一种类器官基质胶微球及其制备方法和应用

1.本发明涉及类器官技术领域，具体是一种类器官基质胶微球及其制备方法和应用。


背景技术：

2.类器官是一种三维的细胞培养体系，它能够模拟人体或动物器官的部分结构和功能特征。与传统的二维细胞培养或非灵长类动物模型相比，类器官培养体系克服了标准单层癌细胞培养的许多局限性，使得我们能够在体外研究器官层次的生物学模型，而且这种培养更接近于人体的实际生理环境。重要的是，类器官培养尤其肿瘤类器官培养再现了肿瘤的形态和生物学特性，为癌症研究、药物研发和精准医学提供了有价值的新工具。
3.经典的类器官技术，都是将培养类器官的细胞与基质胶在低温下混合后，接种到细胞培养板中，再置于37℃的培养环境中，通过基质胶的温敏特性形成凝胶化反应，将细胞包埋到基质胶中，基质胶提供了细胞三维的培养环境。该技术的最大问题是，由于用细胞培养板培养，难以实现类器官的规模化制备，无法满足药物高通量筛选的需求。
4.为此，有研究者将微流控技术引入到类器官球培养中，cn110004111a公开了一种类器官球体的制备方法，先在低温环境下(4℃)以保持基质胶溶胶状态，将溶胶状态的基质胶作为水相，借助管路微流控，形成油包水液滴，再将液滴管路转移到37℃，直到基质胶液滴凝固成凝胶球，从而制备出形状大小均一、可规模化的类器官球。
5.但是，该技术在实际应用中存在最大问题是：基质胶虽然是温敏型水凝胶，但从溶胶向凝胶转化需时比较长，温度升到37℃至少需要30分钟才能形成凝胶态。因此，微流控技术在低温环境下形成单分散的油包水液滴后，该液滴需要转换到37℃环境下，且还需要继续在管路中维持油包水液滴的单分散状态至少30分钟，待基质胶形成凝胶后才能离开微通道管路进入收集区。否则会导致水相聚集成大颗粒。这就导致在37℃环境中，形成单分散液滴的管路需要较长，既不影响原管路的流速，还要保证足够长时间完成基质胶的凝胶化反应。


技术实现要素：

6.为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种类器官基质胶微球及其制备方法和应用，本发明的制备过程不需要微流控较长的管路，极大节省了设备和工艺加工成本；同时可以更好地保持细胞活性。
7.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
8.一种类器官基质胶微球的制备方法，所述的制备方法利用海藻酸盐水凝胶材料的凝胶-溶胶转化特性，通过微流控管道，先将含有细胞的基质胶液滴分散包埋在海藻酸盐凝胶中，然后将包埋有基质胶液滴的海藻酸盐凝胶在30-40℃条件下孵育，待基质胶液滴固化形成基质胶凝胶球后，加入能够去除海藻酸盐凝胶中的离子交联剂的螯合剂溶液将海藻酸盐凝胶液化，除去液体，经清洗后获得基质胶微球，进一步培养后获得类器官基质胶微球。
9.进一步地，所述的离子交联剂为二价阳离子或者三价阳离子，二价阳离子包括ca
2+
、cu
2+
、fe
2+
、sr
2+
、zn
2+
和ba
2+
，三价阳离子包括fe
3+
、ga
3+
。
10.进一步地，所述的螯合剂包括柠檬酸钠和edta。
11.进一步地，所述的细胞包括原代细胞、永生化细胞系和干细胞来源的细胞。
12.进一步地，所述的微流控管路包括所有适合内部凝胶化反应制备出海藻酸钠液滴的微流控管路，包括“t”型管路(monodisperse alginate hydrogel microbeads for cell encapsulation，adv.mater.2007,19,2696
–
2701；alginate gelation in microfluidic channels，food hydrocolloids 22(2008)97
–
104)、“回”型管路(microfluidic encapsulation of single cells by alginate microgels using a trigger-gellified strategy，frontiers in bioengineering and biotechnology，2020，8，583065)、“十”型管路(using a microfluidic chip and internal gelation reaction for monodisperse calcium alginate microparticles generation，frontiers in bioscience2007，12,3061-3067)、“y”型及多“y”组合型管路(monodisperse hybrid microcapsules with an ultrathin shell of submicron thickness for rapid enzyme reactions，j.mater.chem.b,2015,3,796
–
803)以及不同形状的组合管路等。
13.进一步地，所述的类器官包括头颈类器官、甲状腺类器官、乳腺类器官、胰腺类器官、肝脏类器官、胸腺类器官、肺类器官、肾类器官、胃类器官、肠道类器官、脑类器官及上述各脏器的肿瘤类器官。
14.进一步地，所述的将含有细胞的基质胶液滴分散包埋在海藻酸盐凝胶中的方法包括外部凝胶化和内部凝胶化。
15.进一步地，外部凝胶化的具体过程包括如下步骤：
16.(1)配制终浓度为5-50mg/ml海藻酸盐溶液；
17.(2)将商品化基质胶溶液与细胞在1-4℃环境下混合均匀，细胞含量为10
2-107个/ml；
18.(3)将步骤(2)制备的载细胞的基质胶溶液作为分散相，步骤(1)配制的海藻酸盐溶液作为流动相，通过微流控管路，在1-4℃环境下，分散相溶液以液滴的形式均匀分散到流动相溶液中，再通过无菌空气断裂流动相液体柱，流入含有海藻酸盐离子交联剂的收集器中，获得包埋有载细胞的基质胶液滴的海藻酸盐凝胶；
19.或者，先将步骤(2)制备的载细胞的基质胶溶液作为分散相，液体石蜡作为流动相，通过微流控管路，在1-4℃环境下，将基质胶溶液均匀分散到液体石蜡中，形成载有基质胶液滴的液体石蜡(油包水液滴)，再以载有基质胶液滴的液体石蜡作为新的分散相，以步骤(1)配制的海藻酸盐溶液作为新的流动相，将载有基质胶液滴的液体石蜡均匀分散到海藻酸盐溶液中，形成w/o/w乳液，再通过无菌空气断裂流动相液体柱，进入含有海藻酸盐离子交联剂的收集器中，获得包埋有载细胞的基质胶液滴的w/o/w的海藻酸盐凝胶。
20.进一步地，内部凝胶化的具体过程包括如下步骤：
21.(1)配制0.01-0.2m的难溶性钙盐溶液；
22.(2)使用步骤(1)的溶液配制终浓度为5-50mg/ml海藻酸盐溶液；
23.(3)将冰醋酸按照体积比1:10-1:10000均匀分散到液体石蜡中；
24.(4)将商品化基质胶溶液与细胞在1-4℃环境下混合均匀，细胞含量为10
2-107个/
ml；
25.(5)通过微流控装置，先将步骤(4)制备的载细胞的基质胶溶液作为分散相，步骤(2)制备的含有难溶性钙盐的海藻酸盐溶液为流动相，在1-4℃环境下将基质胶溶液均匀分散到流动相中，获得内部均匀分散有基质胶液滴的海藻酸盐+难溶性钙盐溶液；
26.(6)通过微流控装置，再以步骤(5)制备的内部均匀分散有基质胶液滴的海藻酸盐+难溶性钙盐溶液作为新的分散相，以步骤(3)制备的含有冰醋酸的液体石蜡作为新的流动相，将新的分散相分散到流动相中，形成o/w/w乳液液滴或液泡，分散相中海藻酸盐凝胶化形成海藻酸盐凝胶球或海藻酸盐凝胶泡，进入含有海藻酸盐离子交联剂的收集器中，获得海藻酸盐凝胶。
27.进一步地，所述难溶性钙盐为edta钙、碳酸钙、柠檬酸钙、草酸钙、酒石酸钙、磷酸钙中的一种或二种以上。
28.本发明另一方面提供上述的制备方法制得的类器官基质胶微球。
29.进一步地，所述类器官基质胶微球的粒径为50-800μm。
30.进一步地，所述类器官基质胶微球中的细胞载量为10-107个细胞/类器官球。
31.本发明还提供上述的类器官基质胶微球在药物高通量筛选中的应用。
32.本发明的有益效果：
33.(1)本发明利用海藻酸盐快速形成凝胶的特点，由于海藻酸盐溶液与二价阳离子(如ca2+、cu2+、fe2+、sr2+、zn2+和ba2+)或者三价阳离子(如fe3+、ga3+)，可瞬间发生离子交联形成水凝胶，且不受温度限制(在1-37℃范围内均可瞬间发生)，本发明将基质胶液滴先分散进入流动相(海藻酸盐溶液)后，立即进入收集区瞬间形成海藻酸盐凝胶，凝胶中分散包埋基质胶液滴，由海藻酸盐凝胶作为包埋基质胶液滴的载体，可以非常方便的将海藻酸凝胶载体放置在37℃细胞培养箱中，静态等待基质胶溶液转变成基质胶凝胶球，然后通过柠檬酸钠溶液液化海藻酸钙，得到类器官基质胶微球；整个制备过程不需要微流控较长的管路，极大节省了设备和工艺加工成本；同时可以更快将制备出凝胶后转移到培养箱中，可更好地保持细胞活性。
34.(2)本发明利用的是海藻酸盐的瞬间凝胶化反应过程及在生理条件下又可液化成溶液的过程，整个凝胶-溶胶的制备转化过程均在生理条件下完成，不影响细胞的生物学活性，因此，该发明可实现原位载细胞制备。
附图说明
35.为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
36.图1本发明实施例1中管路微流控装置示意图。
37.图2本发明实施例1中基质胶凝胶微球制备示意图。
38.图3本发明实施例2中管路微流控装置示意图。
39.图4本发明实施例3中管路微流控装置示意图。
具体实施方式
40.以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
41.实施例1
42.下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
43.一种载乳腺癌细胞类器官基质胶微球的制备方法，包括以下步骤：
44.(1)配制终浓度为20mg/ml海藻酸钠溶液；
45.(2)将商品化基质胶溶液与原代分离的乳腺癌细胞在4℃环境下均匀混合，细胞含量为106/ml。
46.(3)将步骤(2)制备的载细胞的基质胶溶液作为分散相，步骤(1)配制的海藻酸钠溶液作为流动相，通过附图1的微流控管路，在4℃环境下，分散相溶液以液滴的形式均匀分散到流动相溶液中，再通过无菌空气断裂流动相液体柱，流入含有0.1m氯化钙的收集器中，获得包埋有载细胞的基质胶液滴的海藻酸钙凝胶棒；
47.(4)将步骤(3)制备的海藻酸钙凝胶棒收集，按照附图2所示流程，将海藻酸钙凝胶棒转移到细胞培养皿中，在37℃细胞培养箱中孵育30分钟，使得其中包埋的基质胶液滴固化成基质胶凝胶球，然后再使用柠檬酸钠溶液液化海藻酸钙凝胶棒，液化反应10分钟，待凝胶棒完全液化后，离心去除柠檬酸钠溶液，pbs清洗3次，离心并收集粒径在300微米的载细胞基质胶水凝胶微球。
48.(5)将步骤(4)获得的基质胶水凝胶微球在类器官培养基中培养30天，获得乳腺癌类器官基质胶微球。
49.实施例2
50.一种载肾癌细胞类器官基质胶微球的制备方法，包括以下步骤：
51.(1)配制终浓度为15mg/ml海藻酸钠溶液；
52.(2)将商品化基质胶溶液与原代分离的肾癌细胞在4℃环境下均匀混合，细胞含量为5
×
105/ml。
53.(3)按照附图3的微流控装置，先将步骤(2)制备的载细胞的基质胶溶液作为分散相，液体石蜡作为流动相，在4℃环境下，将基质胶溶液均匀分散到液体石蜡中，形成油包水液滴；
54.(4)按照附图3的微流控装置，再以步骤(3)制备的载有基质胶液滴的液体石蜡作为新的分散相，以步骤(1)配制的海藻酸钠溶液作为新的流动相，将载有基质胶液滴的液体石蜡均匀分散到海藻酸钠溶液中，形成w/o/w乳液，再通过无菌空气断裂流动相液体柱，进入含有0.1m氯化钙的收集器中，获得包埋有载细胞的基质胶液滴的w/o/w的海藻酸钙凝胶棒；
55.(5)将步骤(4)制备的海藻酸钙凝胶棒收集，参考附图2所示流程，将海藻酸钙凝胶棒转移到细胞培养皿中，在37℃细胞培养箱中孵育30分钟，使得其中包埋的基质胶液滴固化成基质胶凝胶球，然后再用柠檬酸钠溶液液化海藻酸钙凝胶棒，液化反应10分钟，待凝胶棒完全液化后，离心去除柠檬酸钠溶液和液体石蜡，pbs清洗3次，离心并收集粒径在200微米的载细胞基质胶水凝胶微球；
56.(6)将步骤(5)获得的基质胶水凝胶微球在类器官培养基中培养30天，获得肾癌类器官基质胶微球。
57.实施例3
58.一种载大肠癌细胞类器官基质胶微球的制备方法，包括以下步骤：
59.(1)配制0.1m的edta钙溶液；
60.(2)用步骤(1)的溶液配制终浓度30mg/ml海藻酸钠溶液；
61.(3)将冰醋酸按照体积比1:100均匀分散到液体石蜡中；
62.(4)将商品化基质胶溶液与原代分离的大肠癌细胞在4℃环境下均匀混合，细胞含量为2
×
105/ml；
63.(5)按照附图4的微流控装置，先将步骤(4)制备的载细胞的基质胶溶液作为分散相，步骤(2)制备的含有edta钙的海藻酸钠溶液为流动相，在4℃环境下将基质胶溶液均匀分散到流动相中；
64.(6)按照附图4的微流控装置，再以步骤(5)制备的包埋有均匀分散基质胶液滴的海藻酸钠+edta钙溶液作为新的分散相，以步骤(3)制备的含有冰醋酸的液体石蜡作为新的流动相，将新的分散相分散到流动相中形成o/w/w乳液液滴或液泡；
65.(7)在步骤(6)的乳液液滴或液泡，冰醋酸的h
+
可自由扩散到分散相中，引发分散相里edta钙中ca
2+
释放，在分散相中通过内部凝胶化形成海藻酸钙凝胶球或海藻酸钙凝胶泡，进入含有0.1m氯化钙的收集器中，获得包埋有载细胞的基质胶液滴的海藻酸钙凝胶球或凝胶泡；
66.(8)将步骤(7)制备的海藻酸钙凝胶球或凝胶泡收集，参考附图2所示流程，将海藻酸钙凝胶球或凝胶泡转移到细胞培养皿中，在37℃细胞培养箱中孵育30分钟，使得其中包埋的基质胶液滴固化成基质胶凝胶球，然后再用柠檬酸钠溶液液化海藻酸钙凝胶球或凝胶泡，液化反应15分钟，待凝胶完全液化后，离心去除柠檬酸钠溶液，pbs清洗3次，离心并收集粒径在300微米的载细胞基质胶水凝胶微球。
67.(9)将步骤(8)获得的基质胶水凝胶微球在类器官培养基中培养30天，获得大肠癌类器官基质胶微球。
68.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。