包含LRRC15抗原结合结构域的多特异性T细胞接合剂的制作方法

本发明涉及癌症治疗领域，更具体地，涉及用于治疗癌症的包含抗lrrc15抗体或其免疫反应性片段的多特异性t细胞接合剂(t cells engagers)。

背景技术：

1、癌症通常被定义为一组涉及异常细胞生长的疾病，其具有侵入或扩散到身体其他部位的潜力。常规的癌症治疗旨在去除癌组织并防止其扩散。此类治疗选择包括手术、化学疗法、放射疗法、激素疗法、靶向疗法和姑息治疗。通常根据癌症的类型、位置和等级以及患者的健康和偏好进行治疗。但这些疗法有局限性，因为它们可能无效，特别是当癌症已经转移时。此外，化学疗法和放射疗法具有一系列与细胞毒性相关的副作用。

2、目前癌症治疗有前景的领域包括使用抗体的靶向治疗。另一个有前景的领域是开发利用免疫系统攻击和杀死肿瘤细胞的治疗方法。

3、富含亮氨酸重复序列15(leucine-rich repeat containing,lrrc15)是lrr(富含亮氨酸重复序列)超家族的成员。lrrc15在包括乳腺癌，脑肿瘤，胰腺癌，肺癌，黑色素瘤，高侵袭性肉瘤，乳腺癌骨转移等肿瘤细胞上选择性高表达而在正常组织中的表达水平相对较低。另外，它在许多实体瘤(例如，乳腺、头颈、肺、胰腺)的基质成纤维细胞上也高水平表达。因此，lrrc15是靶向治疗例如抗体药物偶联物、t细胞接合器和car-t细胞的候选者。

4、cd3、cd28和cd137是存在于t细胞上的受体。t细胞可以通过cd3、cd28和cd137被抗原呈递细胞激活，这些细胞分别利用mhci类和ii类激活信号、cd80和cd86以及4-1bbl。cd3是t细胞受体(tcr)的一部分，是受体的信号成分。cd3有3个亚基，epsilon、delta和gamma。epsilon与delta和zeta都有关联，它们共同负责信号传递。cd3信号被认为是激活t细胞所需的信号1。共同受体cd28和cd137被认为是信号2。信号1和信号2都是t细胞完全激活、增殖和存活所必需的。

5、cd40配体(cd40l)主要由活化的t细胞表达。cd40l与抗原呈递细胞(apc)上的cd40结合，从而诱导apc活化。反过来，apc会引发细胞毒性t淋巴细胞(ctl)。cd40和cd40l是连接先天免疫和适应性免疫的共刺激分子。

6、尽管已经批准了越来越多的用于治疗多种癌症的治疗性单克隆抗体，但是鉴于癌症生长和向转移发展具有许多不同分子途径，因此经常观察到这些抗体出现耐药性。尽管免疫系统是预防癌症的主要机制，但是癌细胞对抗免疫监视。因此，本领域迫切需要改进的治疗结合拮抗剂或抗体以及用这些试剂治疗癌症的方法。

技术实现思路

1、本发明提供了包含lrrc15抗原结合结构域的双/三特异性t细胞接合剂。双/三特异性t细胞接合剂分子可以与lrrc15结合并激活cd(分化簇)分子(例如cd3、cd28、cd137和cd40)。还提供了使用本发明的抗体和抗体偶联物、其药物组合物和制品治疗疾病例如癌症的方法。

2、本发明的第一方面，提供了一种多特异性t细胞接合剂(t cells engagers)，所述多特异性t细胞接合剂包含：

3、第一靶向结构域，所述第一靶向结构域包含一个或多个lrrc15抗原结合结构域；

4、第二靶向结构域，所述第二靶向结构域与选自下组的靶蛋白结合：cd3、cd28、cd40、或cd137；和

5、任选的第三靶向结构域，所述第三靶向结构域与选自下组的靶蛋白结合：cd3、cd28、cd40、或cd137。

6、在另一优选例中，所述靶向结构域为单域抗体(sdab)、片段可变(fv)异二聚体、单链fv(scfv)、fab片段、trifab或其组合的形式。

7、在另一优选例中，所述lrrc15抗原结合结构域包含如下三个重链可变区cdr：

8、hcdr1，其具有如seq id no:32、35、38、或41所示的氨基酸序列；

9、hcdr2，其具有如seq id no:33、36、39、或42所示的氨基酸序列；和

10、hcdr3，其具有如seq id no:34、37、40、或43所示的氨基酸序列；

11、以及，如下三个轻链可变区cdr：

12、lcdr1，其具有如seq id no:44或49所示的氨基酸序列；

13、lcdr2，其具有如seq id no:45、47、或50所示的氨基酸序列；和

14、lcdr3，其具有如seq id no:46、48、51、或52所示的氨基酸序列。

15、在另一优选例中,所述lrrc15抗原结合结构域包含选自下组的三个重链可变区cdr(hcdr)，以及三个轻链可变区cdr(lcdr)：

16、

17、在另一优选例中，所述lrrc15抗原结合结构域包含如下三个重链可变区cdr：

18、hcdr1，其具有如seq id no:32所示的氨基酸序列；

19、hcdr2，其具有如seq id no:33所示的氨基酸序列；和

20、hcdr3，其具有如seq id no:34所示的氨基酸序列；

21、以及，如下三个轻链可变区cdr：

22、lcdr1，其具有如seq id no:44所示的氨基酸序列；

23、lcdr2，其具有如seq id no:45所示的氨基酸序列；和

24、lcdr3，其具有如seq id no:46所示的氨基酸序列。

25、在另一优选例中，所述lrrc15抗原结合结构域包含如下三个重链可变区cdr：

26、hcdr1，其具有如seq id no:35所示的氨基酸序列；

27、hcdr2，其具有如seq id no:36所示的氨基酸序列；和

28、hcdr3，其具有如seq id no:37所示的氨基酸序列；

29、以及，如下三个轻链可变区cdr：

30、lcdr1，其具有如seq id no:44所示的氨基酸序列；

31、lcdr2，其具有如seq id no:47所示的氨基酸序列；和

32、lcdr3，其具有如seq id no:48所示的氨基酸序列。

33、在另一优选例中，所述lrrc15抗原结合结构域包含与如seq id no:1、2、3、或4所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的重链可变区，和与如seq id no:5、6、7、或8所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的轻链可变区。

34、在另一优选例中，所述lrrc15抗原结合结构域包含如seq id no:1所示的重链可变区，和如seq id no:5所示的轻链可变区。

35、在另一优选例中，所述lrrc15抗原结合结构域包含如seq id no:2所示的重链可变区，和如seq id no:6所示的轻链可变区。

36、在另一优选例中，所述lrrc15抗原结合结构域包含如seq id no:3所示的重链可变区，和如seq id no:7所示的轻链可变区。

37、在另一优选例中，所述lrrc15抗原结合结构域包含如seq id no:4所示的重链可变区，和如seq id no:8所示的轻链可变区。

38、在另一优选例中，所述lrrc15抗原结合结构域选自下组：scfv、fab、或其组合。

39、在另一优选例中，所述lrrc15抗原结合结构域为scfv。

40、在另一优选例中，所述lrrc15抗原结合结构域为fab，其包含如seq id no:1、2、3、或4所示的重链可变区，和如seq id no:5、6、7、或8所示的轻链可变区；以及

41、如seq id no:26或28所示的重链恒定区ch1，和如seq id no:30或31所示的轻链恒定区cl。

42、在另一优选例中，所述第二靶向结构域选自下组：cd3抗原结合结构域、cd28抗原结合结构域、cd40抗原结合结构域、cd137抗原结合结构域、cd40l序列、或cd137l序列。

43、在另一优选例中，所述第三靶向结构域选自下组：cd3抗原结合结构域、cd28抗原结合结构域、cd40抗原结合结构域、cd137抗原结合结构域、cd40l序列、或cd137l序列。

44、在另一优选例中，所述多特异性t细胞接合剂还包含fc片段。

45、在另一优选例中，所述fc片段来源于igg1或igg4。

46、在另一优选例中，所述fc片段为来源于igg1的fc片段，其具有如seq id no:27所示的氨基酸序列。

47、在另一优选例中，所述来源于igg1的fc片段具有选自下组的突变：n297a,

48、l234f/l235e/p331s,

49、y349c/k370e/k409d/k439e,

50、s354c/d356k/e357k/d399k

51、s354c/t366w,

52、y349c/t366s/l368a/y407v,

53、l234f/l235e/p331s/y349c/k370e/k409d/k439e，

54、l234f/l235e/p331s/s354c/d356k/e357k/d399k，

55、l234f/l235e/p331s/s354c/t366w，

56、l234f/l235e/p331s/y349c/t366s/l368a/y407v，

57、n297a/y349c/k370e/k409d/k439e，

58、n297a/s354c/d356k/e357k/d399k，

59、n297a/s354c/t366w，

60、n297a/y349c/t366s/l368a/y407v；和/或

61、s267e，s267e/g236d，s267e/s239d，s267e/l328f。

62、在另一优选例中，所述fc片段为来源于igg4的fc片段，其具有如seq id no:29所示的氨基酸序列。

63、在另一优选例中，所述来源于igg4的fc片段具有选自下组的突变：

64、y349c/k370e/r409d/k439e,

65、s354c/e356k/e357k/d399k,

66、s354c/t366w,

67、y349c/t366s/l368a/y407v；和/或

68、s228p/s267e,

69、s228p/s267e/g236d,

70、s228p/s267e/s239d,

71、s228p/s267e/l328f。

72、在另一优选例中，所述多特异性t细胞接合剂为双/三特异性t细胞结合剂。

73、在另一优选例中，所述多特异性t细胞接合剂为双特异性t细胞结合剂。

74、在另一优选例中，所述双特异性t细胞结合剂包含：

75、第一靶向结构域，所述第一靶向结构域包含一个或多个lrrc15抗原结合结构域；和第二靶向结构域，所述第二靶向结构域为cd3抗原结合结构域。

76、在另一优选例中，所述双特异性t细胞结合剂包含：

77、第一靶向结构域，所述第一靶向结构域包含一个或多个lrrc15抗原结合结构域；和第二靶向结构域，所述第二靶向结构域为cd40抗原结合结构域。

78、在另一优选例中，所述双特异性t细胞结合剂包含：

79、第一靶向结构域，所述第一靶向结构域包含一个或多个lrrc15抗原结合结构域；和第二靶向结构域，所述第二靶向结构域为cd137抗原结合结构域。

80、在另一优选例中，所述双特异性t细胞结合剂包含：

81、第一靶向结构域，所述第一靶向结构域包含一个或多个lrrc15抗原结合结构域；和第二靶向结构域，所述第二靶向结构域为一个或多个cd40l序列。

82、在另一优选例中，所述双特异性t细胞接合剂包含：

83、第一靶向结构域，所述第一靶向结构域包含一个或多个lrrc15抗原结合结构域；和第二靶向结构域，所述第二靶向结构域为一个或多个cd137l序列。

84、在另一优选例中，所述多特异性t细胞接合剂为三特异性t细胞结合剂。

85、在另一优选例中，所述三特异性t细胞接合剂包含：

86、第一靶向结构域，所述第一靶向结构域包含一个或多个lrrc15抗原结合结构域；

87、第二靶向结构域，所述第二靶向结构域为cd3抗原结合结构域；和

88、第三靶向结构域，所述第三靶向结构域为cd28抗原结合结构域。

89、在另一优选例中，所述多特异性t细胞接合剂为三特异性t细胞结合剂。

90、在另一优选例中，所述三特异性t细胞接合剂包含：

91、第一靶向结构域，所述第一靶向结构域包含一个或多个lrrc15抗原结合结构域；

92、第二靶向结构域，所述第二靶向结构域为cd3抗原结合结构域；和

93、第三靶向结构域，所述第三靶向结构域为cd40抗原结合结构域。

94、在另一优选例中，所述多特异性t细胞接合剂为三特异性t细胞结合剂。

95、在另一优选例中，所述三特异性t细胞接合剂包含：

96、第一靶向结构域，所述第一靶向结构域包含一个或多个lrrc15抗原结合结构域；

97、第二靶向结构域，所述第二靶向结构域为cd3抗原结合结构域；和

98、第三靶向结构域，所述第三靶向结构域为cd137抗原结合结构域。

99、在另一优选例中，所述多特异性t细胞接合剂为三特异性t细胞结合剂。

100、在另一优选例中，所述三特异性t细胞接合剂包含：

101、第一靶向结构域，所述第一靶向结构域包含一个或多个lrrc15抗原结合结构域；

102、第二靶向结构域，所述第二靶向结构域为cd3抗原结合结构域；和

103、第三靶向结构域，所述第三靶向结构域为cd40l序列。

104、在另一优选例中，所述三特异性t细胞接合剂包含：

105、第一靶向结构域，所述第一靶向结构域包含一个或多个lrrc15抗原结合结构域；

106、第二靶向结构域，所述第二靶向结构域为cd3抗原结合结构域；和

107、第三靶向结构域，所述第三靶向结构域为cd137l序列。

108、在另一优选例中，所述cd3抗原结合结构域包含与如seq id no:11、9、10、或12所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的重链可变区，和与如seq id no:13所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的轻链可变区。

109、在另一优选例中，所述cd3抗原结合结构域选自下组：scfv、fab、或其组合。

110、在另一优选例中，所述cd28抗原结合结构域包含与如seq id no:14所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的重链可变区，和与如seq id no:15所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的轻链可变区。

111、在另一优选例中，所述cd28抗原结合结构域选自下组：scfv、fab、或其组合。

112、在另一优选例中，所述cd40抗原结合结构域包含与如seq id no:16所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的重链可变区，和与如seq id no:17所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的轻链可变区。

113、在另一优选例中，所述cd40抗原结合结构域选自下组：scfv、fab、或其组合。

114、在另一优选例中，所述cd137抗原结合结构域包含与如seq id no:18或20所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的重链可变区，和与如seq id no:19或21所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的轻链可变区。

115、在另一优选例中，所述cd137抗原结合结构域选自下组：scfv、fab、或其组合。

116、在另一优选例中，所述cd40l序列为cd40l的rbd受体结合结构域序列，其具有如seq id no:23所示的氨基酸序列。

117、在另一优选例中，所述cd137l序列为cd40l的rbd受体结合结构域序列，其具有如seq id no:25所示的氨基酸序列。

118、本发明的第二方面，提供了一种抗lrrc15的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含如下三个重链可变区cdr：

119、hcdr1，其具有如seq id no:32、35、38、或41所示的氨基酸序列；

120、hcdr2，其具有如seq id no:33、36、39、或42所示的氨基酸序列；和

121、hcdr3，其具有如seq id no:34、37、40、或43所示的氨基酸序列；

122、以及，如下三个轻链可变区cdr：

123、lcdr1，其具有如seq id no:44或49所示的氨基酸序列；

124、lcdr2，其具有如seq id no:45、47、或50所示的氨基酸序列；和

125、lcdr3，其具有如seq id no:46、48、51、或52所示的氨基酸序列。

126、在另一优选例中,所述抗lrrc15的抗体或其抗原结合片段包含选自下组的三个重链可变区cdr(hcdr)，以及三个轻链可变区cdr(lcdr)：

127、

128、在另一优选例中，所述抗lrrc15的抗体或其抗原结合片段包含与如seq id no:1、2、3、或4所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的重链可变区，和与如seq id no:5、6、7、或8所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的轻链可变区。

129、在另一优选例中，所述抗lrrc15的抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:1所示的重链可变区，和如seq id no:5所示的轻链可变区。

130、在另一优选例中，所述抗lrrc15的抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:2所示的重链可变区，和如seq id no:6所示的轻链可变区。

131、在另一优选例中，所述抗lrrc15的抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:3所示的重链可变区，和如seq id no:7所示的轻链可变区。

132、在另一优选例中，所述抗lrrc15的抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:4所示的重链可变区，和如seq id no:8所示的轻链可变区。

133、在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段为人源、鼠源、人源化或嵌合抗体。

134、在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段为人源抗体。

135、本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如本发明第一方面所述的多特异性t细胞接合剂或如本发明第二方面所述的抗体。

136、本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包含如本发明第三方面所述的多核苷酸。

137、在另一优选例中，所述表达载体包括原核表达载体和真核表达载体。

138、本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如本发明第四方面所述的表达载体，或基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。

139、在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

140、在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、hek 293t细胞、cho细胞。

141、本发明的第六方面，提供了一种如本发明第一方面所述的多特异性t细胞接合剂的用途，用于制备用于治疗癌症/肿瘤的药物。

142、在另一优选例中，所述癌症/肿瘤为lrrc15高表达的癌症/肿瘤。

143、在另一优选例中，所述癌症/肿瘤包括实体瘤和血液肿瘤。

144、在另一优选例中，所述癌症/肿瘤为实体瘤。

145、在另一优选例中，所述癌症/肿瘤选自下组：乳腺癌、头颈部肿瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、恶性胶质瘤、肉瘤、骨癌、或其组合。

146、本发明的第七方面，提供了一种免疫偶联物，所述偶联物包含：

147、(i)如本发明第一方面所述的多特异性t细胞接合剂、或如本发明第二方面所述的抗体或其抗原结合片段；和

148、(ii)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

149、在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

150、本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：(a)如本发明第一方面所述的多特异性t细胞接合剂、或如本发明第二方面所述的抗体或其抗原结合片段；和(b)药学上可接受的载体。

151、在另一优选例中，所述药物组合物为注射剂型。

152、本发明的第九方面，提供了一种治疗癌症/肿瘤的方法，包括向有需要的受试者施用本发明第一方面所述的多特异性t细胞接合剂。

153、在另一优选例中，所述有需要的受试者为人类或非人类哺乳动物。

154、在另一优选例中，所述癌症/肿瘤为lrrc15高表达的癌症/肿瘤。

155、在另一优选例中，所述癌症/肿瘤包括实体瘤和血液肿瘤。

156、在另一优选例中，所述癌症/肿瘤为实体瘤。

157、在另一优选例中，所述癌症/肿瘤选自下组：乳腺癌、头颈部肿瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、恶性胶质瘤、肉瘤、骨癌、或其组合。

158、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。