一种青稞矢车菊素鼠李糖基转移酶基因及其用途

no.2所示。
10.进一步地，上述方法包括如下步骤：
11.(1)去权利要求3所述的重组菌，活化，得菌液；
12.(2)将菌液接种到lb培养基中培养，3～4h后，加入iptg诱导剂诱导培养，收集菌体；
13.(3)破菌，离心，取上清，纯化，即可。
14.本发明提供了一种生产矢车菊素3-o-鼠李糖苷的转基因植物的构建方法，其特征在于：取权利要求1所述的基因片段，转入植物中，获得表达氨基酸序列如seq id no.2所示的蛋白的植株，即可。
15.进一步地，上述转入植物的方法是农杆菌法、基因枪法、电转法、peg介导法、脂质体法和磷酸钙-dna共沉淀法中的一种；所述植物为烟草。
16.本发明还提供了上述基因片段、重组载体、重组菌在制备高产矢车菊素3-o-鼠李糖苷的青稞品种的用途。
17.上述的基因片段、重组载体、重组菌在制备矢车菊素3-o-鼠李糖苷的试剂中的用途。
18.本发明还提供了青稞矢车菊素鼠李糖基转移酶在制备矢车菊素3-o-鼠李糖苷的试剂中的用途；所述青稞矢车菊素鼠李糖基转移酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
19.本发明发现了青稞中的一种新的基因：青稞矢车菊素鼠李糖基转移酶基因，该基因表达的蛋白可以将矢车菊素3-o-葡萄糖苷转化为矢车菊素3-o鼠李糖苷，从而不仅增加了花青素的稳定性，也增加花青素在溶液中的溶解度，更有利于人体吸收，提高生物利用度；本发明还以该基因片段进行体外表达，获得了青稞矢车菊素鼠李糖基转移酶，在体外反应中，成功地将葡萄糖作为糖基供体，矢车菊素3-o-葡萄糖苷作为受体，制备得到了矢车菊素3-o鼠李糖苷；本发明还将该基因转移到烟草中，使得烟草植株中也表达矢车菊素糖基转移酶，进一步产生矢车菊素3-o鼠李糖苷，提高其保健价值。本发明提供的新的基因，及其重组载体、重组菌、转基因植物均具有良好的应用前景。
20.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
21.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
22.图1为hovusg1651900蛋白的sds-page电泳图，marker：100,70,55,40,35,25kda。
23.图2为体外催化反应的lc-ms/ms图。
24.图3为转基因植物提取物中阿魏酰色胺的质谱图。
具体实施方式
25.本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
26.实施例1、青稞矢车菊素鼠李糖基转移酶基因(hovusg1651900基因)的分离以及原
核表达
27.本实施例主要是hovusg1651900基因获得、载体构建及原核表达的方法。
28.(1)基因片段和载体的构建
29.称取2克青稞新鲜叶片，提取青稞rna，用thermo fisher公司的m-mlv reverse transcriptase合成cdna，设计引物，如下：
30.f:atggatgccatggtacacgt
31.r:ctagtcttcagtaattctgggcttcaga
32.进行pcr扩增，得到目的条带大小的片段(结果如图1所示)。pcr产物用胶回收试剂盒(gel extraction kit d2500-02，omega)纯化。
33.扩增得到的目的片段hovusg1651900基因的核苷酸序列(seq id no.1)为：
34.atggatgccatggtacacgtcctcgtgttcccctggccaaggcaaggacacatcaaccccatgctccattttgccaccgccctcgctgacgccggcgtccaagtcacctttcttcacactgagaacaaccttcgccgtcttgccgaggcgcctctgccgccacgcctacgcttgctttccatccccgacggcctccccgacgaccacccccgcagcttcttggagctcctggagtccatgtgcacgagtagcagcgtggcgtaccgtgccctgctctctgccgccgccacgccggtgacatgcgttgtcgccgacagcaccatgccattcgccattgacgtcgccgaggagcttggcatcccggcgctcgccttcgccacgcacagcgcctgcagctacctggcgctcctgtctatgcccaagctcgttgagcttggtgagacccccttccccacggacgaccctgtgtacggcgttccggggatggagggcttcctccggcgccgagatcttcctcgtggactctattgtgctcaacgaggggacagagacccctggatgctcaagcttgccgaggtcaccgcccgttctagcaaggcatgtgcgatcatactcaacacagccacgtccatggagcagccagcgctcgcccacattgcgtcgcacacaagcgatgtcttcgccataggtccactgcatgccaggtcaaggctcaccacaagcgcaagcctgtggcaggacgaagatgggtgcatggcgtggctggacagccacgcggaccggtccgtcgtgtacgtgagcctggggagccgcgcggtgatcacgcacgaacagttcactgagttcctctccggcctgttagctactggttacgccttcctctgggtgctccgtccagacatggtccagatgaccagctccgcgctcctccgagaagccatagtggcagtggtggacggcaaggcacacatcgtcgagtgggctcctcagctggacgtgctgcagcacagggcggtgggctgcttcctgacgcatgctggatggaactcgacactggagtgcgccctgcagggcgtgccgatggtgtgctggcccttcttctccgaccagcagatcaacggccgcttcgtgggtgccgtgtggaggacgggcctggacatgaaggacgtctgtaacagaggcgtcgtggagaggacggtgagggaggccatggtgtctgacgagatcagaggggtggcccaagccatggcgcagcagttgaggctggatgtcatggaggcggggtcgtcgtcgtccgagttggagcggctcgtccgcttcatcaaggagcttagcatcaggtcctgtctgaagcccagaattactgaagactag
35.前述核苷酸序列所述的hovusg1651900基因可以通过采用上述方法获得，也可以直接进行合成。
36.得到的基因片段转入载体pgex-6p-1中，后重组载体转入transetta(de3)菌株中，得到含有目的片段的重组菌株。
37.(2)基因的表达
38.1.pcr检测阳性克隆，抽提质粒测序。
39.2.将测序正确的质粒载体热击转化大肠杆菌transeta(de3)，抗性cn。
40.3.早上9点随机挑取2个正常大小克隆于5ml含有amp的lb培养基中，37℃摇至下午4点。选其中一个，将4ml活化菌液(浓度为1
×
106～107cfu/ml)按照1:50比例转接到200ml大瓶lb培养基中，大摇床37℃培养，转速200rpm。3～4小时后，200ml培养基中加入2ul 1m iptg诱导剂。20℃，160rpm条件下诱导过夜。剩余1ml菌液用来保菌。
41.4.第二天早上8点收集菌体。500ml离心瓶，4000rpm离心10min即可。
42.5.50ml lysis buffer重悬菌体，涡旋混匀，转入50ml离心管中，分别加入50ul pmsf,10ulβ-巯基乙醇，混匀放置冰上。
43.6.采用高压破碎仪进行大肠杆菌细胞破碎实验。
44.7.破碎完成后样品，取20ul作为总蛋白样品。再取1ml样品4℃，13000rpm离心10min，取20ul上清作为上清液样品。加入等体积2*loading buffer，煮沸5min,sds-page电泳检测蛋白表达情况。剩余上清可暂冻存于-20℃冰箱。剩余未离心样品可冻存于-80℃冰箱。
45.8.sds-page电泳完毕，加入考马斯亮蓝染色液，微波炉煮沸1min后染色半小时，加入脱色液脱色。每隔1h换一次脱色液，直至蛋白条带清晰，转至清水中。
46.9.gst标签融合蛋白纯化。将破碎未离心的所有样品离心，上清与1ml树脂在4℃混匀仪上混合3h。混匀结束后，将混合液穿过层析柱，穿流2次效果更佳。先用预冷的lysis buffer冲洗树脂(glutathione sepharosetm 4b，ge公司)，同时流出液用bradford assay检测，直至不变蓝色表示杂蛋白冲洗干净。然后，用15mmol/l还原型谷胱甘肽溶液(0.09g溶解于20ml lysis buffer)洗脱目的蛋白，每次加入1ml,层析柱底部用1.5ml的离心管收集，每管约1ml，分别记为e1、e2、e3、e4、e5、e6，直至bradford assay检测洗脱液中不含蛋白。未用完的还原型谷胱甘肽溶液继续全部洗脱树脂，然后分别用lysis buffer，ddh2o 20％乙醇冲洗，保存于20％乙醇中。
47.10.收集的蛋白用sds-page检测，得到76kda的条带(图1)，gst标签的分子量为26kda，剩余目的蛋白的分子量为50kda，与氨基酸计算的分子量相同，说明本发明制备得到了带有gst标签的目的蛋白。
48.目的蛋白(hovusg1651900蛋白，即青稞矢车菊素鼠李糖基转移酶)的氨基酸序列(seq id no.2)如下：
49.mdamvhvlvfpwprqghinpmlhfataladagvqvtflhtennlrrlaeaplpprlrllsipdglpddhprsflellesmctsssvayrallsaaatpvtcvvadstmpfaidvaeelgipalafathsacsylallsmpklvelgetpfptddpvygvpgmegflrrrdlprglycaqrgdrdpwmlklaevtarsskacaiilntatsmeqpalahiashtsdvfaigplharsrlttsaslwqdedgcmawldshadrsvvyvslgsravitheqfteflsgllatgyaflwvlrpdmvqmtssallreaivavvdgkahivewapqldvlqhravgcflthagwnstlecalqgvpmvcwpffsdqqingrfvgavwrtgldmkdvcnrgvvertvreamvsdeirgvaqamaqqlrldvmeagsssselerlvrfikelsirsclkprited。
50.实施例2、转基因烟草的构建
51.①
将含有目标基因的瞬时表达载体(瞬时表达载体peaq，来自john innes centre)转化农杆菌(eha105)；
52.②
挑取阳性农杆菌克隆于500ul含有相应抗生素(kn)的lb中，培养20-24小时；
53.③
转接200ul于5ml含有相应抗生素(kn)的lb中，28℃摇床220rpm至od＝2.0左右。
54.④
10000rpm常温离心2min收集菌体，用提前配制转化缓冲液进行菌体的重悬，摇床震荡3h；缓冲液工作液成分以及浓度如下：10mm mes(ph5.7)，10mm mgcl2，100μudp-葡萄糖。
55.⑤
拿准备好的1ml的注射器，去掉针头，选取出口光滑的注射器吸入菌液，取1月龄
的本氏烟草(nicotiana benthamiana)，用手按住叶片，从叶片反面注射，使农杆菌渗透进去。给每株打过的烟草做好标记，可在叶片上圈出农杆菌渗透的区域，并选取转化缓冲液打烟草做对照。
56.⑥
注射了农杆菌的烟草黑暗培养24h，然后移至烟草培养箱中光照培养24-48小时即可取样(注意打过的烟草不可直接在叶片上喷洒水)。
57.以下通过试验例的方式来说明本发明的有益效果：
58.试验例1、hovusg1651900蛋白的酶活检测
59.1.方法
60.1.1hovusg1651900蛋白的获取
61.实施例1方法制备得到的分子量76kda的、带有gst标签的目的蛋白。
62.1.2酶活检测
63.在tris-hcl缓冲液(100mm，ph 7.4)中，以含有200μm矢车菊素3-o葡萄糖苷作为糖基受体、100μm udp-葡萄糖为糖基供体和500ng纯化蛋白的总体积100μl进行体外糖基转移酶测定。孵育10min后，加入300μl冰冷甲醇，停止反应。然后将反应混合物通过0.2μm的过滤器(微孔)过滤，然后用于lc-ms分析。
64.2.结果
65.经过上述催化反应后，我们将产物通过lc-ms/ms，显示生成的物质是矢车菊素3-o-鼠李糖苷(图2)。说明本发明hovusg1651900蛋白具有催化车菊素3-o葡萄糖苷化转换为矢车菊素3-o-鼠李糖苷的能力，市场应用前景良好。
66.试验例2、转基因烟草生产矢车菊素3-o-鼠李糖苷
67.1.方法
68.1.1转基因烟草的构建
69.按照实施例2构建。
70.1.2产物收集和纯化
71.剪取农杆菌渗透区域的叶片，放在已称重的装有钢珠的ep管中，做好标记，迅速放置液氮中，进行冻干。冻干后的样本，利用研磨仪(mm400,retsch)在30hz条件下研磨60s，将研磨好的样本粉末装入2mlep管内。用电子天平称取每个ep管的重量并记录；将已研磨好的样本取适量(范围30-60mg)于ep管中，称量并记录，算出所有ep管中样本的净重。已知每份样本的净重，按体积v＝样本净重(mg)*12μl/mg在4℃冰上操作加入70％meoh溶液。混匀，涡旋15s，每隔半小时涡旋一次，共涡旋4次，放4℃冰箱内提取12h以上。后离心。先将离心机开机预冷到4℃，设置时间10min和转速12000rpm，将样本涡旋后放入离心，使用离心机注意对称平衡，离心后吸取上清液。将上清液用微孔滤膜(0.22μm pore size)过滤，装入上样瓶中，准备lc-ms检测。
72.1.3目的产物检测
73.将装有样本提取液的进样瓶放入自动进样器内的样品盘，并记录每个进样瓶编号所对应的进样孔位置。同时打开软件analyst software，双击hardware configuration，选择lcms-v(有切换阀模式)，点击activate profile，并选择acquire mode模式，点击acquire，点击图上方的equilibrate键，一般设定时间为3min，此操作目的是预热仪器，使高压输液泵、色谱柱、柱温箱、离子源温度等达到方法中设置的条件。待各仪器部件状态
ready后，功能区start sample键成为可点击状态，此时表明仪器正常，分析条件正常，然后点击start sample开始跑样，首次跑样前先提交4针空白样。
74.2.结果
75.矢车菊素3-o-葡萄糖苷的峰度值为1.0e+06(图3)，表明hovusg1651900蛋白的活性高。
76.实验结果说明，本发明将基因hovusg1651900转移到烟草中，使得烟草植株可以表达矢车菊素鼠李糖基转移酶，并诱导烟草积累矢车菊素3-o-鼠李糖苷，提高烟草的保健价值，同时为高产矢车菊素3-o-鼠李糖苷的青稞的品种制备提供依据。