一株贝莱斯芽孢杆菌D-1及其制剂和应用

一株贝莱斯芽孢杆菌d-1及其制剂和应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术应用领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌d-1及其制剂和应用。


背景技术：

2.芋头(colocasia esculenta l.)为天南星科芋的地下球茎，富含淀粉、蛋白质及非淀粉性多糖等多种营养物质和功能成分，是芋主要食用器官。干腐病是薯芋类作物贮藏期发生的一种的重要真菌性病害，主要由致病镰刀菌(fusarium spp.)引起，在马铃薯和甘薯等作物的主种植产区可造成严重经济损失。由镰刀菌引起的芋头干腐病是芋头贮藏期间一种重要的真菌病害，受到侵染的健康芋头在贮藏过程中表现出褐变、腐烂等症状，严重影响芋头的贮藏、加工和销售，是制约当地芋头产业发展的重大因素。
3.对于植物病害的防治，传统的防治方法有抗病育种、农业防治、物理防治和化学药剂防治等。轮作等农业防治措施可有效防治植物病害，但对一些顽固性的土传病害而言，要求较长时期的轮作，且有时实施起来难度较大，杂交筛选优良抗病品种则面临培育周期较长，成本高的问题，而化学农药又对人们的身心健康、环境保护和食品安全造成重要威胁。利用有益微生物抑制土壤中病原菌的生物防治被认为是一种安全、环保、经济且长效的防治措施，是当今微生物生态防控的热点。


技术实现要素：

4.近年来，发明人开展了江西芋头干腐病的病原鉴定、病原菌生物特性研究及品种抗性筛选，明确了芋头干腐病主要由3种镰刀菌(fusarium spp.)引起，分别是尖孢镰刀菌(f.oxy sporum)、层出镰刀菌(f.proliferatum)和茄镰刀菌(f.solani)，其中茄镰刀菌(f.solani)为优势病原菌，基本摸清了芋头干腐病的发病规律。
5.为进一步加强对芋头干腐病的绿色防控，发明人对该病害进行生物防治研究，并从中国福建省南平市武夷山茶苗合作基地的健康茶树根际土壤中分离筛选到一株生防贝莱斯芽孢杆菌菌株d-1，所述贝莱斯芽孢杆菌d-1名称为bacillus velezensis d-1，已于2021年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.23579。其16s rdna序列如seq id no：1所示，其gyra序列如seq id no：2所示，其rpob序列如seq id no：3所示。
6.发明人发现该菌株对引起芋头干腐病的3种镰刀菌均有显著的防治效果，还对茶双毛壳孢叶斑病菌、猕猴桃黑斑病菌、猕猴桃棒孢叶斑病菌、猕猴桃果腐病菌、猕猴桃溃疡病菌、辣椒细菌性斑点病菌、水稻白叶枯病菌和柑橘溃疡病菌等多种植物病原真菌和病原细菌有较好的抑制作用，表现为广谱的抑菌活性。
7.所述贝莱斯芽孢杆菌d-1的菌落为乳白色、不透明、圆形、表面干燥、边缘不整齐、有褶皱、菌落中间凹陷；菌体呈杆状，1.5～4.0μm
×
0.4～0.6μm，单个或成对排列，革兰氏染色呈阳性，可产生芽孢。
8.同时，通过生理生化测试，明确所述贝莱斯芽孢杆菌是一株革兰氏阳性细菌，能在7％nacl和ph 5.7的环境中正常生长；v-p试验、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验和柠檬酸盐利用试验呈阳性；甲基红反应、吲哚试验、h2s产气试验、动力学试验和丙酸盐利用试验呈阴性；不能产生鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶和苯丙氨酸脱氨酶，可产生尿素酶；可水解七叶苷，不可水解水杨苷；能够利用d-木糖、l-阿拉伯糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、d-甘露醇、山梨醇、肌醇和核糖醇；不能利用纤维二糖、麦芽糖、菊糖和乳糖。
9.发明人基于此还提供了一种微生物制剂，其组分包括上述贝莱斯芽孢杆菌d-1的菌液。其制备方法包括以下步骤：将所述贝莱斯芽孢杆菌d-1接至na液体培养基中，28℃、180rpm条件下培养12h，得到od
600
为2.0的所述微生物制剂；所述na液体培养基的组分包括：蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
10.本发明的有益效果为：本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌d-1，对引起芋头干腐病的三种镰刀菌均具有显著的拮抗作用，而且对其他重要的植物病原真菌和病原细菌也具有拮抗活性，为现今农业生产上的多种植物病害的生物防治提供了新资源。
附图说明
11.图1所示为贝莱斯芽孢杆菌d-1在na上的菌落形态及染色图；其中，a为na培养基上的菌落形态；b为革兰氏染色后的染色图；c为芽孢染色后的染色图；
12.图2所示为贝莱斯芽孢杆菌d-1基于16s rrna基因构建的系统发育树；
13.图3所示为贝莱斯芽孢杆菌d-1基于gyr a基因构建的系统发育树；
14.图4所示为贝莱斯芽孢杆菌d-1基于rpo b基因构建的系统发育树；
15.图5所示为贝莱斯芽孢杆菌d-1的16s rdna、gyra和rpob基因的凝胶电泳结果；其中1代表marker；2代表16s rrna基因的产物；3代表gyra基因的产物；4代表rpob基因的产物；
16.图6所示为贝莱斯芽孢杆菌d-1对3种芋头干腐病菌的拮抗效果图；其中，a为对茄镰刀菌的拮抗效果图；b为对层出镰刀菌的拮抗效果图；c为对尖孢镰刀菌的拮抗效果图；其中，在每张照片中，左皿为处理组，右皿为对照组；
17.图7所示为贝莱斯芽孢杆菌d-1对其他7种植物病原真菌的拮抗效果图，其中，a为对猕猴桃白纹羽病菌的拮抗效果图；b为对茶双毛壳孢叶斑病菌的拮抗效果图；c为对猕猴桃黑斑病菌的拮抗效果图；d为对猕猴桃棒孢叶斑病菌的拮抗效果图；e为对茶炭疽病病菌的拮抗效果图；f为对茶轮斑病病菌的拮抗效果图；g为对猕猴桃果实熟腐病菌的拮抗效果图；其中，在每张照片中，左皿为处理组，右皿为对照组；
18.图8所示为贝莱斯芽孢杆菌d-1对其他5种植物病原细菌的拮抗效果图，其中，a为对猕猴桃溃疡病菌的拮抗效果图；b为对辣椒青枯病菌的拮抗效果图；c为对辣椒细菌性斑点病菌的拮抗效果图；d为对水稻白叶枯病菌的拮抗效果图；e为对柑橘溃疡病菌的拮抗效果图；其中，在每张照片中，左皿为处理组，右皿为对照组。
具体实施方式
19.以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，
按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
20.其中，以下实施例中所用的培养基如下：
21.牛肉膏蛋白胨培养基(na)：蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml；牛肉膏蛋白胨培养液(nb)：蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏5g，蒸馏水1000ml；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)：马铃薯200g，琼脂20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。
22.以上培养基ph 7.0～7.2，121℃灭菌20min。
23.实施例1：
24.(1)土壤中芽孢杆菌的分离
25.采用稀释涂布法对供试土样(中国福建省南平市武夷山茶苗合作基地的健康茶树根际土壤)中的芽孢杆菌进行分离。取灭菌风干后的供试土壤10.0g放入含90ml无菌水的三角瓶中,混合均匀后将稀释液在85℃的水浴锅中水浴30min。用无菌水稀释成10-3
、10-4
、10-5
、10-6
等不同浓度的菌液，吸取100μl菌液均匀涂布于na平板，置于30℃恒温培养箱中黑暗培养24h，挑取菌落形态差异明显的单菌落转接纯化，纯化后的菌株保存于4℃冰箱备用。
26.(2)拮抗菌株的筛选及对靶标菌的抑菌形态观察
27.采用平板对峙法，以芋头干腐病的优势病原菌茄镰刀菌作为指示菌进行拮抗菌筛选。实验前将纯化得到的芽孢杆菌分别接种于na液体培养基中，28℃、180rpm摇床中培养12h，得到od
600
为2.0的生防菌液。用直径为5mm的无菌打孔器打取病原菌边缘并接种到pda培养中央，在距平板中央3cm处点接1μl生防菌液，以点接1μl无菌水作为对照，每处理重复3次。接种后置于30℃恒温培养箱中培养6d。选取有明显抑菌作用的菌株进行复筛，方法同上。用十字交叉法测量对照菌落直径和处理菌落直径，计算抑菌率，筛选到本技术的贝莱斯芽孢杆菌d-1。进行后续研究，在对峙平板上的抑菌边界处挑取菌丝，置于光学显微镜下观察，其菌落图和染色图如图1所示(标尺为10μm)，贝莱斯芽孢杆菌d-1的菌落为乳白色、不透明、圆形、表面干燥、边缘不整齐、有褶皱、菌落中间凹陷；菌体呈杆状，1.5～4.0μm
×
0.4～0.6μm，单个或成对排列，革兰氏染色呈阳性，可产生芽孢。
28.(3)菌株d-1的16s rdna基因序列测定
29.挑取纯化后的d-1单菌落至nb液体培养基，放入摇床中28℃、180r/min培养24h。依照生工生物工程(上海)有限公司的ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取d-1菌株的dna，并用超微量核酸蛋白测定仪测定总dna的浓度和纯度。采用细菌通用性引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’)/1492r(5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’)扩增16s rrna基因序列，以提取的dna为模板，进行pcr扩增，以获得目的片段。pcr反应体系：ddh2o 8.5μl、2
×
taq pcr master mix 12.5μl、正反向引物各1μl和模板dna2μl。pcr反应基本条件：95℃4min,94℃1min，50℃1min，72℃2min，共34个循环，72℃10min。反应结束后，pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验，利用凝胶成像仪检测并记录结果(如图5所示)，委托生工生物工程(上海)有限公司进行序列测定。测序结果运用dna star进行分析，测序结果运用dna star进行分析，并在ncbi网站上进行bl ast比对，确定近缘株细菌的种属。结果显示与d-1菌株相似性最高的是bacillus velezensis，同源性为100％。使用mega7.0构建基于16srrna基因的系统发育树，结果如图2所示。其16s rdna序列长度为1420bp，具体如seq id no.1所示：
30.gtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaac
ctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaa。
31.(4)菌株d-1的gyra基因序列测定
32.提取菌株d-1的基因组dna，利用引物42f(5
’‑
cagtcaggaaatgcgtacgtcctt-3’)/1066r(5
’‑
caaggtaatgctccaggcattgct-3’)，以提取的dna为模板，进行pcr扩增，以获得目的片段。pcr反应体系：ddh2o 8.5μl、2
×
taq pcr master mix 12.5μl、正反向引物各1μl和模板dna 2μl。pcr反应条件：94℃2min,94℃1min,51℃45s,68℃1min,40个循环，68℃10min。反应结束后，pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验，利用凝胶成像仪检测并记录结果(如图5所示)，委托生工生物工程(上海)有限公司进行序列测定。测序结果运用dna star进行分析，并在ncbi网站上进行blast比对，确定近缘株细菌的种属。结果显示与d-1菌株相似性最高的是bacillus velezensis，同源性均100％。使用mega7.0构建基于gyra基因的系统发育树，结果如图3所示。其gyra序列长度为1010bp，具体如seq id no.2所示：
33.gcgcttccggatgtgcgtgacggtctgaagccggttcacaggcggattttgtacgcaatgaatgatttaggcatgaccagtgacaaaccatataaaaaatctgcccgtatcgtcggtgaagttatcggtaagtaccacccgcacggtgactcagcggtttacgaatcaatggtcagaatggcgcaggattttaactaccgctacatgcttgttgacggacacggcaacttcggttcggttgacggcgactcagcggccgcgatgcgttacacagaagcgagaatgtcaaaaatcgcaatggaaatcctccgggacattacgaaagatacgattgattatcaagataactatgacggcgcagaaagagaacctgtcgtcatgccttcgagatttccgaatctgctcgtaaacggagctgccggtattgcggtcggaatggcgacaaatattcctccgcatcagcttggggaagtcattgaaggcgtgcttgccgtaagtgagaatcctgagattacaaaccaggagctgatggaatacatcccgggcccggattttccgactgcaggtcagattttgggccggagcggcatccgcaaggcatatgaatccggacggggatccattacgatccgggctaaggctgaaatcgaagagacatcatcgggaaaagaaagaattattgtcacagaacttccttatcaggtgaacaaagcgagattaattgaaaaaatcgcagatcttgtccgggacaaaaaaatcgaaggaattaccgatctgcgtgacgaatccgaccgtaacggaatgagaatcgtcattgagatccgccgt
gacgccaatgctcacgtcattttgaataacctgtacaaacaaacggccctgcagacgtctttcggaatcaacctg。
34.(5)菌株d-1的rpob基因序列测定
35.提取菌株d-1的基因组dna，利用引物2292f(5
’‑
aggtcaactagttcagtatggac-3’)/3354r(5
’‑
aagaaccgtaaccggcaactt-3’)，以提取的dna为模板，进行pcr扩增，以获得目的片段。pcr反应体系：ddh2o 8.5μl、2
×
taq pcr master mix 12.5μl、正反向引物各1μl和模板dna 2μl。pcr反应条件：94℃2min,94℃1min,51℃45s,68℃50s,40个循环,68℃90s。反应结束后，pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验，利用凝胶成像仪检测并记录结果(如图5所示)，委托生工生物工程(上海)有限公司进行序列测定。测序结果运用dna star进行分析，并在ncbi网站上进行blast比对，确定近缘株细菌的种属。结果发现与d-1菌株相似性最高的是bacillus velezensis，同源性为100％。使用meg a7.0构建基于rpob基因的系统发育树，结果如图4所示。其rpob序列长度为580bp，具体如seq id no.3所示：
36.gctcgcattagcgaagtgttagaattaccaaatctcattgaaattcaaacctcttcttatcagtggtttcttgatgagggtcttagagagatgtttcaagacatatcaccaattgaggatttcactggtaacctctctctagagttcattgactacagtttaggagatcctaagtatcccgttgaagagtcaaaagaacgtgatgtgacttactcagctccgctgagagtgaaggttcgtttaattaacaaagaaactggagaggtaaaagatcaggatgtcttcatgggtgatttccctattatgacagataccggtacttttatcatcaacggtgcagaacgtgttatcgtatctcagcttgttcggtctccaagtgtatatttcagtggtaaagtagacaaaaacggtaaaaaaggttttaccgcgactgtcattccaaaccgtggcgcatggttagaatacgaaactgatgcgaaagatgttgtgtatgtccgcattgatcgcacacgtaagttgccg。
37.(6)菌株d-1的生理生化试验鉴定
38.贝莱斯芽孢杆菌d-1的生理生化特征为：为革兰氏阳性细菌，能在7％nacl和ph 5.7的环境中正常生长；v-p试验、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验和柠檬酸盐利用试验呈阳性；甲基红反应、吲哚试验、h2s产气试验、动力学试验和丙酸盐利用试验呈阴性；不能产生鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶和苯丙氨酸脱氨酶，可产生尿素酶；可水解七叶苷，不可水解水杨苷；能够利用d-木糖、l-阿拉伯糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、d-甘露醇、山梨醇、肌醇和核糖醇；不能利用纤维二糖、麦芽糖、菊糖和乳糖。具体信息见表1。
39.表1菌株d-1生理生化特征
40.[0041][0042]
注：“+”表示阳性反应，“－”表示阴性反应。
[0043]
实施例2：
[0044]
(1)菌株d-1对3种芋头干腐病菌的拮抗活性测定
[0045]
采用平板对峙法，实验前将纯化得到的芽孢杆菌d-1分别接种于na液体培养基中，28℃、180rpm摇床中培养12h，得到od
600
为2.0的生防菌液。用直径为5mm的无菌打孔器打取病原菌边缘并接种到pda平板中央，在距平板中央3cm处点接1μl生防菌液，以点接1μl无菌水作为对照，每处理重复3次。接种后置于30℃恒温培养箱中培养6d。用十字交叉法测量对照菌落直径和处理菌落直径，计算抑菌率其结果如表2和图6所示。
[0046]
表2菌株d-1对3种芋头干腐病菌的抑菌效果
[0047][0048]
(2)菌株d-1对7种植物病原真菌的拮抗活性测定
[0049]
采用平板对峙法，实验前将纯化得到的芽孢杆菌d-1分别接种于na液体培养基中，28℃、180rpm摇床中培养12h，得到od
600
为2.0的生防菌液。用直径为5mm的无菌打孔器打取病原菌边缘并接种到pda培养中央，在距平板中央3cm处点接1μl生防菌液，以点接1μl无菌水作为对照，每处理重复3次。接种后置于30℃恒温培养箱中培养6d。用十字交叉法测量对照菌落直径和处理菌落直径，计算抑菌率，其结果如图7和表3所示。
[0050]
结果显示，菌株d-1对猕猴桃白纹羽病病菌具有显著的抑制效果，抑菌率为77.07％；其对对茶双毛壳孢叶斑病菌、猕猴桃黑斑病菌、猕猴桃棒孢叶斑病菌、茶褐枯病病菌、茶轮斑病病菌和猕猴桃果实腐烂病菌等6种病原真菌也有良好抑制作用，抑菌率分别为75.89％、75.83％、75.78％、67.97％、64.33％和60.80％。
[0051]
表3菌株d-1对7种植物病原真菌的抑菌效果
[0052][0053]
(3)菌株d-1对5种植物病原细菌的拮抗活性测定
[0054]
采用牛津杯法，将纯化后的5种植物病原细菌和生防芽孢杆菌d-1分别接种于na液体培养基中，28℃、180rpm培养24h，得到od
600
为2.0的生防菌液和病原菌液。分别吸取200μl对应病原菌液与na固体培养基充分混匀后倒板，在na平板中心放上直径为5mm的牛津杯，每个牛津杯内接70μl生防菌液，每处理3个重复，28℃培养24h后观察有无抑菌圈产生，测量并记录抑菌圈直径，其结果如表4和图8所示。
[0055]
结果显示，菌株d-1对猕猴桃溃疡病拮抗效果最好，抑菌圈直径高达33.75mm，其次为辣椒细菌性斑点病菌(29.25mm)、水稻白叶枯病菌(17.18mm)和柑橘溃疡病菌(15.05mm)和辣椒青枯病(14.00mm)。
[0056]
表4菌株d-1对5种植物病原细菌的抑菌效果
[0057][0058]
注：表中数据为抑菌圈直径
±
标准差，大小写字母分别代表p《0.05差异显著水平。
[0059]
由此，利用本发明提供的一株贝莱斯芽孢杆菌d-1，不仅对引起芋头干腐病的3种镰刀菌具有显著的拮抗作用，而且对多种植物病原细菌和真菌也具有拮抗作用，具有广谱的抑菌效果，为植物病害的生物防治提供了新资源。
[0060]
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。