一种牛血液CD4

技术特征：
1.一种牛血液cd4+ t淋巴细胞的分离方法，包括以下步骤：步骤（1）、牛尾静脉采取新鲜抗凝全血15-20 ml，用等体积的全血及组织稀释液稀释全血，得到全血稀释液；步骤（2）、在15 ml离心管中加入5 ml分离液以及5 ml步骤（1）得到的全血稀释液，将所述的全血稀释液平铺到分离液液面上；室温下，水平转子950g，离心30 min后，吸取白膜层得到含有红细胞的淋巴细胞；步骤（3）、将步骤（2）得到的含有红细胞的淋巴细胞移入15ml洁净的离心管中，10 ml 磷酸盐缓冲液或细胞洗涤液洗涤含有红细胞的淋巴细胞，室温下，水平转子300g，离心10 min后，弃上清，获得淋巴细胞，继续此步骤两次；步骤（4）、将步骤（3）得到的淋巴细胞中加入2 ml红细胞裂解液，37℃水浴2 min后，加入5 ml细胞洗涤液终止裂解，得到不含有红细胞的纯净淋巴细胞悬液；步骤（5）、将步骤（4）得到的纯净的淋巴细胞弃上清，加100 μl buffer重悬，避光加入10 μl荧光单克隆cd4一抗，4℃孵育25 min，后补加1 ml buffer 1300r离心5 min，弃上清，得到被标记上cd4一抗的淋巴细胞悬液；步骤（6）、将步骤（5）得到被标记上cd4一抗的淋巴细胞中，加入80 μl buffer重悬，避光加入25 μl带有磁珠的二抗，4℃孵育15 min，后补加1 ml buffer，1300r离心5 min，弃上清液，500 μl buffer重悬，得到cd4一抗被标记上磁珠的淋巴细胞悬液；步骤（7）、将步骤（6）得到的cd4一抗被标记上磁珠的淋巴细胞悬液加入到磁柱中，待悬液自然流尽，使cd4一抗被标记上磁珠的淋巴细胞吸附在磁柱上，得到吸附磁柱；步骤（8）、用500 μl buffer洗涤步骤（7）获得的吸附磁柱两次，将未被吸附的其他非目的细胞冲洗掉，得到目标细胞磁柱；步骤（9）、向步骤（8）得到的目标细胞磁柱加入500 μl buffer，然后将磁柱塞置于目标细胞磁柱上方，待目标细胞磁柱内外压力平衡，然后将带有磁柱塞的目标细胞磁柱从磁柱架上取下，按压磁柱塞使分选出的cd4淋巴细胞悬液流入1.5 ml离心管中，得到纯净的cd4淋巴细胞；步骤（10）、将步骤（9）得到的纯净的cd4淋巴细胞加入1 ml pbs重悬，洗涤，1300r离心5 min一次，弃上清液，沉淀即为牛血液cd4
+ t淋巴细胞。2.根据权利要求1所述的一种牛血液cd4+ t淋巴细胞的分离方法，其特征在于，步骤（4）中的红细胞裂解液的制备方法如下：称取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷1.3g加水溶解并稀释至500ml后，0.22μm滤膜过滤除菌，即得所述的红细胞裂解液。

技术总结
本发明的一种牛血液CD4


技术研发人员：徐闯 李铭 张冰冰 杨威 尹钰峰 何雨欣 温佳楠 王晶晶
受保护的技术使用者：黑龙江八一农垦大学
技术研发日：2021.12.08
技术公布日：2022/3/18