大白菜PAO基因及其在调控植物持绿性状中的应用

大白菜pao基因及其在调控植物持绿性状中的应用
技术领域
1.本发明属于分子遗传学领域，涉及与大白菜pao基因及其在调控植物持绿性状中的应用。


背景技术：

2.绿色蔬菜在贮存、运输或加工过程中，叶绿素容易降解，叶片发黄变质，难以适应远途运输和较长时间的贮藏，使其食用品质和商品品质下降。因此延缓绿色蔬菜叶片衰老、变质、延长保鲜期、提高其经济价值、成为一个迫切需要解决的难题。在实际生产上，虽然保持蔬菜绿色的方法有很多，但有的方法成本太高，有的方法在加工过程中由于重金属的残留而受到食品卫生法的限制，并且保绿效果不十分理想。持绿突变体具有在衰老后叶绿素降解不明显和叶片依然保持绿色的先天优势，因而在绿叶蔬菜的育种和栽培上及贮运保鲜、延长货架期等方面有巨大的应用前景和经济价值。
3.采后植物叶片衰老是叶片发育的最后阶段，是植物营养物质再循环的一个重要环节(park et al.,2007)。采后叶片衰老最明显的标志是由叶绿素降解而引起的绿色褪去和之后的花青素或类黄酮类物质的显色(matileet al.,1999)。持绿性(stay-green)是指植物衰老叶片叶绿素不降解或降解不明显，较长时间保持绿色甚至完全不黄化的特性(kusaba et al.,2013)。持绿性变异因其显著的特征而被相继发现并引起广泛研究。孟德尔在遗传定律中所使用的绿色豌豆，便是最早发现的植物持绿性变异材料。随后利用理化诱变又创制出多份持绿性变异材料。
4.随着越来越多持绿突变体的发现，植物持绿性变异的分子机制探究也越来越深入。植物持绿机理的研究主要围绕叶片衰老期的光合生理、酶活性、激素、环境因子等方面。众多植物持绿性研究的报道中，归纳起来引起植株持绿的原因可以分成5种类型。一是叶绿素降解过程中的关键酶的破坏(park et al.,2007；sakuraba et al.,2012b)。二是持绿蛋白(sgr)的作用(ren et al.,2007；jiang et al.,2007)。三是编码叶绿体蛋白的基因突变(wang et al.,2004；keren et al.,2005；zhang et al.,2009)。四是与植物衰老相关的转录因子nac和wrky家族成员的活性改变(wang et al.,2004；keren et al.,2005；zhang et al.,2009)。五是植物激素的信号转导途径的改变(grbic
′
and bleecker 1995；kim et al.,2006)。
5.大白菜(brassica campestris ssp.pekinensis)是起源于我国的重要蔬菜作物，南北各地广泛栽培。在大白菜生产中，植株进入结球期后外叶往往就开始衰老变黄，影响叶球产量和品质。叶球采收后的贮运期间，球叶黄化也会造成大量损耗。持绿性不仅可以延缓植株衰老，还可以通过延长光合作用时间提高产量，还常伴随抗逆和抗病能力的提高(borrell and hammer,2000)。大白菜持绿突变基因的发掘，可以为持绿新品种的创制奠定基础。同时，多数蔬果(叶菜类、青花菜、嫩葱、芸豆、黄瓜、青椒、番茄及青提、猕猴桃、青枣、青苹果等)、烟叶、观赏植物、草坪草等都会存在衰老时极易失绿变黄，伴随叶绿素的降解，其品质也随之降低。对于这种情况，延缓叶绿素降解，使其保持更长久的绿色，能有效改善
品质，有望从根本上延缓衰老，提升品质，解决采后损耗及货架等问题。
6.持绿突变体还是研究植物衰老进程、叶绿素代谢、光合电子传递、植物应对激素响应、抗逆性(抗旱，盐胁迫，耐高温等)等生理代谢过程的理想材料。持绿突变体的研究，不仅可以获得一些抗衰、高产、抗性新材料，还可以丰富作物抗逆基因资源，对于作物品种改良有重要意义。


技术实现要素：

7.本发明的一个目的是提供一种蛋白。
8.本发明提供的蛋白，为如下(1)或(2)：
9.(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
10.(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
11.上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
12.编码上述蛋白的核酸分子也是本发明保护的范围。
13.上述核酸分子是如下1)-3)中任一种的dna分子：
14.1)编码区为序列表中序列1所示的dna分子；
15.2)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的dna分子；
16.3)与1)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的dna分子。
17.上述严格条件为在6
×
ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2
×
ssc，0.1％sds和1
×
ssc，0.1％sds各洗膜一次。
18.含有上述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌也是本发明保护的范围。
19.上述蛋白、上述核酸分子或上述的重组载体、表达盒或重组菌在调控植物持绿性中的应用也是本发明保护的范围。
20.或，上述蛋白、上述核酸分子或上述的重组载体、表达盒或重组菌在降低植物叶绿素含量中的应用也是本发明保护的范围。
21.抑制上述蛋白的生物学功能的物质或者抑制上述核酸分子表达的物质在使不具有持绿性植物变为具有持绿性目的植物中的应用也是本发明保护的范围；
22.或，抑制上述蛋白生物学功能的物质或者抑制上述核酸分子表达的物质在培育具有持绿性的植物中的应用也是本发明保护的范围。
23.上述物质为干扰或者抑制上述核酸分子表达的rna。
24.本发明另一个目的是提供如下任一种物质。
25.本发明提供的物质为：
26.a、突变蛋白，为如下(a1)或(a2)：
27.a1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
28.a2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质；
29.b、突变基因，为如下1)-3)中任一种的dna分子：
30.b1)编码区为序列表中序列3所示的dna分子；
31.b2)在严格条件下与b1)限定的dna序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的dna分子；
32.b3)与b1)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的dna分子；
33.c、含有所述突变基因的重组载体、表达盒或重组菌；
34.d、大白菜持绿突变体cl，其保藏号为cgmcc no.21579。
35.扩增上述dna分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
36.本发明还有一个目的是提供如下方法。
37.本发明提供了一种培育具有持绿性的转基因植物的方法，为如下c1)或c2)：
38.c1)所述的方法包括如下步骤：抑制不具有持绿性目的植物中上述蛋白的含量、生物学功能和/或活性，得到具有持绿性的转基因植物；
39.c2)所述的方法包括如下步骤：抑制不具有持绿性目的植物中编码上述蛋白的核酸分子的表达，得到具有持绿性的转基因植物；
40.本发明提供了一种使具有持绿性的出发植物恢复为不具有持绿性的目的植物的方法，为如下d1)或d2)：
41.d1)所述的方法包括如下步骤：提高具有持绿性的出发植物中上述蛋白的含量、生物学功能和/或活性，得到恢复为不具有持绿性的目的植物；
42.d2)所述的方法包括如下步骤：提高具有持绿性的出发植物中编码上述蛋白的核酸分子的表达，得到恢复为不具有持绿性的目的植物。
43.本发明还提供了一种培育叶绿素含量降低的转基因植物的方法，为如下e1)或e2)：
44.e1)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中上述蛋白的含量、生物学功能和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的叶绿素含量低于所述目的植物；
45.e2)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中中编码上述蛋白的核酸分子的表达，得到转基因植物；所述转基因植物的叶绿素含量低于所述目的植物。
46.本发明还提供一种培育具有持绿性状大白菜雄性不育系的方法。
47.本发明提供的方法，包括如下步骤：以大白菜持绿突变体cl为供体、非持绿大白菜亲本不育系为受体，进行杂交和/或回交转育，得到具有持绿性状的大白菜雄性不育系；
48.所述大白菜持绿突变体cl，其保藏号为cgmcc no.21579。
49.上述抑制目的植物中蛋白的含量和/或活性，或，抑制目的植物中编码蛋白的核酸分子的表达，可以通过将上述核酸分子定点突变为序列3所示的基因实现，也可以抑制上述核酸分子表达，使其无法正确翻译蛋白。
50.上述蛋白和上述突变蛋白或上述突变蛋白在判断或辅助判断待测植物是否为持绿植物中的应用也是本发明保护的范围；
51.或，上述核酸分子和上述突变基因或上述突变基因在判断或辅助判断待测植物是否为持绿植物中的应用也是本发明保护的范围。
52.或，保藏号为cgmcc no.21579的大白菜持绿突变体cl在培育具有持绿性状大白菜雄性不育系中的应用也是本发明保护的范围。
53.上述在判断或辅助判断待测植物是否为持绿植物中的应用为检测待测植株的基因组dna或cdna，若待测植株的基因组中含有上述序列3所示的dna分子(突变基因brpao的基因组dna)或待测植株的cdna中含有上述序列3所示的dna分子(突变基因brpao的cdna)，则待测植株为或候选为持绿植株，若待测植株的基因组中含有上述序列1所示的dna分子或待测植株的cdna中含有上述序列1中所示的dna分子，则待测植株为或候选为黄化植株；
54.上述应用中，持绿性状为植物在子叶期，幼苗期衰老叶，莲座期衰老叶片呈绿色，所述植物双子叶植物，具体为大白菜。
55.上述植物具体为双子叶植物或单子叶植物，所述植物具体为大白菜。
56.本发明中，含持绿基因brpao的大白菜突变体cl于2021年6月21日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.21579，分类命名为brassica campestris ssp.pekinensis。
57.本发明的实验证明，利用ems诱变获得大白菜持绿突变体cl，鉴定获得持绿基因brpao，为持绿性大白菜种质创新奠定材料基础。该基因及突变体在培育具有持绿性状的大白菜新品种及雄性不育系中具有较重要的应用价值，可有效运用于持绿性大白菜品种改良。此外，本发明验明，通过异源过表达互补实验验证pao基因在大白菜叶绿素降解调控中的功能，为进一步通过基因工程手段诱变pao基因创制持绿性植物材料提供新的靶基因资源，为持绿性绿叶菜、青花菜、烟叶、观赏植物、草坪草等新品种选育奠定材料基础。
附图说明
58.图1为持绿突变体cl与野生型ft。
59.图2为持绿突变体cl与野生型ft衰老叶片叶绿素含量图，注:dad表示day after dark-induced senescence，暗诱导衰老天数。
60.图3为持绿基因brpao的定位图。
61.图4为转pao基因实验相关结果图；a为t2阳性转基因植株的黄色表型形态，b为阳性转基因植株pcr验证(目的条带570bp)；c为阳性转基因植株衰老叶片叶绿素含量分析(不同小写字母之间表示差异显著)。
62.图5为pcamiba1300-m载体图谱。
具体实施方式
63.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
64.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
65.大白菜优异小孢子dh系
‘
ft’；公众可从沈阳农业大学获得，记载过
‘
ft’的非专利文献是：huang et al.，screening of chinese cabbage mutants produced by 60co c-ray mutagenesis of isolated microspore cultures，plant breeding,133,480
–
488(2014)；huang et al.，a new method for generation and screening of chinese cabbage mutants using isolated microspore culturing and ems mutagenesis，euphytica(2016)207:23
–
33)。
66.拟南芥持绿突变体pao1-1：记载于“ren et al.,reverse genetic identification of crn1 and its distinctive role in chlorophyll degradation in arabidopsis.journal of integrative plant biology 2010,52(5):496
–
5041”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。
67.拟南芥哥伦比亚型材料col-0：记载于“ren et al.,reverse genetic identification of crn1 and its distinctive role in chlorophyll degradation in arabidopsis.journal of integrative plant biology 2010,52(5):496
–
5041”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。
68.pcamiba1300-m载体(核苷酸序列为序列5，载体图谱如图5所示)：是申请人在原购自于武汉伯远生物的商业空载pcamiba1300(产品目录号cas：mlcc1244)基础上，以其为骨架，进行多酶切位点及接口的改造后所得的质粒；具体为向pcamiba1300载体的多克隆位点(mcs)处引入typeⅱs限制性内酶(eco31ⅰ,gctctc；bsmbⅰ,cgtctc)识别序列。
69.实施例1、大白菜pao基因及持绿基因brpao的鉴定
70.1、大白菜持绿突变体cl的获得
71.以大白菜优异小孢子dh系
‘
ft’为试材，采用萌动种子ems诱变处理方法，开展持绿突变体的创制研究。在m1自交获得的m2株系中，筛选得到稳定遗传的持绿突变体cl。突变体的叶球大小与野生型相同，除叶色持绿突变外与野生型无明显差异(图1，a、b、c：幼苗期、成株期、莲座期突变体与野生型的叶片颜色；d:突变体与野生型的叶球形态，图中wt为野生型ft)。cl在整个生长期表现出稳定的持绿表型，其衰老叶片chla、chlb及总叶绿素含量都显著高于野生型(图2)。
72.含持绿基因brpao的大白菜突变体cl于2021年6月21日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.21579，分类命名为brassica campestris ssp.pekinensis。
73.2、大白菜pao基因和持绿基因brpao的鉴定
74.用野生型ft与突变体cl杂交构建f1、bc1及f2群体进行突变性状遗传规律分析。遗传分析表明大白菜持绿突变体cl持绿性状受一对隐性核基因控制。分别构建双亲及f2持绿混池用于mutmap分析，将突变位点定位于a01染色体2.8mb的区间内(图3)，共筛选到非同义突变snp位点8个突变，共涉及14个基因。通过候选基因功能注释、克隆测序及共分离验证鉴定持绿基因brpao。
75.野生型ft中的野生型基因pao的核苷酸序列为序列1，该野生型基因pao编码的蛋白命名为野生型蛋白pao，该蛋白的氨基酸序列序列表中序列2。
76.突变体cl中的突变基因brpao的核苷酸序列为序列3，该突变基因brpao编码的蛋白命名为突变型蛋白brpao，该蛋白的氨基酸序列序列表中序列4。
77.经过比较，突变基因brpao的核苷酸序列为将序列1第1,081位碱基由c突变为t，其他核苷酸残基不变，得到的序列(序列3)。
78.突变型蛋白brpao的氨基酸序列为将序列2第259位氨基酸残基移码突变由kvtgrrdrakplpfkvessgpwgfqganddspkitakfvapcyslnkieidaklpiv gnqkwviwicsfnip突变为eeetepnhcpsrwsqvvlgvskvpmttvqr*，翻译提前终止，蛋白pao失活，得到的序列(序列4)。
79.实施例2、大白菜叶绿素降解调控蛋白pao功能分析
gate方法用bsmbⅰ酶(武汉伯远，产品目录号：rca01s)酶切rdnag1，酶切产物与经过eco31ⅰ酶(武汉伯远，产品目录号：rca02s)酶切的载体pcamiba1300-m连接，得到重组载体。
93.重组载体pcamiba1300-pao为将序列表中序列1所示的pao基因插入pcamibai1300-m载体的eco31ⅰ酶间得到的载体。
94.二、重组菌的构建
95.将上述重组载体pcamiba1300-pao利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)gv3101。
96.提取菌斑，用如下引物进行扩增，得到1608bp的为阳性重组菌，命名为gv3101/pcamiba1300-pao。
97.正向菌检引物：5'-atgtcagttgttttagtctc-3'；
98.反向菌检引物：5'-tcgatttcagaatgcacgt-3'
99.实验同时设置向根癌农杆菌gv3101中导入pcamiba1300-m空载体的对照，得到对照菌。
100.三、遗传转化
101.1、拟南芥种植
102.本实验使用的拟南芥持绿突变体pao1-1，取100粒种子放到4℃冰箱低温处理3-5天后点播于10cm
×
10cm营养钵中，营养钵中装有草炭:蛭石:珍珠岩＝7:4:2的基质，并已浇透自来水。完成后，在钵上集中敷一层透明的塑料薄膜，置于培养室，于25℃，12小时光照/12小时黑暗，湿度85％条件下培养3-4天，种子萌发后适当掀膜，放风。小苗稍健壮，去掉薄膜，浇透水。掀膜后每隔一周浇一次透水。待苗长出6-8片真叶时开始浇1/2ms营养液，每次浇10ml，营养液和水分开浇，直至抽薹开花。
103.2、农杆菌介导蘸花法侵染
104.1)待侵染菌液
105.将上述二制备的重组菌gv3101/pcamiba1300-pao涂板(含kana)，封口倒置培养于28℃条件下暗培养48h。挑取圆形大个单菌落于10ml液体lb(kana)中，28℃，200rpm振摇48h，收集浑浊菌液。取5μl浑浊菌液检测，合格的菌液取1ml送华大基因测序，其余取1ml浑浊菌液于100ml液体lb中(kana)扩繁，得到扩繁后菌液。其余分装到2ml离心管中保存，备用。
106.将扩繁后菌液取出10μl，用酶标仪测od600，判断菌液浓度，然后均分到50ml离心管中12,000rpm，10min离心，注意一定要配平；弃上清，加50ml 1/2ms培养基(提前灭菌，含有0.02％的表面活性剂silwetl-77,solarbio,s9430)，混匀配平，离心收菌，倒掉上清，重复一次。将回收到的菌种用含有表面活性剂的1/2ms液体培养基稀释，测得od600为0.8-1.2时，菌液处理完成，得到待侵染菌液。
107.2)侵染
108.待拟南芥pao1-1长到盛蕾期，进行侵染实验：第一天给拟南芥植株浇透水，当天用小剪刀将拟南芥植株上已开放的小花和已结的角果全部剪掉，保留即将开放的大花蕾。
109.将上述1)制备的待侵染菌液倒入灭过菌的大口径玻璃培养皿中，将修剪过的拟南芥pao1-1的花序完全浸于菌液内，来回均匀的转动培养皿，50s后取出，将植株平放于黑暗环境下，依次侵染30株。24h后将侵染的拟南芥植株取出，竖直放置于培养室，于25℃，12小
时光照/12小时黑暗，湿度85％条件下，培养到后期单株收种。
110.四、转基因植株筛选及分子鉴定
111.分别取上述三侵染后每个单株收取的种子若干粒，混匀后装入一个2ml的离心管中，在4℃冰箱内放置3天，取出后加入ddh2o浸泡1h，与此同时将用到的试剂放入超净工作台紫外杀菌。将浸泡的种子，3,000rpm，离心1min，弃上清；在超净工作台上向装有拟南芥种子的离心管中加入1ml 1％升汞，盖盖并上下翻转离心管，5min后离心，弃上清；然后加入70％乙醇1ml，上下颠倒，5min后离心，弃上清；再向离心管中加入1ml ddh2o，上下颠倒清洗，重复5次，每次5min。将得到的种子用500μl ddh2o悬浮，移液器吸打到直径为9cm的ms固体培养基上(hyg)，轻轻旋转，平铺均匀，盖盖并用封口膜封严，置于20-25℃常温光照环境中筛选25d。将筛选培养基中成活的植株用自来水冲洗根部，移栽到浇透水的基质中，覆一层塑料薄膜，置于拟南芥培养室，常温光照环境培养。五天后，揭膜，浇水施肥。待植株长出10-15片真叶后，各单株分别取2-3片嫩叶，提取基因组dna，利用基因特异序列及后融合gfp标签序列设计引物，进行pcr检测。
112.其中，进行pcr检测采用的引物序列如下：
113.wt-检500f:5'-gtacacgaagctcacgttcac-3'；
114.gfp-40r:5'-tcgccgtcgagctccacgagg-3'。
115.结果如图4b所示，扩增得到大小为570bp的目的片段即为阳性，命名为t1代转pao拟南芥。
116.采用同样的方法将对照菌转入突变体pao1-1叶片，得到转空载体拟南芥，经过上述扩增鉴定，未得到目的片段。
117.t1代收种后播种，获得t2代植株。
118.五、转pao拟南芥的表型鉴定
119.对t2代转pao拟南芥不同株系叶片叶绿素含量进行检测，具体如下：
120.选取上述四得到的t2代转pao拟南芥，取倒数第二片衰老叶片，参照arnon(1949)的方法，选用80％(v/v)丙酮乙醇溶液提取植株的叶绿素。
121.利用du 800型紫外分光光度计(beckman coulter公司，美国)分别在663nm和645nm波长下测定吸光值，每次测量重复3次。参照holm(1954)的方法计算总叶绿素含量。
122.实验同时设置哥伦比亚野生型拟南芥(col-0)、未转基因的拟南芥持绿突变体(pao1-1)和t2代转空载体拟南芥为对照。
123.表型观察结果如图4a所示，可以看出，在35天苗龄时，col-0作为对照，其底部衰老叶片开始变黄；pao1-1最底部莲座叶开始出现衰老萎蔫，但叶色始终持绿；与pao1-1相比，t2代转pao拟南芥pao1-1的最底部莲座叶开始衰老，其叶片颜色由绿色恢复为黄色(与哥伦比亚野生型拟南芥表型基本一致)。
124.叶绿素含量检测结果如图4c所示，可以看出，与pao-1相比，t2代转pao拟南芥pao1-1的衰老叶片中叶绿素含量降低，与哥伦比亚野生型拟南芥(wt)的叶绿素含量基本一致。
125.上述结果表明：与pao-1相比，向pao1-1中转入pao基因的拟南芥单株的叶色衰老时期恢复为黄色(与哥伦比亚野生型拟南芥表型基本一致)，衰老叶片中叶绿素含量降低，即pao基因能够对叶绿素降解调控，该基因失活将导致叶绿素降解受阻，呈现持绿表型，符
合转基因预期的表型。