一种基于荧光素酶报告基因的细胞毒性快速检测方法、细胞株的构建方法及其应用

16h，挑菌进行pcr鉴定，对阳性菌落提取质粒，酶切鉴定重组质粒，将阳性克隆进行测序，测序比对成功后，抽提质粒，获得构建好的重组表达质粒fthl29-pgl6-ta；
13.s2：fthl29-pgl6-ta质粒转染细胞：
14.s2.1：hepg2细胞复苏与培养：冻存的hepg2细胞先在40℃水浴中溶解，溶解后转入37℃水浴中进行复苏，复苏后800r/min离心5min，吸去上清，加入优化的dmem培养液，置于培养箱中培养；
15.s2.2：细胞转染：铺板hepg2细胞，培养12h后加入到转染体系中37℃培养48h，弃去转染液，加入培养液，待细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞汇合度为30％，进行阳性单克隆筛选，得到转染细胞；
16.s3：筛选稳定细胞系：
17.s3.1：g418筛选：将上述转染细胞用pbs洗涤，胰蛋白酶消化，接种到培养皿中，然后加入含g418的培养基，2-3天更换一次筛选培养基，当细胞汇合度在90％以上时将细胞转移至培养瓶中继续培养，加入含g418的培养基，转染的细胞长到70％以上，挑取单克隆细胞继续培养，加入含g418的培养基，此时g418浓度降一半；
18.s3.2：挑取单克隆与扩大培养：采用有限稀释法筛选阳性克隆，得到细胞株。
19.优选的是，在步骤s1.1中，从ncbi上获取斑马鱼fthl29基因的转录起始位点上游3kb的碱基序列，为启动子片段。
20.上述任一方案中优选的是，在步骤s1.2中，所述大肠杆菌感受态细胞采用top10感受态细胞。
21.上述任一方案中优选的是，在步骤s1.3中，所述抗生素为氨苄青霉素。
22.上述任一方案中优选的是，在步骤s2.1中，所述优化的dmem培养液为含10％胎牛血清和1％青链霉素双抗生素的dmem培养液，所述培养箱中的培养条件为5％co2和37℃。
23.上述任一方案中优选的是，在步骤s2.2中，所述转染体系包括2.5μg fthl29-pgl6-ta质粒、1.25μg psv-β-galactosidase内对照质粒、5μl p3000
tm
试剂、3.75μl lipofectamine 3000试剂和250μl dmem培养基。
24.上述任一方案中优选的是，在步骤s3.2中，所述有限稀释法筛选阳性克隆的步骤为：制备细胞悬液，细胞计数，培养液稀释细胞到1个/10μl，在96孔板中加入含g418的培养基150μl/孔，g418浓度为250μg/ml，再加入细胞悬液10μl/孔，在显微镜下挑取阳性克隆，转入到新孔中培养，重复筛选，待培养的细胞基本不再死亡时，pcr鉴定，得到细胞株。
25.在步骤s3.1之前需要确定g418的最佳筛选浓度，其中主要确定步骤为取hepg2细胞接种于24孔板，待细胞汇合度约30％时，吸除原培养基，加入含不同浓度g418的培养液，设置7个浓度：200、300、400、500、600、700、800μg/ml。每三天更换培养液，观察细胞死亡情况，发现10～14天内能够杀死所有细胞的最小g418浓度500μg/ml，所以确定500μg/ml为g418的最佳筛选浓度。
26.一种基于荧光素酶报告基因细胞株在表征污染物毒性方面的应用，特异性高，敏感性高，便于高通量检测，能快速指示污染物有关细胞死亡的早期毒性。
27.一种基于荧光素酶报告基因细胞株在表征实际水样综合毒性方面的应用，实际水体中的污染物种类繁多，如重金属、药品及个人护理品、农药、持久性有机污染物等，并且部分污染物以较低浓度存在于废水中，无法响应敏感度低的毒性检测方法。本发明提供的荧
光素酶报告基因细胞株可对复杂的实际水体的毒性进行全面表征，通过细胞的荧光素酶活性检测从而灵敏地指示出水中复杂污染物的铁死亡相关细胞毒性效应，具有特异性高，检测限低的优点。
28.本发明的技术效果和优点：1、本发明以铁死亡相关基因启动子构建的报告基因细胞株能快速指示早期的细胞毒性，其特异性高、敏感性高，且便于高通量检测；
29.2、本发明构建的细胞株既适用于大多数毒害污染物的毒性效应检测，表征铁死亡相关细胞毒性，也能用于复杂实际水样的毒性表征；
30.3、本发明采用以荧光素酶作为报告基因的检测方法简单，可快速指示污染物和水样的有关细胞死亡的早期毒性。
附图说明
31.图1为实施例1中构建的fthl29-pgl6-ta报告基因质粒；
32.图2为实施例1中酶切鉴定fthl29-pgl6-ta重组质粒；
33.图3为实施例2不同浓度亚砷酸钠染毒后的细胞活性；
34.图4为实施例2不同浓度亚砷酸钠染毒后相对荧光素酶活性；
35.图5为实施例3不同浓度水样染毒后的细胞活性；
36.图6为实施例3不同浓度水样染毒后相对荧光素酶活性。
37.其中图2中左侧泳道为fthl29-pgl6-ta重组质粒，中间泳道为fthl29-pgl6-ta质粒酶切产物，右侧泳道为dna marker；图4中control表示未经转染的hepg2细胞且未染毒亚砷酸钠的相对荧光素酶活性，其余组表示成功转染后的hepg2细胞染毒对应浓度亚砷酸钠的相对荧光素酶活性；图6中control表示未经转染的hepg2细胞且未染毒的相对荧光素酶活性，0表示成功转染后的hepg2细胞未染毒的相对荧光素酶活性，其余组表示成功转染后的hepg2细胞染毒对应浓度水样的相对荧光素酶活性。
具体实施方式
38.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
39.实施例1：
40.一种基于荧光素酶报告基因的细胞毒性快速检测方法，按照先后顺序包括以下步骤：
41.(1)构建基于荧光素酶报告基因细胞株；
42.(2)待测样品配置成溶液后加入到培养液中，然后将培养液加入到含有细胞株的培养基中，吸进培养液后，测定荧光素酶活性来检测细胞毒性。
43.实施例2：
44.一种基于荧光素酶报告基因细胞株的构建方法，按照先后顺序包括以下步骤：
45.s1：构建fthl29-pgl6-ta质粒：
46.s1.1：启动子合成：从ncbi上获取斑马鱼fthl29基因的转录起始位点上游3kb的碱基序列，为启动子片段，通过化学合成方法合成fthl29基因启动子片段；
47.s1.2：连接转化：首先将pgl6-ta载体用kpni和xhoi酶切，然后将酶切后的pgl6-ta载体与fthl29基因启动子片段进行酶连，酶连结束后转化到top10感受态细胞中；
48.s1.3：筛选验证：将转化后的大肠杆菌涂布在含有抗生素的平板上，抗生素为氨苄青霉素，倒置培养12-16h，挑菌进行pcr鉴定，对阳性菌落提取质粒，酶切鉴定重组质粒，将阳性克隆进行测序，测序比对成功后，抽提质粒，获得构建好的重组表达质粒fthl29-pgl6-ta；
49.s2：fthl29-pgl6-ta质粒转染细胞：
50.s2.1：hepg2细胞复苏与培养：冻存的hepg2细胞先在40℃水浴中溶解，溶解后转入37℃水浴中进行复苏，复苏后800r/min离心5min，吸去上清，加入优化的dmem培养液，优化的dmem培养液为含10％胎牛血清和1％青链霉素双抗生素的dmem培养液，置于培养箱中培养，设置培养箱中的培养条件为5％co2和37℃；
51.s2.2：细胞转染：铺板hepg2细胞，培养12h后加入到转染体系中37℃培养48h，转染体系包括2.5μg fthl29-pgl6-ta质粒、1.25μg psv-β-galactosidase内对照质粒、5μl p3000
tm
试剂、3.75μl lipofectamine3000试剂和250μl dmem培养基，弃去转染液，加入培养液，待细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞汇合度为30％，进行阳性单克隆筛选，得到转染细胞；
52.s3：筛选稳定细胞系：
53.s3.1：g418筛选：将上述转染细胞用pbs洗涤，胰蛋白酶消化，接种到培养皿中，然后加入含g418的培养基，2-3天更换一次筛选培养基，当细胞汇合度在90％以上时将细胞转移至培养瓶中继续培养，加入含g418的培养基，转染的细胞长到70％以上，挑取单克隆细胞继续培养，加入含g418的培养基，此时g418浓度降一半；
54.s3.2：挑取单克隆与扩大培养：采用有限稀释法筛选阳性克隆，得到细胞株。
55.优选的是，在步骤s1.1中，。
56.上述任一方案中优选的是，在步骤s3.2中，所述有限稀释法筛选阳性克隆的步骤为：制备细胞悬液，细胞计数，培养液稀释细胞到1个/10μl，在96孔板中加入含g418的培养基150μl/孔，g418浓度为250μg/ml，再加入细胞悬液10μl/孔，在显微镜下挑取阳性克隆，转入到新孔中培养，重复筛选，待培养的细胞基本不再死亡时，pcr鉴定，得到细胞株。
57.在步骤s3.1之前需要确定g418的最佳筛选浓度，其中主要确定步骤为取hepg2细胞接种于24孔板，待细胞汇合度约30％时，吸除原培养基，加入含不同浓度g418的培养液，设置7个浓度：200、300、400、500、600、700、800μg/ml。每三天更换培养液，观察细胞死亡情况，发现10～14天内能够杀死所有细胞的最小g418浓度500μg/ml，所以确定500μg/ml为g418的最佳筛选浓度。
58.实施例3：一种基于荧光素酶报告基因细胞株在表征污染物毒性方面的应用：
59.选择亚砷酸钠作为污染物，首先利用cck-8试剂盒检测hepg2细胞活性，暴露浓度设为0、0.25、0.5、1、2.5、5μm，以细胞活性达95％的最大浓度作为亚砷酸钠的最大暴露浓度，实验结果如图3所示，最终确定0.5μm为亚砷酸钠的最大暴露浓度。
60.设置6个暴露浓度：0、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5μm，并且设置未经转染的hepg2细胞且未染毒亚砷酸钠的对照组，每组均设置6个平行。在暴露前，稳转细胞接种在96孔板12h，除去原有培养基，加入150μl含各个浓度亚砷酸钠的培养液，暴露48h后，吸尽培养液，
pbs冲洗细胞，用萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，检测方法如下：每孔加入100μl细胞裂解液裂解细胞，充分裂解后，10000g离心3-5分钟，取100μl上清，加入100μl荧光素酶检测试剂混匀后，在酶标仪上测定，测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒。亚砷酸钠毒性越强，荧光素酶活性越高，生物荧光越强。实验结果如图4所示。
61.通过图4可知，不同浓度亚砷酸钠染毒组与对照组之间具有显著性差异(p《0.05)，亚砷酸钠暴露使荧光素酶活性增强，荧光素酶活性与亚砷酸钠存在一定的剂量效应关系，0.5μm亚砷酸钠染毒使荧光素酶活性增至2.86倍。结果说明本发明构建的报告基因细胞株能够检测污染物的铁死亡相关细胞毒性，且能够检测低浓度的污染物。
62.实施例5：一种基于荧光素酶报告基因细胞株在表征实际水样综合毒性方面的应用：
63.采集污水处理厂的出水，首先利用cck-8试剂盒检测hepg2细胞活性，水样经过固相萃取后，以dmso复溶，经培养液稀释至不同浓度：原水浓度的0、1、25、50、75、100、125倍，以相对浓缩倍数ref表示，以细胞活性达95％的最大浓度作为水样的最大暴露浓度，实验结果如图5所示，最终确定ref＝75作为水样的最大暴露浓度。
64.设置水样的暴露浓度：ref为0、1、25、50、75，并且设置未经转染的hepg2细胞且未染毒水样的对照组，每组设置6个平行。在暴露前，稳转细胞接种在96孔板12h，除去原有培养基，加入150ul各个浓度的水样，暴露48h后，吸尽培养液，pbs冲洗细胞，用萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。检测方法如下：每孔加入100μl细胞裂解液裂解细胞，充分裂解后，10000g离心3-5分钟，取100μl上清，加入100μl荧光素酶检测试剂混匀后，在酶标仪上测定，测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒。水样毒性越强，荧光素酶活性越高，生物荧光越强。实验结果如图6所示。
65.通过图6可知，不同浓度的水样染毒组与对照组之间具有显著性差异(p《0.05)，水样暴露使荧光素酶活性增强，荧光素酶活性与水样浓度存在一定的剂量效应关系，相对浓缩倍数为75的水样染毒使荧光素酶活性增至2.6倍。结果说明本发明构建的报告基因细胞株能够检测实际水体的铁死亡相关细胞毒性，且能够检测原水浓度的水样。
66.通过图1-6可以说明，本发明构建的报告基因细胞株能够检测实际水体的铁死亡相关细胞毒性，且具有较低的污染物浓度和实际水体浓度的检测限。
67.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。