一种凝结芽孢杆菌及其在酒精性肝病的治疗中的应用

1.本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种凝结芽孢杆菌及其在酒精性肝病的治疗中的应用。


背景技术：

2.慢性酒精滥用是肝脏相关疾病进而导致死亡的主要原因。世界卫生组织在《世界酒精与健康状况报告》中估计，2016年约有300万例由酒精性疾病导致的死亡，占全球疾病的5.1％。持续饮酒可导致多种慢性酒精性肝病(ald)，包括酒精性脂肪性肝炎(ash)、酒精性脂肪肝(afl)、酒精性纤维化(af)、酒精性肝炎(ah)、酒精性肝硬化(ac)和肝细胞癌(hcc)。ald可逐渐发展为ash，最终发展为hcc，从而导致死亡。目前ald的治疗主要集中在磷酸二酯酶抑制剂、糖皮质激素、多烯磷脂酰胆碱等。但长期使用这些药物往往会使宿主产生耐药性，并增加感染的风险。到目前为止，还没有药物或治疗方法被批准用于治疗ald患者。因此，迫切需要开发更有效、更安全的治疗或预防ald的方法。
3.大量的动物实验和临床试验表明，某些益生菌已被报道可用于治疗酒精性肝病。益生菌通过降低肠道黏膜通透性和防止肠道细菌移位来调节肠道微生物群，修复与酒精相关的肠道屏障功能障碍。利用益生菌治疗酒精性肝病无疑是一种简单、有效、无副作用的新思路。
4.凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)是一种革兰氏阳性菌，兼性厌氧，非致病性，可以形成芽孢和产生乳酸，具有耐高温、耐酸、耐胆汁等工业特性。已广泛应用于医药、食品、化工等行业。已有研究报道凝结芽孢杆菌可通过调节微生物群组成、宿主免疫和代谢，对急性腹泻、肠易激综合征、抗生素相关腹泻、便秘和结肠炎等肠道疾病有治疗作用。但至今为止，未见有凝结芽孢杆菌治疗酒精性肝病的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种凝结芽孢杆菌及其在酒精性肝病的治疗中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该菌株能够预防和治疗由酒精诱发的酒精性肝病，在酒精性肝病预防和治疗领域具有潜在应用前景。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)fcys01，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctcc no:m 20211273，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2021年10月14日。
8.本发明还提供一种所述凝结芽孢杆菌fcys01在制备预防和/或治疗酒精性肝病药物中的应用。
9.进一步地，所述药物的活性成分为所述凝结芽孢杆菌fcys01。
10.进一步地，所述药物通过如下一种或多种途径预防和/或治疗酒精性肝病：
11.(1)降低酒精肝患者血清中的谷丙转氨酶含量；
12.(2)降低酒精肝患者血清中的谷草转氨酶含量；
13.(3)降低酒精肝患者血清中的髓过氧化物酶含量；
14.(4)降低酒精肝患者血清中的脂多糖含量；
15.(5)降低酒精肝患者肝脏重量；
16.(6)减少酒精肝患者肝脏肿大；
17.(7)降低酒精肝患者肝脏中炎症因子白细胞介素-1β含量；
18.(8)升高酒精肝患者肝脏中抗炎症因子白细胞介素-10含量；
19.(9)降低酒精肝患者肝脏中炎症因子肿瘤坏死因子α含量；
20.(10)降低酒精肝患者肝脏中炎症因子白细胞介素-22含量；
21.(11)降低酒精肝患者肝脏中甘油三脂含量；
22.(12)降低酒精肝患者肝脏组织的空泡含量；
23.(13)降低酒精肝患者肝脏组织的细胞浸润含量；
24.(14)降低酒精肝患者肝脏脂肪含量；
25.(15)恢复酒精肝患者肠道屏障；
26.(16)升高酒精肝患者结肠上皮细胞中连接蛋白occludin蛋白含量；
27.(17)升高酒精肝患者肠道有益菌丰度；
28.(18)降低酒精肝患者肠道有害菌丰度；
29.(19)提高酒精肝患者肠道微生物群落丰富度与多样性。
30.进一步地，在所述药物中，所述凝结芽孢杆菌fcys01的数目为1.0
×
109cfu。
31.进一步地，所述药物还包括与所述凝结芽孢杆菌fcys01相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
32.进一步地，所述其他药类包括与所述凝结芽孢杆菌fcys01相配伍，且不会使所述凝结芽孢杆菌fcys01出现水解以及破坏失效理化反应，同时与凝结芽孢杆菌fcys01协同作用后，能提高凝结芽孢杆菌fcys01治疗酒精性肝病效果的药类。
33.进一步地，所述药物为药学上可接受的剂型。
34.进一步地，所述剂型为粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。
35.本发明公开了以下技术效果：
36.本发明从健康的牛体内分离和筛选获得一株凝结芽孢杆菌，该菌株通过调节降低酒精肝小鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶的表达，降低酒精肝小鼠肝脏组织中促炎因子的表达，降低酒精肝小鼠肝脏组织中甘油三酯的表达，减少脂质积累，降低酒精肝小鼠肝脏中的炎症细胞浸润，修复受损的肝脏组织，提高酒精肝小鼠肠道黏膜蛋白的表达，修复肠道屏障，从而来预防和治疗由酒精诱发的酒精性肝病，是一株在酒精性肝病预防和治疗领域具有潜在应用前景的益生菌新菌株。
附图说明
37.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
38.图1为实施例2中空白组、模型组和fcys01组小鼠肝体比检测结果(**,p《0.01；***,p《0.001)；
39.图2为实施例2中空白组、模型组和fcys01组小鼠肝脏组织he和油红o切片染色结果；
40.图3为实施例2中空白组、模型组和fcys01组小鼠结肠occludin蛋白的表达结果；
41.图4为实施例2中空白组、模型组和fcys01组小鼠肠道内微生物丰度检测结果,其中a图为肠道微生物α多样性中的chao1指数，b图为肠道微生物α多样性中的shannon指数，c图为微生物分类差异结果。
具体实施方式
42.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
43.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
44.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
45.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
46.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
47.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
48.如无特殊说明，实施例中的pbs缓冲液均为ph 7.0、0.1m的pbs缓冲液。
49.固体ypd培养基：含酵母提取物10g/l,蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，琼脂15g/l，溴甲酚紫钠盐0.1g/l，余量为水。液体ypd培养基与固体ypd培养基的区别仅在于不加入琼脂和溴甲酚紫钠盐。
50.7-8周龄雄性spf级c57小鼠，体质量(20
±
2)g：华中农业大学动物中心，动物许可证号：hzaumo-2021-0010。
51.lieber-decarli基础对照液体饲料tp4030c(600ml 40℃左右温水，218.80g主料，0.53g胆碱，2.50g维生素搅拌至均匀液体，定容至1000ml，混匀)和lieber-decarli酒精液体饲料tp4030d(600ml 40℃左右温水，148g主料，0.53g胆碱，2.50g维生素搅拌至均匀液
体，200ml 40℃左右温水中加入50ml无水乙醇，定容至1000ml，混匀)，灌胃用酒精溶液浓度为31.5％(v/v)，灌胃用糊精溶液浓度为45％(w/v)：南通特洛菲饲料科技有限公司。
52.采用南京建成谷丙转氨酶试剂盒(c009-2-1)检测血清中的谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，alt/gpt)含量。采用南京建成谷草转氨酶试剂盒(c009-2-1)检测血清中的谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，ast/gpt)含量。采用江苏酶免小鼠脂多糖酶联免疫试剂盒(mm-0634m1)检测血清中的脂多糖(lipopolysaccharide，lps)含量。采用南京建成总甘油三酯试剂盒(a110-1)检测肝脏中的总甘油三酯(triglyceride，tg)含量。采用江苏酶免小鼠白细胞介素-10酶联免疫试剂盒(mm-0176m1)检测肝脏中的白细胞介素-10(interleukin-10，il-10)含量。采用江苏酶免小鼠白细胞介素-1β酶联免疫试剂盒(mm-0040m1)检测肝脏中的白细胞介素-1β(interleukin-1β，il-1β)含量。采用江苏酶免小鼠白细胞介素-22酶联免疫试剂盒(mm-0892m1)检测肝脏中的白细胞介素-22(interleukin-22，il-22)含量。采用江苏酶免小鼠肿瘤坏死因子α酶联免疫试剂盒(mm-0132m1)检测肝脏中的肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factor-α，tnf-α)含量。采用江苏酶免小鼠髓过氧化物酶酶联免疫试剂盒(mm-0338m1)检测肝脏中的小鼠髓过氧化物酶(myeloperoxidase，mpo)含量。
53.anti-occludin抗体(occludin抗体)、内参anti-beta actin(β-actin)、二抗goat anti-rabbit igg(hrp)为英国abcam公司。
54.实施例1菌株的分离、鉴定和保藏
55.一、菌株的分离
56.从四川省德阳市绵竹市新开村的牛场进行样本取材，所取样本为牛新鲜粪便。
57.样本经固体ypd培养基平板反复划线培养，挑取产黄圈的单菌落接种于固体ypd培养基平板上继续培养，再经固体ypd培养基平板反复划线培养纯化，得到多株纯培养菌株。
58.从纯培养的菌株中筛选革兰氏染色阳性菌株接种至液体ypd培养基培养，然后加入20％甘油，-80℃冰箱保存。
59.二、菌株的鉴定
60.将分离得到的各个菌株进行形态鉴定、生理生化鉴定以及分子鉴定，其中菌株fcys01属于凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)。
61.菌株fcys01的形态鉴定、生理生化鉴定结果：革兰氏阳性，产芽孢，菌体短杆状，两端钝圆，单个、成对或链状排列生长；芽孢耐受高温；水解淀粉，具纤维素酶活性，无蛋白酶活性，发酵葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖、山梨醇、阿拉伯糖、麦芽糖产酸。
62.菌株fcys01在液体ypd培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
63.菌株fcys01的最适生长温度为37～45℃，适宜ph为6.6～7.0。
64.菌株fcys01的16s rdna(seq id no.1)序列如下所示：
65.gcgatgcgcgtggctaatactgcaggttcgttgcggaccttttaaagcttgcttttaaaaggttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaagatcgggataacgccgggaaaccggggctaataccggatagttttttcctccgcatggaggaaaaaggaaagacggcttctgctgtcacttacagatgggcccgcggcgcattagctagttggtggggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggccttcgggtcgtaaaactctgttgccggggaagaacaagtgccgttcgaacagggcg
gcgccttgacggtacccggccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggcttcttaagtctgatgtgaaatcttgcggctcaaccgcaagcggtcattggaaactgggaggcttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacctccctggagacagggccttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgaccttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagggctgcgagaccgcgaggttaagccaatcccagaaaaccattcccagttcggattgcaggctgcaacccgcctgcatgaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggaggtaacctttacgaaccaccgccgaaggacaagt。
66.三、菌株的保藏
67.凝结芽孢杆菌fcys01(bacillus coagulans)fcys01，已于2021年10月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为cctcc no:m 20211273。
68.实施例2凝结芽孢杆菌fcys01对酒精性肝病小鼠的治疗效果
69.一、菌悬液的制备
70.菌悬液的制备方法：用pbs缓冲液悬浮供试菌，使菌浓度为1.0
×
109cfu/200μl。
71.供试菌为凝结芽孢杆菌fcys01，得到的菌悬液命名为fcys01菌悬液。
72.二、分组处理方式
73.45只雄性c57小鼠，随机分成3组，每组15只，分组处理如下：
74.空白组：从试验开始至结束均采用lieber-decarli基础对照液体饲料饲喂；从试验第8天开始至第15天，给予无菌pbs缓冲液(给予方式：灌胃，给予量：200ul/每只/每天)；第16天，给予45％(w/v)糊精溶液(给予方式：灌胃，给予量：每只小鼠灌胃溶液的体积(μl)＝体重(g)
×
20)；
75.模型组：从试验开始至第4天采用lieber-decarli基础对照液体饲料饲喂，从第5天至结束均采用lieber-decarli酒精液体饲料饲喂；从试验第8天开始至第15天，给予无菌pbs缓冲液(给予方式：灌胃，给予量：200ul/每只/每天)；第16天，给予31.5％(v/v)酒精溶液(给予方式：灌胃，给予量：每只小鼠灌胃溶液的体积(μl)＝体重(g)
×
20)；
76.凝结芽孢杆菌fcys01组(简称fcys01组)：从试验开始至第4天采用lieber-decarli基础对照液体饲料饲喂，从第5天至实验结束均采用lieber-decarli酒精液体饲料饲喂；从试验第8天开始至第15天，给予fcys01菌悬液(给予方式：灌胃，给予量：200ul/每只/每天)；第16天，给予31.5％(v/v)酒精溶液(给予方式：灌胃，给予量：每只小鼠灌胃溶液的体积(μl)＝体重(g)
×
20)；
77.试验开始至结束为试验第1天至第16天。
78.三、血清相关指标检测
79.实验第16天早上8点fcys01组、模型组灌胃31.5％(v/v)酒精溶液，对照组灌胃45％(w/v)糊精溶液，灌胃9小时后从眼眶取血，血液4℃、3000r/min离心15min，收集血清。
80.检测血清中谷丙转氨酶(alt/gpt)、谷草转氨酶(ast/gpt)、脂多糖(lps)浓度。
81.谷丙转氨酶(alt/gpt)、谷草转氨酶(ast/gpt)、脂多糖(lps)的检测结果见表1。
82.表1血清中alt、ast、lps浓度检测结果
83.组别alt(u/g)ast(u/g)lps(ng/g)空白组0.11
±
0.040.21
±
0.041.64
±
0.40模型组0.45
±
0.09****0.34
±
0.06**2.41
±
0.54***fcys01组0.28
±
0.07###0.22
±
0.08#1.68
±
0.43###
84.注：#或*，p《0.05；##或**,p《0.01；###或***,p《0.001；####或****,p《0.0001。
85.与空白组相比，模型组小鼠血清中alt、ast、lps水平均有显著升高，与模型组相比，fcys01组小鼠血清中alt、ast、lps水平显著降低，说明凝结芽孢杆菌fcys01能明显改善酒精性肝病模型小鼠的血清中alt、ast、lps水平，预防肝病的发生。
86.四、肝脏相关指标检测
87.实验第16天取完血清后，处死并解剖小鼠，收集肝脏。称取完整肝脏重量并记录计算小鼠的肝体比。
88.检测肝脏中总甘油三酯(tg)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素10(il-10)、白细胞介素22(il-22)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、髓过氧化物酶(mpo)的含量。
89.小鼠的肝体比检测结果见图1。ctrl为空白组，etoh为模型组，fcys01为fcys01组。与空白组相比，模型组小鼠的肝体比均有显著升高，与模型组相比，fcys01组小鼠的肝体比显著降低，说明凝结芽孢杆菌fcys01能明显改善酒精性肝病模型小鼠的肝肿大，预防肝病的发生。
90.总甘油三酯(tg)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素10(il-10)、白细胞介素22(il-22)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、髓过氧化物酶(mpo)的检测结果见表2。
91.表2肝脏中tg、il-1β、il-10、il-22、tnf-α、mpo含量检测结果
[0092][0093]
与空白组相比，模型组小鼠的总甘油三酯(tg)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素22(il-22)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、髓过氧化物酶(mpo)均有显著升高，与模型组相比，fcys01组小鼠的肝体比总甘油三酯(tg)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素22(il-22)、肿
瘤坏死因子α(tnf-α)、髓过氧化物酶(mpo)显著降低。与空白组相比，模型组小鼠的白细胞介素10(il-10)显著降低，与模型组相比，fcys01组小鼠的白细胞介素10(il-10)显著升高。说明凝结芽孢杆菌fcys01对酒精肝模型病理变化中il-1β、il-22、tnf-α等炎症因子产生抑制作用，对抗炎因子il-10有促进作用，对细胞因子tg有抑制作用，对细胞浸润因子髓过氧化物酶有抑制作用，从而抑制或减缓酒精性肝病的形成。
[0094]
五、组织形态学观察
[0095]
实验第16天取完血清后，处死并解剖小鼠，收集肝脏。将肝脏切片，进行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，he)染色和油红o(oil red o)染色，光学显微镜观察肝脏病变，400
×
显微照相。
[0096]
小鼠肝脏组织he和油红o切片染色结果见图2。ctrl为空白组，etoh为模型组，fcys01为fcys01组。空白组小鼠肝脏细胞形态正常，肝小叶结构完整，未见肝细胞变性、坏死或炎性细胞浸润，未见明显脂质沉积；模型组小鼠肝脏细胞变性，体积增大，胞浆内充满气球样的脂肪空泡，发生显著性的脂质沉积；fcys01组小鼠肝脏细胞形态趋于正常，与模型组相比脂质沉积明显改善。以上he和油红o切片染色结果提示，酒精饲料能够引起肝脏脂质累积，肝细胞变性，体积增大，胞浆出现脂肪空泡，产生炎性细胞浸润，最终导致酒精性肝病；凝结芽孢杆菌fcys01可以减少脂肪空泡的形成，减少肝脏脂肪的沉积，缓解肝细胞变性，最终缓解小鼠酒精性肝病的进程。
[0097]
六、western blotting蛋白印记检测
[0098]
实验第16天取完血清后，处死并解剖小鼠，收集结肠，按照bca蛋白定量试剂盒说明书的方法提取总蛋白，采用western blot法检测结肠occludin蛋白的表达情况。
[0099]
western blot检测蛋白表达结果见图3。与空白组相比，模型组小鼠结肠中的occludin的表达量显著降低；与模型组相比，fcys01组小鼠结肠中的occludin的表达量显著升高，且与空白组中的表达量趋于一致。
[0100]
western blot检测结果表明：酒精饮食能够下调肠道连接蛋白occludin的表达；凝结芽孢杆菌fcys01能够恢复酒精饮食引起的连接蛋白occludin的下调，说明凝结芽孢杆菌fcys01可能通过修复肠道屏障，从而预防与治疗酒精引起的肝损伤。
[0101]
七、有益菌和有害菌丰度检测
[0102]
实验第16天取完血清后，处死并解剖小鼠，收集盲肠内容物，液氮速冻，dna提取及高通量测序由北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行。通过标准细菌16s v3-v4区域进行各组小鼠肠道内微生物多样性检测。
[0103]
16s微生物多样性检测结果见图4。与正常组相比，模型组的肠道微生物α多样性中的chao1指数显著降低；与模型组相比，fcys01组的肠道微生物α多样性中的chao1指数与shannon指数显著的升高。证明补充凝结芽孢杆菌fcys01可增强肠道微生物群落的丰富度(图4a)和多样性(图4b)。与空白组相比，模型组小鼠盲肠内容物中的有害菌escherichia-shigella的含量显著升高，有益菌akkermansia和lachnospiraceae的含量显著降低；与模型组相比，fcys01组小鼠盲肠内容物中的escherichia-shigella的含量显著降低，有益菌akkermansia和lachnospiraceae的含量显著升高，且与空白组中的表达量趋于一致。
[0104]
16s微生物多样性检测结果表明：酒精饮食能够上调肠道中有害菌的含量，下调有益菌的含量；凝结芽孢杆菌fcys01能够提高肠道微生物群落的丰富度和多样性，恢复酒精
饮食引起的有害菌含量的上调，有益菌的含量的下调，说明凝结芽孢杆菌fcys01可能通过恢复肠道菌群，从而预防与治疗酒精引起的肝损伤。
[0105]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。