分泌磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用

1.本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种分泌磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用。


背景技术：

2.磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate，tdcipp)作为一种有机磷类阻燃剂，被广泛用于电子设备、家具、建筑业、泡沫和婴儿纺织品中。tdcipp已在各种不同的环境介质中被检出，如灰尘、室内空气、沉积物、生物群等，以及各种水环境中，如雪、降雨、河流、废水和饮用水中，甚至在母乳、尿液和头发中也有检出。毒理学研究表明，tdcipp在鱼体内会干扰甲状腺激素体内稳态，引起发育和神经发育毒性，以及造成生殖功能障碍。研究表明，与其他脂溶性有机污染物类似，tdcipp可通过母体转移到子代。
3.磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯(bis(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate，bdcipp)是tdcipp的主要代谢产物。体内和体外研究表明，tdcipp可通过o-脱烷基生物转化快速转化为bdcipp。bdcipp被认为是tdcipp在人肝微粒体(hlm)、人肝s9组分和人体尿液样品中的主要代谢物。因此，bdcipp被认为是人体对tdcipp暴露的一种生物标志物。有研究表明，bdcipp的致畸能力高于tdcipp四个数量级，会使斑马鱼胚胎生育率降低和发育受损。有研究在斑马鱼的肝脏和肠内检测到了浓度水平较高的bdcipp，表明肝胆系统(肝-胆汁-肠)是bdcipp代谢和排泄的主要场所。研究表明，tdcipp和bdcipp在老鼠体内的分布具有组织特异性，tdcipp易于在肌肉中累积，bdcipp易于在肾和肝中累积。bdcipp已经频繁在人体尿液、室内灰尘、废水和来自废水处理厂的污泥中检出。
4.目前，tdcipp和bdcipp的检测采用精密仪器分析测定，需依赖精密分析仪器例如气相色谱仪、质谱仪等，对操作人员的专业知识要求高，操作规范性要求高，且操作繁琐费时，成本较高，不能广泛推广使用。基于抗原-抗体特异性结合的免疫学分析技术例如基于抗原-抗体特异性结合的胶体金免疫层析、荧光免疫层析等检测方法，具有灵敏度、特异性较好，不依赖精密分析仪器，操作方便、时间短、成本低的特点，是一种易于现场即时使用的检测技术。如能开发用于检测tdcipp、bdcipp的免疫层析检测方法和产品将利于tdcipp、bdcipp检测的广泛推广及使用。


技术实现要素：

5.基于免疫反应的检测方法核心是特异性识别磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯的单克隆抗体，该抗体的结合灵敏度和特异性决定了检测方法的准确性，因此好的抗磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体的研制是该类检测方法开发的关键前提。
6.本发明提供了一株可以分泌特异性识别并高亲和力结合磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌产生的磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆
抗体。
7.本发明还提供了所述杂交瘤细胞株所分泌的磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体的应用，可用于检测磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯。
8.本发明提供了以下具体技术方案：
9.一种杂交瘤细胞株，保藏编号为cctcc no：c2021137。该细胞株命名为杂交瘤细胞株6f7，于2021年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no：c2021137。
10.一种磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
11.所述磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体，可变区氨基酸序列包括如seq id no.1所示的重链和seq id no.2所示的轻链；
12.重链可变区氨基酸序列
13.seq id no.1：
14.qvqlqqsgaelanpgasvkmscktsgytftdywihwvkqgpgqglewigyiipssgytkydqkvkdkatltadkssttvymqltsltsedsavyycarrgsiitstyyfdhwgqgttltvss；
15.轻链可变区氨基酸序列
16.seq id no.2：
17.sivmtqtpkfllvsagdrvtitckasqsvrndvtwyqqkpgqspklliyyasnrytgvpdrftgsgygtdftftistvqaedlavyfcqqdysfpytfgggtklekn。
18.所述磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体能够特异性识别磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯并高亲和力结合磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯，可用于检测磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯。
19.所述磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体可用于制备磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯检测试剂盒，进行磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯定性和/或定量测定。
20.所述用于检测磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯的试剂盒，含有所述的磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体。
21.相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
22.首次获得高效结合磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯抗原的单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株，为后续抗体试剂应用于磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯的检测提供了基础。
23.本发明磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体，能够特异性识别磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯并高亲和力结合磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯，可用于检测磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯。
附图说明
24.图1为抗磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体elisa效价检测结果曲线图；其中，横坐标表示抗体浓度(ng/ml)，纵坐标表示450nm od值，bsa代表空白对照组，b-bsa代表磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体组。
具体实施方式
25.以下结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。
26.以下为本发明杂交瘤细胞株6f7、磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体具体制备过程。如无特殊说明，本发明所述实验过程所用试剂、材料均为常规商品化试剂和材料，所用方法为标准实验方法(具体细节参照《抗体技术实验指南》(e.哈洛著，科学出版社，2005)和《抗体制备与使用实验指南》g.c.霍华德著，科学出版社，2010)，所提及学术专用名词及其英文缩写如无特殊说明均按照全国科学技术名词审定委员会编《免疫学名词》(科学出版社，2008)的规定使用。
27.磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯购自杭州拜宜。小鼠骨髓瘤细胞系sp2/0购自中科院细胞库。
28.实施例1半抗原偶联
29.磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯蛋白偶联物即磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯和牛血清白蛋白(bsa)通过化学方法偶联在一起的抗原(简称b-bsa)，采用高碘酸钠的方法进行偶联。
30.第一天：
31.(1)称取5mg bdcipp溶解于1ml蒸馏水中，得到bdcipp溶液。
32.(2)于上述bdcipp溶液中加入0.2ml新配的0.1m(mol/l)naio4水溶液，室温下避光搅拌20分钟。
33.(3)将步骤(2)中的溶液装入透析袋中，对1mm(mmol/l)ph4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，得到醛化bdcipp溶液。
34.第二天：
35.(4)加20μl0.2m ph9.5碳酸盐缓冲液，使步骤(3)中醛化bdcipp溶液的ph升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg bsa，室温避光轻轻搅拌2小时。
36.(5)在步骤(4)的反应液中加0.1ml新配的4mg/mlnabh4水溶液，混匀，再置4℃2小时。
37.(6)将步骤(5)的反应液装入透析袋中，对0.15m ph7.4 pbs缓冲液透析，4℃过夜。
38.第三天：
39.(7)将步骤(6)的反应液在搅拌下逐滴加入该反应液等体积饱和硫酸铵水溶液，置4℃1小时。
40.(8)将步骤(7)的反应液在3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵水溶液(50％饱和度，质量百分比)洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15m ph7.4的pbs缓冲液中得到溶液。
41.(9)将步骤(8)中溶液装入透析袋中，对0.15m ph7.4的pbs缓冲液透析，4小时换液一次。去除铵离子后10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为b-bsa结合物，分装后，冰冻保存。
42.实施例2动物免疫
43.实验动物采用balb/c品系雌性6周龄小鼠。免疫流程：用b-bsa与freund’s完全佐剂混合，乳化后，皮下多点注射进行免疫。b-bsa的剂量为0.1mg/次/只。首次免疫用完全freund’s佐剂，再次免疫用不完全freund’s佐剂。每次免疫的间隔时间为3周，共3次免疫。第三次免疫后，进行细胞融合前对小鼠的回忆刺激，0.1mg抗原b-bsa溶解于0.5mlpbs缓冲液中，腹腔注射。回忆刺激后3天，进行细胞融合和杂交瘤构建。
44.实施例3杂交瘤细胞株构建
45.细胞融合前一天制备饲养细胞悬液：一只小鼠可获得5
×
106个-8
×
106个腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5
×
106个/ml，小鼠脾细胞为1
×
106个/ml，小鼠的成纤维细胞(3t3)1
×
105个/ml，均为100μl/孔。
46.(1)取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞sp2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液(rpmi1640)混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液(rpmi1640)洗涤2次。
47.(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
48.(3)将小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞按细胞数之比1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟。弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响后续聚乙二醇(peg)的浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
49.(4)在室温下融合：30秒内向步骤(3)装有细胞的离心管内加入预热的1ml 45％(质量百分比)peg(merck，分子量4000)水溶液，peg水溶液中含5％(质量百分比)二甲基亚砜(dmso)，边加边搅拌。作用90秒钟。加预热的不完全培养液，终止peg作用，每隔2分钟分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml rpmi1640。离心，800rpm，6分钟。弃上清，剩余物先用6ml20％(质量百分比)小牛血清rpmi1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开，得到融合后细胞。
50.(5)根据所用96孔培养板的数量，在融合后细胞中补加完全培养液，一般10ml一块96孔板，得到融合后细胞悬液。
51.(6)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞悬液(饲养细胞选用腹腔巨噬细胞)的96孔板，100μl/孔，37℃、5％(体积百分比)co2孵箱培养。
52.(7)在融合培养24小时后，加hat选择培养液。用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。37℃、5％(体积百分比)co2培养3-7天。
53.实施例4杂交瘤细胞株的单克隆化
54.(1)制备饲养细胞悬液：一只小鼠可获得5
×
106个-8
×
106个腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5
×
106个/ml，小鼠脾细胞为1
×
106个/ml，小鼠的成纤维细胞(3t3)1
×
105个/ml，均为100μl/孔。
55.(2)阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1
×
103个/ml-5
×
103个/ml。
56.(3)取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加a、b、c三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100μl/孔加d、e、f三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100μl/孔，加g、h两排，为每孔0.5个细胞。培养4-5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl/孔。第8-9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。注：初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加ht培养液。
57.(4)采用有限稀释法连续克隆阳性杂交瘤细胞3次，获得稳定的杂交瘤细胞株，并扩大培养、冻存。
58.获得的杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株6f7，属于小鼠杂交瘤细胞株(mus musculus)，于2021年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no：c2021137。
59.实施例5抗体生产
60.(1)在小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后1-9周内种植杂交瘤细胞。
61.(2)收取对数生长期的杂交瘤细胞，用不完全培养液洗涤一次，1000r/min离心10min。取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用不完全培养液配成1.0
×
107个细胞/ml的悬液。
62.(3)给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml(含1.0
×
107个细胞/ml)。接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1-3天取1次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。
63.实施例6抗体纯化
64.(1)小鼠腹水用冷pbs缓冲液稀释4倍后，于1
×
105转离心30min，去沉淀。在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵水溶液，边加边搅拌，使溶液最终为50％(体积百分比)硫酸铵浓度。
65.(2)50％硫酸铵浓度溶液置冰中30min-60min，然后5000r/min离心10min，去上清。将沉淀溶于tris-hcl缓冲液(含40mmol/l nacl)中(溶液可能混浊)。装入透析袋于tris-hcl缓冲液(含20mmol/l nacl)中透析除盐。离心去沉淀。溶液稀释(1:100或更高倍稀释)后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量：1a 280unit＝0.8mg蛋白质。一般每ml腹水中，含有总蛋白质约25mg-36mg。
66.(3)过deae-纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mmol/l nacl tris-hcl缓冲液平衡。透析样品以tris-hcl缓冲液(20mmol/l nacl)等量稀释。样品进入柱床速度为1ml/min-2ml/min，以nacl水溶液线形梯度洗脱。大部分单克隆抗体igg于40mmol/l和80mmol/l nacl水溶液洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120mmol/l-150mmol/l nacl水溶液洗脱。测od280nm收集蛋白峰，单克隆抗体igg保存备用。获得纯化后的磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体。
67.实施例7检测磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯抗原识别(elisa)
68.(1)抗原包被：取抗原b-bsa和bsa对照分别用ph9.6的碳酸盐缓冲液配制成一定浓度的包被液，混匀。加入96孔elisa检测板，100μl/孔。置于4℃冰箱内过夜。
69.(2)封闭、洗板：加封闭液(bsa溶于pbs缓冲液，bsa质量百分浓度0.5％)，200μl/孔。37℃温箱温育2小时。
70.(3)加一抗(待测样品)、洗板：将处理好的一抗溶液加到孔内，100μl/孔，一抗溶液选用细胞融合后杂交瘤细胞培养上清液(即实施例3中第(7)步中培养物离心后的上清液)或免疫抗原的小鼠血清(完成实施例2免疫程序7天后采用尾静脉采血分离制备的小鼠血清)稀释液或者实施6纯化后的磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体。37℃温箱温育2小时。
71.(4)加二抗、洗板：稀释好的二抗(商品化羊抗鼠ig-hrp，如：ab6789，abcam，1:2000稀释使用)加入孔内。100μl/孔。37℃温育1小时。
72.(5)显色、洗板：配好tmb底物(即tmb显色液)，加入孔中，100μl/孔。显色5min-10min。加2m(mol/l)硫酸100μl/孔终止反应。
73.(6)检测。用酶标仪检测溶液在450nm下的吸光度od值。得到数据。检测结果见图1。其中，elisa效价曲线为：y＝(a-d)/(1+(x/c)b)+d；bsa时，a＝0.11，b＝24.9，c＝105，d＝
0.0937，r2＝0.3；b-bsa时，a＝0.395，b＝1.62，c＝28.2，d＝2.35，r2＝0.996。
74.elisa检测结果表明，本发明磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体对磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯抗原具有特异性识别活性，能够高亲和力结合磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯抗原，抗体浓度4ng/ml时仍对b-bsa有明显识别性反应，而对bsa无识别性。可见，本发明磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体可用于检测磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯。
75.实施例8抗体基因序列获得
76.(1)rna抽提
77.将杂交瘤细胞株6f7用胰酶消化至细胞悬浮，1000rpm，5min离心，pbs缓冲液洗涤两次，血球计数板确定细胞至107个/ml；加入1mltri溶液(sigma-aldrich)裂解，用微量移液器吹打混匀，室温5min之后加入200μl氯仿(剧烈摇匀，室温5min，冰上5min)；高速离心12000g，15min，4℃之后，取水相(600μl)加入等体积异丙醇(室温5min，冰上5min)，加完异丙醇立即上下颠倒5-10次混匀；高速离心12000g，15min，4℃，倾倒除去上清，并用移液器吸干；1ml75％(质量百分比)乙醇水溶液清洗一次，吹打均匀，离心7500g，5min，4℃去上清；在空气室温下干燥20min，加入50μl ddh2o(depc treated)；检测od值，1％(质量百分比)琼脂糖(agarose)电泳以确定rna的质量和浓度。
78.(2)rt-pcr与5’race pcr
79.将反转录引物random primer和rna按比例混匀后，70℃水浴10min，冰浴2-3min；然后加入反转录系统试剂(thermo scientific fisher)，37℃水浴1.5h，95℃水浴5min，冰浴，-20℃冻存。反转录后用持家基因hprt引物进行聚合酶链式反应(pcr)，检测rna反转录所得到的cdna质量。
80.rt-pcr系统(system)(40μl)：
[0081][0082]5′
race pcr利用tdt酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5
′
末端时自动加上3-5个(dg)残基；然后用含有部分接头序列的通用引物poly c(universal primer)作为上游引物，用基因特异引物作为下游引物，以g-cdna为模板进行pcr，扩增目的基因5
′
末端的cdna片段。获得cdna之后，取1μl的cdna加入3μl的dgtp和2μl的tdt酶(promega)，在37℃温浴15分钟后迅速放入70℃温浴10分钟，即获得了加g尾的cdna。
[0083]
在50μl的pcr反应体系中，加入1μl加g尾的cdna模版、1μl的polyc和特异性引物(见表1)，在0.5μl的taq platium(qiagen)的作用下进行扩增延伸；
[0084]
表1扩增抗体可变区基因引物序列
[0085][0086]
反应条件为：
[0087][0088]
(3)酶切、连接、转化dh5a
[0089]
胶回收获得pcr产物，在该末端平滑dna片段的3'末端加上a尾，然后与pgem-t vector(promega)进行连接，16℃连接3h以上用于转化，也可置于4℃连接过夜。
[0090]
连接system(10μl)
[0091][0092]
连接后取出感受态菌dh5a室温放置至半融状态。加入5μl重组质粒，轻搅至混匀。冰浴30min，42℃热休克45s-50s，置冰上2min-3min。加入500μlamp-lb液体培养基，37℃摇床培养20min-30min。取菌液300μl涂平板，37℃倒置培养12h-16h。在得到一系列菌落后，通过蓝白斑筛选系统挑取阳性克隆，并且用pcr和酶切系统再次验证是否为阳性菌。获得阳性菌之后，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行质粒测序。检测结果显示：本发明磷酸双(1,3-二氯-2-丙基)酯单克隆抗体可变区氨基酸序列包括如seq id no.1所示的重链和seq id no.2所示的轻链；
[0093]
重链可变区氨基酸序列
[0094]
seq id no.1：
[0095]
qvqlqqsgaelanpgasvkmscktsgytftdywihwvkqgpgqglewigyiipssgytkydqkvkdkatltadkssttvymqltsltsedsavyycarrgsiitstyyfdhwgqgttltvss；
[0096]
轻链可变区氨基酸序列
[0097]
seq id no.2：
[0098]
sivmtqtpkfllvsagdrvtitckasqsvrndvtwyqqkpgqspklliyyasnrytgvpdrftgsgyg
tdftftistvqaedlavyfcqqdysfpytfgggtklekn。