一种检测烟雾病易感基因RNF213常见突变位点的方法和试剂盒与流程

一种检测烟雾病易感基因rnf213常见突变位点的方法和试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测烟雾病易感基因rnf213常见突变位点的方法和试剂盒。


背景技术：

2.烟雾病是一种慢性进展性颅内血管狭窄或闭塞性疾病，其以颅内双侧颈内动脉末端及大脑前动脉、大脑中动脉起始部狭窄或闭塞，并在颅底出现大量代偿性侧支血管为主要病理特点。烟雾病发病年龄早，症状以脑梗死或脑出血为主，致残率及致死率较高，病情严重。目前对该病尚无理想的治疗手段，因此，明确病因，早期诊断尤为重要。烟雾病有一定的种族和家族聚集性，强烈提示遗传因素的影响。
3.环指蛋白213(ring finger protein 213，rnf213)是第一个被发现的烟雾病易感基因。rnf213为经过全基因组关联研究及外显子测序研究双重确定的烟雾病易感基因，多项研究证实rnf213基因多样性与烟雾病发病风险相关。可作为烟雾病的一种生物标记物，用于早期诊断以及疾病筛查、烟雾病的疾病谱和亚型分型、烟雾病自然史的研究。r4810k(c.14576g》a)位点的基因多态性是广泛存在于东亚人群中的基础性突变。此位点的变异率在中日韩烟雾病样本中并不相同，日本：60-90％，韩国：73-79％，中国：13-31.4％。同时也有研究表明rnf213基因p.a4399t位点也为常见烟雾病突变位点。
4.目前检测遗传性易感基因的主要方法仍然是通过全基因组测序(wgs)或者sanger测序的方法进行，不仅速度慢且不适合所有分子诊断实验室。因此开发一种快速的、灵敏的、便捷的、灵敏度高的一种检测烟雾病易感基因rnf213常见突变位点的方法及试剂盒对于本领域烟雾病的治疗和早期发现具有重要意义。荧光检测具有灵敏度高，选择性好等优点，在生物检测与生化分析中起着不可替代的作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种可用于rnf213基因突变临床样本快速检测的试剂盒和方法，解决现有技术中检测成本过高无法大规模应用的问题。针对rnf213基因p.r4810k和p.a4399t位点设计并通过对试剂盒中使用的crrna进行筛选特异性更高的crrna，结合crispr-cas12a系统，以检测待测样本中是否存在rnf213基因p.r4810k和p.a4399t位点的基因突变。
6.为达到上述技术目的，本发明的技术方案首先提供一种用于检测烟雾病易感基因rnf213 p.r4810k和p.a4399t突变位点的crdna，包括：
7.rnf213p.r4810k突变位点的crdna：其序列如seq id no.1-3任一所示；
8.rnf213p.a4399t突变位点的crdna：其序列如seq id no.4-6任一所示。
9.相应的，还提供rnf213 p.r4810k和p.a4399t突变位点的crrna，包括：
10.rnf213p.r4810k突变位点的crrna：其序列如seq id no.7-9任一所示；
11.rnf213p.a4399t突变位点的crrna：其序列如seq id no.10-12任一所示。
12.本发明提供一种检测烟雾病易感基因rnf213p.r4810k和p.a4399t突变位点的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
13.(1)针对烟雾病易感基因rnf213序列，设计权利要求2所述p.r4810k和p.a4399t突变位点的crrna序列，如序列表中seq id no：7～12所示；
14.(2)针对步骤(1)所述p.r4810k和p.a4399t突变位点设计引物，rnf213p.r4810k和p.a4399t突变位点的扩增引物对序列如序列表中seq id no：13～16所示，对待测核酸样品进行pcr反应，获得扩增产物；
15.(3)将步骤(1)所述crrna，步骤(2)所述扩增产物、cas12a蛋白、荧光探针和无酶水构成检测体系进行检测。
16.本发明提供一种检测烟雾病易感基因rnf213p.r4810k和p.a4399t突变位点的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的crdna和/或权利要求2所述的crrna。
17.具体的，所述检测试剂盒还包括cas12a蛋白和荧光探针。
18.具体的，所述检测试剂盒中还包括dna酶抑制剂。
19.具体的，所述cas12a蛋白为fncas12a蛋白。
20.具体的，所述荧光探针序列的5’端标记有荧光基团，3’端标记有猝灭基团。
21.更具体的，所述荧光基团选自fam、vic、hex、trt、cy3、cy5、rox和joe中的任一种，所述猝灭基团选自bhq-1、bhq-2和bhq-3中的任一种。
22.本发明还提供上述crdna、crrna以及任意一种检测试剂盒在检测rnf213 p.r4810k和p.a4399t位点基因突变的非疾病诊断和治疗目的上的用途。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
24.本发明基于rnf213基因的两个突变位点p.r4810k和p.a4399t设计相应的crrna，并对crrna进行筛选验证，同时结合crispr-cas12a系统，可在短时间内通过荧光信号的变化，检测待测样本中是否存在相应的烟雾病易感基因rnf213的基因突变。所述试剂盒及检测方法不仅操作简单、检测速度快、成本低、可多次重复检测，同时检测灵敏度和检测特异性也显著提高，结果可直观分析，在对rnf213基因p.r4810k突变位点的临床样本野生型和突变型在检测20min即有显著荧光差异，在对rnf213基因p.a4399t突变位点的临床样本野生型和突变型在检测15min即有显著荧光差异，满足快速实时检测的需求，非常适用于临床样本检测。
附图说明
25.图1为本发明实施例3中rnf213p.r4810k突变位点3个crrna的筛选检测结果；
26.图2为本发明实施例3中rnf213p.a4399t突变位点3个crrna的筛选检测结果；
27.图3为本发明实施例4中rnf213p.r4810k位点的临床样本检测结果；
28.图4为本发明实施例4中rnf213p.a4399t位点的临床样本检测结果。
具体实施方式
29.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并
不用于限定本发明。
30.实施例1靶向基因突变位点crrna的的设计及获得
31.(1)靶向基因突变位点crrna设计原则
32.由于crispr-cas12a系统是一种新型的靶向dna基因编辑系统，其中cas12a与crrna结合形成监测复合物，crrna的向导区域用互补序列识别目标dna，并且cas12a降解目标dna链。其中所述crrna设计要求：crrna包括蛋白锚定序列和向导序列，序列格式为：5`-与cas12a蛋白结合的锚定序列-crrna向导序列-3`，蛋白锚定序列需要根据cas12a蛋白来确定，使其能够与选定的cas12a蛋白匹配并结合；向导序列则与靶向dna中的片段匹配。
33.(2)crdna序列的选择
34.本发明中选用的cas12a蛋白为fncas12a，因此选定与cas12a蛋白结合的锚定序列为aauuucuacuguuguagau，所述crrna序列根据现有技术已知的rnf213基因p.r4810k和p.a4399t两个突变位点区域设计，每个突变位点设计了三个相应的crdna，其序列具体为：
35.rnf213基因p.r4810k突变位点3个crdna：其序列如seq id no.1-3任一所示；
36.rnf213基因p.a4399t突变位点3个crdna：其序列如seq id no.4-6任一所示；
37.(3)crrna的获得
38.使用t7高产量转录试剂盒(neb)将crdna用作crrna生物合成的模板，转录反应体系如表1所示。在37℃下孵育12小时后，将dnase i添加到反应溶液中，并在37℃下孵育30分钟以消化剩余的dna片段。使用rna纯化试剂盒纯化转录的crrna，并储存在-80℃。
39.表1转录反应体系
[0040][0041][0042]
所得crrna为：
[0043]
rnf213基因p.r4810k突变位点3个crrna：其序列如seq id no.7-9任一所示；
[0044]
rnf213基因p.a4399t突变位点3个crrna：其序列如seq id no.10-12任一所示；
[0045]
实施例2 rnf213基因p.r4810k和p.a4399t突变位点的检测试剂盒及检测方法
[0046]
1、试剂盒的组成
[0047]
本试剂盒包括rnf213基因p.r4810k和/或p.a4399t突变位点的各2个crrna(2个突变位点对应的sgrna如实施例1所示获得)或者2个crdna(当试剂盒中为crdna时，需要操作者先将crdna片段分别在t7rna聚合酶作用下生成rna，回收纯化得到crrna，具体见实施例1)、一条特异性荧光探针(如表2所示)、cas12a蛋白(本实施例采用的是fncas12a)、无酶水、dna酶抑制剂；
[0048]
表2荧光探针序列
[0049]
荧光探针序列(5
’‑3’
)探针1fam-tttttttt-bhq1探针2fam-tttttttttt-bhq1探针3fam-tttttttttttt-bhq1
[0050]
进一步的，所述试剂盒中还可包括扩增体系，所述扩增体系包括扩增引物对，各突变位点的引物对具体为：
[0051]
rnf213基因p.r4810k突变位点的扩增引物对序列如seq id no.13-14所示；
[0052]
rnf213基因p.a4399t突变位点的扩增引物对序列如seq id no.15-16所示。
[0053]
2、rnf213基因p.r4810k和p.a4399t突变位点的检测方法
[0054]
(1)取10-50ng待测样本dna，加入扩增体系中，扩增体系如表3所示，其中所述引物为如上所示的对应的扩增引物对。
[0055]
表3扩增体系
[0056][0057]
(2)将所述得到的扩增产物加入检测混合液(混合液中包含100-200nm纯化的fncas12a，50-100nm crrna，1-5μl合成的荧光探针，2μl dna酶抑制剂和无酶水)，在检测缓冲液(nebuffer 2.1)37℃孵育0.5～1小时，检测体系如表4所示。
[0058]
表4检测体系
[0059][0060]
将所述检测体系孵育后利用荧光检测仪持续测定荧光值，同时设立阴性对照组(将扩增产物替换为无酶水)，统计分析40min内反应前后荧光值的变化情况，以判断待测待测样本dna中是否存在相应的rnf213基因p.r4810k和p.a4399t突变位点的基因突变。
[0061]
实施例3 crrna对野生型和突变型序列的特异性检测
[0062]
合成野生株(wt)和突变株(mut)的靶序列，分别利用实施例1设计的6个crrna构建检测体系进行检测筛选，检测结果如图1所示，其中r4810k-crrna1为seq id no.7所示序列，r4810k-crrna2为seq id no.8所示序列，r4810k-crrna3为seq id no.9所示序列；a4399t-crrna1为seq id no.10所示序列，a4399t-crrna2为seq id no.11所示序列，
a4399t-crrna3为seq id no.12所示序列。根据检测结果，选取相较于野生株在突变株中荧光值变化更显著，即灵敏度更高，效果更优异的crrna，分别为seq id no.9所示的r4810k-crrna3，seq id no.10所示的a4399t-crrna1。
[0063]
实施例4 crrna在临床样本中的检测
[0064]
根据实施例3筛选得到的效果相对较优的2个crrna，选择6例临床样本检测p.r4810k和p.a4399t突变位点，并对结果进行汇总比对。
[0065]
一、检测方法
[0066]
1、利用dna提取试剂盒提取患者血液样本的dna，操作步骤严格按照说明书进行；
[0067]
2、按实施例2所述的检测方法进行扩增及检测反应，最后通过荧光值判断检测结果；
[0068]
二、检测结果
[0069]
检测结果如图3和图4所示：6例临床样本中，2-3号为rnf213基因r4810k位点突变，4号为rnf213基因r4810k和a4399t两个位点均突变，本方法在反应15-20min时，即可通过荧光检测清晰的区分野生型和突变型的样本。
[0070]
由上述结果可知，本发明实施例提供的试剂盒能有效实现rnf213基因r4810k和a4399t两个位点的检测，判断标本是否存在待检基因突变。
[0071]
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。