还提供与东星斑抗哈维氏弧菌病相关的snp位点(seqidno.1—seqidno.30任一序列中第36位碱基)(表2)。抗病相关位点的snp编号、染色体编号和物理位置提前整理好存于文件“trait.realted.loci.txt”中，每行一个位点，各信息间使用制表符(tab)进行分隔，文件中内容如下：[0089][0090][0091]在linux环境中运行以下命令：[0092]#挑选均匀覆盖基因组的20ksnp[0093]##使用plink2提取均匀覆盖基因组的20ksnp[0094]plink2‑‑bpfilesnps.imputed‑‑extractcomm.loci.txt‑‑bp-space37267‑‑make-bpgen‑‑outsnps.20k.part1[0095]##使用r整理用于提取最终20ksnp的文件[0096]library(data.table)[0097]bim.p1《-fread(“snps.20k.part1.bim”)[0098]loci.info《-fread(“trait.realted.loci.txt”)[0099]loci.20k《-c(bim.p1$v2,loci.info$snp)[0100]write.table(loci.20k,“snps.20k.txt”,sep＝“\t”,col.names＝f,row.names＝f,quote＝f)[0101]运行后，文件“snps.20k.txt”中包含了20ksnp的编号，该编号可被plink2读取用于提取相应位点。文件均包含了20,000个snp位点，其中包含东星斑抗病相关的snp位点30个，均匀覆盖东星斑参考基因组的snp位点19970个。图3展示了每1m范围内这20ksnp在东星斑基因组上的分布，可看出这些位点基本均匀覆盖了东星斑基因组。[0102]表2：东星斑抗哈维氏弧菌病相关snp位点表[0103][0104]注：m、r、w、y、s和k为简并碱基，分别代表a/c、a/g、a/t、c/t、g/c和g/t。[0105]实施例5：预测东星斑验证个体抗病gebv[0106]1、评价选出的20ksnp标记的预测效果[0107]采用与实施例3中所述相同的模型和交叉验证方法验证实施例4中得到的20ksnp，结果表明：g-blup的预测准确性为0.673，bayescπ的预测准确性为0.682。与实施例4所得结果比较可知，使用本发明所述方法得到的20ksnp能够产生良好的预测效果。[0108]2、使用东星斑验证群体进一步验证本发明所述方法的可行性[0109]将具有抗病表型但未纳入参考群体的个体作为验证个体，使用bayescπ和实施例4中得到的20ksnp估算验证群体的抗病gebv，通过比较存活个体和死亡个体的平均gebv进一步验证本发明所述方法的可行性。linux环境中运行以下命令：[0110][0111][0112]运行后，成功预测了298尾验证群体的抗病gebv，平均gebv为0.314，存活个体和死亡个体的平均gebv如图4所示。其中，存活个体110尾，平均gebv为0.413，高于总体平均gebv；死亡个体188尾，平均gebv为0.255，低于总体平均gebv。由此可知，gebv与个体的抗病力呈正相关关系，gebv高的个体抗病潜力越大，因此可用gebv对个体进行选择，从中挑选出抗病力强的个体用于繁育。当前第1页12当前第1页12