一种甲硫氨酸腺苷转移酶突变体的制作方法

1.本发明涉及一种甲硫氨酸腺苷转移酶突变体，属于酶工程和微生物工程技术领域。


背景技术：

2.腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine，sam)通过转甲基、转硫基、转氨丙基等反应参与人体众多代谢途径，是保证人体正常生命活动所不可或缺的重要物质。临床研究表明，sam对肝脏疾病、抑郁症、关节炎、arts综合征等均具有明显治疗效果。另外，sam还是抗衰老高级保健药品。同时，sam是细胞内原有的代谢物，具有易吸收、副作用小等特点，因此有关sam的研究在逐年增多。
3.目前，工业上主要是以发酵法生产sam。但是，该方法存在生产周期长、底物转化率低、提取过程复杂等问题。(具体可见参考文献：huangy，gou x，hu h，et al.enhanced s-adenosyl-l-methionine production in saccharomyces cerevisiae by spaceflight culture，overexpressing methionine adenosyl-transferase and optimizing cultivation[j].j.appl.microbiol.，2012，112:683－694.)相比较而言，酶催化法具有反应时间短、提取过程较简单等优势。
[0004]
现有的可用于合成sam的酶只有甲硫氨酸腺苷转移酶，但是，大部分甲硫氨酸腺苷转移酶的转化率和活力都不高，其中，产物抑制导致其转化率处于较低的水平(具体可见参考文献：xiu wang,yiqi jiang,mianbin wu,li zhu,lirong yang,jianping lin.semi-rationally engineered variants of s-adenosylmethionine synthetase from escherichia coli with reduced product inhibition and improved catalytic activity[j].enzyme and microbial technology,2019,129:)，这大大阻碍了利用酶法生产s-腺苷甲硫氨酸的工业化进程。
[0005]
因此，急需找到产物抑制不严重，催化效率高的甲硫氨酸腺苷转移酶。


技术实现要素：

[0006]
[技术问题]
[0007]
本发明要解决的技术问题是提供一种合成sam的无明显产物抑制与催化效率高的甲硫氨酸腺苷转移酶(methionine adenosyltransferase，ec 2.5.1.6)。
[0008]
[技术方案]
[0009]
为解决上述技术问题，本发明提供了一种甲硫氨酸腺苷转移酶突变体，所述甲硫氨酸腺苷转移酶突变体是通过将出发氨基酸序列如seq id no.2所示的甲硫氨酸腺苷转移酶的第55位谷氨酸突变为亮氨酸得到的。
[0010]
本发明还提供了编码上述甲硫氨酸腺苷转移酶突变体的基因。
[0011]
本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。
[0012]
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pet-28a(+)质粒。
[0013]
本发明还提供了携带上述基因，或上述重组质粒的微生物细胞。
[0014]
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。
[0015]
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0016]
本发明还提供了上述甲硫氨酸腺苷转移酶的制备方法，所述方法为将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，获得发酵液；将发酵液进行离心，收集菌体；将菌体进行破碎后离心，获得细胞破碎上清液；将细胞破碎上清液进行提取，获得甲硫氨酸腺苷转移酶。
[0017]
本发明还提供了一种提高甲硫氨酸腺苷转移酶催化效率的方法，所述方法为将出发氨基酸序列如seq id no.2所示的甲硫氨酸腺苷转移酶的第55位谷氨酸突变为亮氨酸。
[0018]
本发明还提供了一种高效合成腺苷甲硫氨酸的方法，所述方法为在含有甲硫氨酸的反应体系中添加上述甲硫氨酸腺苷转移酶突变体或上述微生物细胞进行反应。
[0019]
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中含有atp、甲硫氨酸、mgcl2以及kcl。
[0020]
在本发明的一种实施方式中，所述甲硫氨酸腺苷转移酶突变体的添加量为0.1～1ku/l。
[0021]
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，atp的浓度为2～50mmol/l。
[0022]
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，甲硫氨酸的浓度为10～100mmol/l。
[0023]
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，mgcl2的浓度为50～100mmol/l。
[0024]
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，kcl的浓度为50～100mmol/l。
[0025]
在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为25～35℃、ph为7～8。
[0026]
本发明还提供了上述甲硫氨酸腺苷转移酶突变体，或上述基因，或上述重组质粒，或上述微生物细胞，或上述制备方法，或上述方法在生产含有腺苷甲硫氨酸的产品中的应用。
[0027]
[有益效果]
[0028]
本发明通过对野生型甲硫氨酸腺苷转移酶的第55位氨基酸突变成亮氨酸获得的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体催化生成腺苷甲硫氨酸的酶活高，是野生型的1.6倍，vmax较野生型提高了54％；同时也保留了野生型酶良好的产物耐受性，甚至有些许的提高。
[0029]
本发明的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体在具有良好的产物耐受性的同时显著提高酶活，有助于降低生产成本，提高生产效率，在工业化生产腺苷甲硫氨酸中具有极高的应用前景。
附图说明
[0030]
图1：重组大肠杆菌摇瓶诱导发酵获得的表达产物的sds-page电泳分析结果；
[0031]
图2：甲硫氨酸腺苷转移酶生成腺苷甲硫氨酸的色谱图。
具体实施方式
[0032]
下述实施例中涉及的大肠杆菌e.coli bl21(de3)购自生工生物工程(上海)股份有限公司，pet-28a(+)质粒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的腺苷甲硫氨酸购自毕得医药科技有限公司，atp购自毕得医药科技有限公司。(上述菌株大
肠杆菌e.coli bl21(de3)可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)
[0033]
下述实施例中涉及的培养基如下：
[0034]
lb液体培养基：酵母粉5.0g
·
l-1
、胰蛋白胨10.0g
·
l-1
、nacl 10.0g
·
l-1
、卡那霉素100mg
·
l-1
。
[0035]
lb固体培养基：酵母粉5.0g
·
l-1
、胰蛋白胨10.0g
·
l-1
、nacl 10.0g
·
l-1
、琼脂粉15g/l、卡那霉素50mg
·
l-1
。
[0036]
下述实施例中涉及的检测方法如下：
[0037]
甲硫氨酸腺苷转移酶酶活的高通量检测方法如下：
[0038]
在96孔板中加入预混好的15μl的底物混合液(100mm kcl、20mm mgcl2、2mm atp、10mm甲硫氨酸以及100mm ph 8.0的tris-hcl缓冲液)，加入10μl的细胞破碎上清液，37℃反应10min。然后加入25μl 1％钼酸铵溶液和50μl 12％抗坏血酸，室温孵育5min进行显色。再加入100μl 2％醋酸和2％柠檬酸钠，室温孵育15min后放入酶标仪在655nm波长下进行读数。以第一列wt为对照，选取有较明显变化的点后续复筛验证。
[0039]
甲硫氨酸腺苷转移酶酶活的检测方法如下：
[0040]
取10μl蛋白浓度为10mg/ml的纯酶液加入含有100mm kcl、20mm mgcl2、2mm atp、10mm甲硫氨酸以及100mm ph 8.0的tris-hcl缓冲液中，得到反应体系(共0.5ml)；将反应体系于37℃振荡反应10min；反应结束后，加入100μl 20％高氯酸终止反应，取样进行hplc分析，取样进行hplc分析，同时以s-腺苷甲硫氨酸标准品做对照，确定产物出峰时间，并以此为依据进行酶活测定；
[0041]
hplc分析条件为：色谱柱diamonsil c
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)，流动相为v(kh2po
4 ph 2.5):v(甲醇)＝95:5，流速为1ml
·
min-1
，检测波长为210nm，柱温为25℃；
[0042]
酶活的定义：在该条件下每分钟催化产生1μmol s-腺苷甲硫氨酸所需酶量为一个酶活力单位(1u)；
[0043]
比酶活的定义：单位重量(mg)蛋白质所具有的酶活力单位数。
[0044]
酶活和比酶活的计算公式如下：
[0045][0046][0047]
式中，a
sam
为反应液中产物s-腺苷甲硫氨酸的摩尔浓度，v为反应液体积，t为转化时间(min)，酶活的单位u＝μmol
·
min-1
(酶液中的蛋白浓度通过bradford法测定，bradford法记载于参考文献“bradford,m.m.1976.a rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding.anal.biochem.72:248
–
254.”中)。
[0048]
实施例1：甲硫氨酸腺苷转移酶的筛选
[0049]
具体步骤如下：
[0050]
在96孔板中加入预混好的15μl的含有不同浓度产物(0.1、0.2、0.5、0.7、1mm sam)的底物混合液(100mm kcl、20mm mgcl2、2mmatp、10mm甲硫氨酸以及100mm ph 8.0的tris-hcl缓冲液)，加入10μl的不同来源的甲硫氨酸腺苷转移酶的纯酶液(酶浓度8mg/ml)。37℃
反应10min。然后加入25μl 1％钼酸铵溶液和50μl 12％抗坏血酸，室温孵育5min进行显色。再加入100μl 2％醋酸和2％柠檬酸钠，室温孵育15min后放入酶标仪在655nm波长下进行读数。从下表可以看出，b.fragilis来源的甲硫氨酸腺苷转移酶具有良好的产物耐受性。
[0051]
表1不同来源的甲硫氨酸腺苷转移酶产物抑制测定
[0052][0053]
实施例2：甲硫氨酸腺苷转移酶突变体的制备、表达及纯化
[0054]
具体步骤如下：
[0055]
(1)野生型硫氨酸腺苷转移酶质粒及重组菌的构建：
[0056]
化学合成编码氨基酸序列如seq id no.2所示的野生型甲硫氨酸腺苷转移酶的基因(核苷酸序列如seq id no.1所示)；将获得的基因与pet-28a(+)分别经过bamh i和xho i酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)，转化产物涂布于kan抗性的lb固体培养基，于37℃培养8～10h，在lb固体培养基上挑取5个转化子，接入lb液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将提取得到的质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得含有编码野生型甲硫氨酸腺苷转移酶的基因的重组质粒pet28a-bfmat以及含有编码野生型甲硫氨酸腺苷转移酶的基因的重组菌e.coli bl21/pet28a-bfmat。
[0057]
(2)硫氨酸腺苷转移酶突变体的筛选
[0058]
利用全质粒pcr技术，以获得的重组质粒pet28a-bfmat为模板进行定点饱和突变，获得含有编码甲硫氨酸腺苷转移酶突变体s9(第9号位的丝氨酸)、s11(第11号位的丝氨酸)、e12(第12号位的谷氨酸)、h14(第14号位的组氨酸)、p15(第15号位的脯氨酸)、d16(第16号位的天门冬氨酸)、e55(第55号位的谷氨酸)、l64(第64号位的亮氨酸)、n103(第103号位的天冬酰胺)、d110(第110号位的天门冬氨酸)、p111(第111号位的脯氨酸)、t127(第127号位的苏氨酸)、k218(第218号位的赖氨酸)、d219(第219号位的天门冬氨酸)、v220(第220号位的缬氨酸)、f241(第241号位的苯丙氨酸)、h282(第282号位的组氨酸)、g284(第284号位的甘氨酸)、g285(第285号位的甘氨酸)、k290(第290号位的赖氨酸)、p292(第292号位的脯氨酸)、s293(第293号位的丝氨酸)、k294(第294号位的赖氨酸)、a299(第299号位的丙氨酸)、h305(第305号位的组氨酸)、i306(第306号位的异亮氨酸)、a307(第307号位的丙氨酸)、k308(第308号位的赖氨酸)、e318(第318号位的谷氨酸)、i327(第327号位的异亮氨酸)、d349(第349号位的天冬氨酸)的基因的重组质粒，将上述甲硫氨酸腺苷转移酶突变体依次命名为m1～m32；
[0059]
其中，突变s9的所用引物如下：
[0060]
s9-f：cagcgaannkgtttcagaaggtcatccggataa；
[0061]
s9-r：ctgaaacmnnttcgctggtaaacagatagccc；
[0062]
突变s11的所用引物如下：
[0063]
s11-f：aagcgttnnkgaaggtcatccggataaagttgc；
[0064]
s11-r：gaccttcmnnaacgctttcgctggtaaacaga；
[0065]
突变e12的所用引物如下：
[0066]
e12-f：cgtttcannkggtcatccggataaagttgcgg；
[0067]
e12-r：gatgaccmnntgaaacgctttcgctggtaaac；
[0068]
突变h14的所用引物如下：
[0069]
h14-f：agaaggtnnkccggataaagttgcggatcaga；
[0070]
h14-r：tatccggmnnaccttctgaaacgctttcgctg；
[0071]
突变p15的所用引物如下：
[0072]
p15-f：cagaaggtcatnnkgataaagttgcggatcagatttca；
[0073]
p15-r：atcmnnatgaccttctgaaacgctttcgctgg；
[0074]
突变d16的所用引物如下：
[0075]
d16-f：catccgnnkaaagttgcggatcagatttcaga；
[0076]
d16-r：gcaactttmnncggatgaccttctgaaacgct；
[0077]
突变e55的所用引物如下：
[0078]
e55l-f：ggcaggtnnkgtgaaaaccggtgcatacgttg；
[0079]
e55l-r：ttttcacmnnacctgccagcacaacctgacct；
[0080]
突变l64的所用引物如下：
[0081]
l64-f：cgttgatnnkcagctgattgcacgtgaagttatt；
[0082]
l64-r：tcagctgmnnatcaacgtatgcaccggttttc；
[0083]
突变n103的所用引物如下：
[0084]
n103-f：cgatattnnkcgtggtgttgaacgtgaagatc；
[0085]
n103-r：caccacgmnnaatatcggcactctgttcatgaatt；
[0086]
突变d110的所用引物如下：
[0087]
d110-f：acgtgaannkccgatgaatcagggtgcaggcg；
[0088]
d11p-r：tcatcggmnnttcacgttcaacaccacggtta；
[0089]
突变p111的所用引物如下：
[0090]
p111-f：nnkatgaatcagggtgcaggcgatcagggtat；
[0091]
p111-r：gcaccctgattcatmnnatcttcacgttcaacaccacgg；
[0092]
突变t127的所用引物如下：
[0093]
t127-f：tgccnnkaatgaaaccgaaaattatatgccgc；
[0094]
t127-r：cggtttcattmnnggcataaccaaacatcataccct；
[0095]
突变e129的所用引物如下：
[0096]
e129-f：ccaccaatnnkaccgaaaattatatgccgctgt；
[0097]
e129-r：ttcggtmnnattggtggcataaccaaacatca；
[0098]
突变k218的所用引物如下：
[0099]
k218-f：gcagtgattcgtnnkgatgttattgaagttctgatgccg；
[0100]
k218-r：tcmnnacgaatcactgccagcatttcttcatc；
[0101]
突变d219的所用引物如下：
[0102]
d219-f：gtgattcgtaaannkgttattgaagttctgatgccgcg；
[0103]
d219-r：acmnntttacgaatcactgccagcatttcttc；
[0104]
突变v220的所用引物如下：
[0105]
v220-f：cgtaaagatnnkattgaagttctgatgccgcg；
[0106]
v220-r：tcaatmnnatctttacgaatcactgccagcat；
[0107]
突变f241的所用引物如下：
[0108]
f241-f：ggcactgnnkaatgatcatattatctatcatgtgaaccc；
[0109]
f241-r：gatcattmnncagtgccagtactttaggatgattaat；
[0110]
突变h282的所用引物如下：
[0111]
h282-f：taaaggtgccnnkggtggtggcgcctttagcg；
[0112]
h282-r：caccmnnggcacctttaccaccataggtatca；
[0113]
突变g284的所用引物如下：
[0114]
g284-f：atggtnnkggcgcctttagcggcaaagatccg；
[0115]
g284-r：aaaggcgccmnnaccatgggcacctttaccacc；
[0116]
突变g285的所用引物如下：
[0117]
g285-f：tggtggtnnkgcctttagcggcaaagatccga；
[0118]
g285-r：taaaggcmnnaccaccatgggcacctttacca；
[0119]
突变k290的所用引物如下：
[0120]
k290-f：tttagcggcnnkgatccgagcaaagttgatcgtag；
[0121]
k290-r：ggatcmnngccgctaaaggcgccaccaccatg；
[0122]
突变p292的所用引物如下：
[0123]
p292-f：cggcaaagatnnkagcaaagttgatcgtagtgccg；
[0124]
p292-r：tgctmnnatctttgccgctaaaggcgccacca；
[0125]
突变s293的所用引物如下：
[0126]
s293-f：ccgnnkaaagttgatcgtagtgccgcctatgc；
[0127]
s293-r：cgatcaactttmnncggatctttgccgctaaagg；
[0128]
突变k294的所用引物如下：
[0129]
k294-f：tccgagcnnkgttgatcgtagtgccgcctatg；
[0130]
k294-r：gatcaacmnngctcggatctttgccgctaaag；
[0131]
突变a299的所用引物如下：
[0132]
a299-f：tcgtagtnnkgcctatgcagcacgtcatatcg；
[0133]
a299-r：cataggcmnnactacgatcaactttgctcggat；
[0134]
突变h305的所用引物如下：
[0135]
h305-f：agcacgtnnkatcgcaaaaaatctggttgcag；
[0136]
h305-r：ttgcgatmnnacgtgctgcataggcggcacta；
[0137]
突变i306的所用引物如下：
[0138]
i306-f：gcacgtcatnnkgcaaaaaatctggttgcagca；
[0139]
i306-r：tttgcmnnatgacgtgctgcataggcggcact；
[0140]
突变a307的所用引物如下：
[0141]
a307-f：cagcacgtcatatcnnkaaaaatctggttgcagcaggtg；
[0142]
a307-r：mnngatatgacgtgctgcataggcggcactac；
[0143]
突变k308的所用引物如下：
[0144]
k308-f：cgcannkaatctggttgcagcaggtgttgcag；
[0145]
k308-r：caaccagattmnntgcgatatgacgtgctgcat；
[0146]
突变e318的所用引物如下：
[0147]
e318-f：tgcagatnnkatgctggttcaggttagctatgc；
[0148]
e318-r：ccagcatmnnatctgcaacacctgctgcaacc；
[0149]
突变i327的所用引物如下：
[0150]
i327-f：ctatgcannkggtgttgcacgtccgattaata；
[0151]
i327-r：caacaccmnntgcatagctaacctgaaccagca，
[0152]
突变d349的所用引物如下：
[0153]
d349-f：gagcnnkggtgaaattgcacgtaaaattgatg；
[0154]
d349-r：caatttcaccmnngctcattttaacattgctacgacc。
[0155]
pcr反应体系(50μl)为：kod酶(2.5u/ml)1.0μl，模板pet28a-bfmat(5～50ng)1.0μl，dntp 4.0μl，10
×
reactionbuffer 5.0μl，上下游引物各1.0μl，ddh2o补足至50μl；
[0156]
pcr产物扩增条件均为：(1)94℃变性3min，(2)94℃变性30sec，(3)54℃退火30sec，(4)72℃延伸150sec，重复步骤(2)～(4)进行10～15个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存pcr扩增产物。
[0157]
pcr扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向10μl扩增产物中加入0.5μl甲基化模板消化酶(dpn i)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1h，将dpn i处理后的扩增产物转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)，转化产物涂布于lb固体培养基，于37℃培养8～10h；在lb固体培养基上挑取全部转化子，分别接入含有300μl lb液体培养基的96孔深孔板培养，第一列接种步骤(1)中的重组菌e.coli bl21/pet28a-bfmat，于37℃培养10h，获得种子液；将50μl种子液转接至另一个含有600μl lb液体培养基的96孔深孔板的对应孔中，于37℃培养2h后，加入终浓度为0.2mm的iptg，于25℃继续诱导培养10h，得到发酵液；将发酵液于4℃、3500rpm离心30min后，弃上清，再加入300μl的细胞裂解液(750mg/l溶菌酶和20mg/l dna酶溶于100mm ph 8.0tris-hcl缓冲液中)，充分振荡，室温静置2-3h，获得细胞破碎液。将细胞破碎液于4℃、3500rpm离心30min后，得到甲硫氨酸腺苷转移酶突变体的细胞破碎上清液。测定酶活，筛选得到荧光值高于野生型20％以上的优选突变体。
[0158]
(3)蛋白纯化
[0159]
将步骤(1)获得的重组菌e.coli bl21/pet28a-bfmat以及步骤(2)筛选到的优选突变体涂布于lb固体培养基，于37℃培养8～10h，获得单菌落；挑取单菌落接入lb液体培养基，于37℃培养12～14h，获得种子液；将种子液按照2％(v/v)的接种量接入lb液体培养基，于37℃、200rpm培养至od
600
达到0.8后，加入终浓度为0.2mm的iptg，于25℃继续诱导培养8h，得到发酵液；将发酵液于4℃、8000rpm离心10min后，收集细胞；将收集得到的细胞悬浮于磷酸钾缓冲液(100mmol
·
l-1
，ph 8.0)中进行超声破碎，收集分别含有野生型甲硫氨酸腺
苷转移酶以及甲硫氨酸腺苷转移酶一系列优选突变体的细胞破碎上清液。
[0160]
将获得的细胞破碎上清液使用亲和柱histrap ff crude(镍柱)进行纯化，纯化过程如下：先使用缓冲液a(20mmol
·
l-1
tris，500mmol
·
l-1
nacl，20mmol
·
l-1
咪唑，ph 7.4)平衡镍柱，将含有野生型甲硫氨酸腺苷转移酶以及甲硫氨酸腺苷转移酶一系列优选突变体的细胞破碎上清液分别过镍柱，继续使用缓冲液a洗脱未与镍柱结合的蛋白，待穿透峰流尽后，从缓冲液a到缓冲液b(20mmol
·
l-1
tris，500mmol
·
l-1
nacl，500mmol
·
l-1
咪唑，ph 7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得野生型甲硫氨酸腺苷转移酶和甲硫氨酸腺苷转移酶一系列优选突变体的纯酶液。
[0161]
将获得的细胞破碎上清液和纯酶液进行sds-page分析，分析结果见图1。
[0162]
由图1可知，细胞破碎上清液在48kda处有一条与理论分子量一致的条带，说明甲硫氨酸腺苷转移酶表达成功；甲硫氨酸腺苷转移酶的纯酶液在48kda左右显示单条带，且杂蛋白较少，说明镍柱纯化效果较好。
[0163]
(4)酶活测定
[0164]
在96孔板中加入预混好的15μl的底物混合液(100mm kcl、20mm mgcl2、2mm atp、10mm甲硫氨酸以及100mm ph 8.0的tris-hcl缓冲液)，加入10μl的步骤(3)中获得的纯酶液，37℃反应10min。然后加入25μl 1％钼酸铵溶液和50μl 12％抗坏血酸，室温孵育5min进行显色。再加入100μl 2％醋酸和2％柠檬酸钠，室温孵育15min后放入酶标仪在655nm波长下进行读数。
[0165]
根据结果得到野生型甲硫氨酸腺苷转移酶以及甲硫氨酸腺苷转移酶突变体的相对酶活，如下表：
[0166]
表2野生型甲硫氨酸腺苷转移酶以及甲硫氨酸腺苷转移酶突变体的相对酶活
[0167]
编号突变位点相对酶活编号突变位点相对酶活编号突变位点相对酶活wt/100％m11p111s83.6％m22p292a124.0％m1s9n57.8％m12t127m45.1％m23s293q117.9％m2s11m54.5％m13e129k95.5％m24k294w48.0％m3e12y92.1％m14k218g106.9％m25a299g92.5％m4h14p142.1％m15d219s80.0％m26h305y99.5％m5p15d93.5％m16v220g66.9％m27i306g28.9％m6d16m69.8％m17f241c104.7％m28a307m48.3％m7e55l159.1％m18h282i35.6％m29k308q47.1％m8l64k50.6％m19g284d104.1％m30e318d61.6％m9n103m112.2％m20g285m31.4％m31i327q93.5％m10d110s85.4％m21k290c54.5％m32d349g100.8％
[0168]
实施例3：甲硫氨酸腺苷转移酶的动力学参数
[0169]
具体步骤如下：
[0170]
选择实施例2获得的野生型甲硫氨酸腺苷转移酶以及甲硫氨酸腺苷转移酶突变体，分别以2mm底物atp，同时以0.01mm～1mm底物met(甲硫氨酸)测定实施例2野生型甲硫氨酸腺苷转移酶以及甲硫氨酸腺苷转移酶突变体的酶活力，采用graph pad prism 7.0软件中的非线性回归方法对数据进行拟合，分别得到米氏(michaelis-menten)方程的km和v
max
值，再计算得到k
cat
和k
cat
/km值，计算结果见表3；
[0171]
其中，k
cat
值的计算公式为：k
cat
＝v
max
/[e]，k
cat
/km值的计算公式为：k
cat
/km＝k
cat
/km；其中，[e]为反应中加入的酶的摩尔浓度，单位为μmol
·
mg-1
。
[0172]
表3野生型甲硫氨酸腺苷转移酶以及甲硫氨酸腺苷转移酶突变体的动力学参数
[0173][0174]
实施例4：甲硫氨酸腺苷转移酶突变体的产物耐受性
[0175]
在96孔板中加入预混好的15μl的含有不同浓度产物(0.1、0.2、0.5、0.7、1mm sam)的底物混合液(100mm kcl、20mm mgcl2、2mmatp、10mm甲硫氨酸以及100mm ph 8.0的tris-hcl缓冲液)，加入10μl的不同突变体的纯酶液(酶浓度8mg/ml)。37℃反应10min。然后加入25μl 1％钼酸铵溶液和50μl 12％抗坏血酸，室温孵育5min进行显色。再加入100μl 2％醋酸和2％柠檬酸钠，室温孵育15min后放入酶标仪在655nm波长下进行读数。结果如下表所示：
[0176]
表4甲硫氨酸腺苷转移酶突变体的产物耐受性
[0177][0178]
实施例5：甲硫氨酸腺苷转移酶在制备腺苷甲硫氨酸的应用
[0179]
(1)腺苷甲硫氨酸的合成
[0180]
将实施例2中突变体m7的纯酶液以5000u/l的量加入含有150mm atp、150mm met、150mm对甲苯磺酸钠、225mm mgcl2、270mm kcl以及含有2％的巯基乙醇的底物混合液中，反应温度30℃，用3n的naoh维持反应体系ph在8.0，反应12h。
[0181]
(2)反应液的分离浓缩
[0182]
反应结束后，通过超滤膜分离纯酶液和反应液，并将反应液纳滤至20mg/ml。
[0183]
(3)产物层析
[0184]
先用1.0mol/l的硫酸对lxt135弱酸型阳离子柱进行活化，然后以2bv/h流速用0.6mol/l的氢氧化钠平衡，平衡后将步骤(2)中纳滤好的反应液上样，上柱ph为5.0，流速为1bv/h。然后再用纯水以1bv/h流速进行预洗脱，最后用0.2mol/l的硫酸溶液以4bv/h进行洗
脱，得到洗脱液a。
[0185]
用1.25mol/l的氢氧化钠对w42008吸附树脂柱进行活化，将洗脱液a上样，上柱ph为6.0，流速为0.6bv/h。然后再用纯水以1bv/h流速进行预洗脱，最后用0.02mol/l的丁二磺酸溶液与不同浓度的甲醇溶液以4bv/h进行洗脱，再将洗脱液纳滤至20mg/ml。
[0186]
(4)结晶
[0187]
向纳滤好的洗脱液中加入乙醇，搅拌1h并陈化1h后使用滤纸过滤，随后用少量的乙醇冲洗滤纸并将滤纸进行真空干燥，最后得到产物腺苷甲硫氨酸(图2)，最终收率约为40％(腺苷甲硫氨酸的摩尔产量/甲硫氨酸的摩尔添加量*100％)。
[0188]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。