一种单克隆抗体及其应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及cd24单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.人白细胞分化抗原cd24(clusterofdifferentiation24)是一种近年来受到重点研究的肿瘤标志物。当前研究表明，cd24分子是表观分子量介于30～70kda之间的高度糖基化唾液酸糖蛋白。cd24包含33个氨基酸残基组成的核心蛋白骨架结构，具有16个潜在的o-或n-糖基化位点，与小鼠热稳定抗原高度同源；其成熟多肽能够通过羧基端的磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl-inositol，gpi)锚定在细胞膜的表面。
3.在生理情况下，cd24分子仅在未成熟b细胞、成熟粒细胞以及少数上皮细胞和神经细胞上低水平表达；而当机体处于病理状态时，多数恶性肿瘤细胞的表面均能检测到显著高水平表达的cd24分子，其表达水平的高低与肿瘤的发生和发展密切相关。
4.p选择素表达于活化的血小板与内皮细胞表面，cd24是其配体之一。cd24分子高表达增强了肿瘤细胞对血小板及内皮细胞的粘附作用，促进了肿瘤的复发与转移。当然，作为细胞膜表面信号转导分子，cd24能够通过多种作用机制介导肿瘤细胞的的增殖、粘附、转移和侵袭。研究进一步发现，肿瘤细胞表达的cd24分子能够与巨噬细胞表面的抑制型受体siglec10结合，抑制巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用。由此可见，cd24有望成为研究肿瘤发生机制及开发相关诊断试剂的新靶标。
5.抗体药物偶联物(adc)是借助抗体的靶向性将药物递送至肿瘤区域，能够显著降低药物的脱靶效应，提高治疗窗。目前市售的adc药物采用常规非特异偶联方法，经随机表面赖氨酸或还原的四个链间二硫化物的游离半胱氨酸。这产生高度异质性adc混合物，不仅带来对生产重复性的挑战，还显著降低治疗指数。junutula等(nat biotechnol 2008)通过在抗体恒定区引入工程化半胱氨酸，将药物分子特异性偶联在突变位点上，获得了均一的抗体药物偶联物，也为后续均质adc的开发提供的新的思路。


技术实现要素：

6.基于以上背景，本发明提供了一种cd24单克隆抗体，其重链、轻链可变区氨基酸序列及其cdr区如seq id no.1～8所示。其恒定区为人igg1型，降低了免疫原性且更易于表达。
7.本发明还提供了一种带有工程化半胱氨酸的cd24嵌合抗体序列，可用于制备均一的抗体偶联物，其工程化位点为重链按照eu编号239位氨基酸为半胱氨酸、轻链按照eu编号211位为半胱氨酸。具体氨基酸序列如seq id no.9～10所示。
8.本发明的单克隆抗体可与cd24特异性结合，可以用于制备治疗与cd24表达异常或过量、失控相关疾病的药物；或用于制备western blot、elisa、流式细胞术检测cd24表达的产品中的应用。
9.有益效果
10.1、本发明提供一种全新cd24嵌合抗体，该抗体未见文献报道，本发明的单克隆抗体可与cd24特异性结合，可以用于制备治疗与cd24表达异常或过量、失控相关疾病的药物；或用于制备western blot、elisa、流式细胞术检测cd24表达的产品中的应用。
11.2、本发明的单克隆抗体的恒定区为人igg1型，相比于鼠源单抗降低了对人体的免疫原性，且有利于在真核细胞中大量表达。并且，本发明利用半胱氨酸偶联的思路，通过overlap-pcr的方法，在cd24抗体分子上引入工程化半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基能够与带有马来酰亚胺基团的药物发生迈克尔加成反应，可用于制备均一的cd24抗体-药物定点偶联物。
附图说明
12.图1为cd24单克隆抗体的sds-page和western blot结果。a：cd24单克隆抗体非还原电泳；b：还原电泳；c：western blot结果，lane1非还原电泳，lane2还原电泳；m：marker，下同。
13.图2为在cd24单克隆抗体重链上引入工程化半胱氨酸的琼脂糖电泳图，其中a为重链突变位点前、后段pcr产物；b为overlap-pcr产物。
14.图3为在cd24单克隆抗体轻链上引入工程化半胱氨酸的琼脂糖电泳图，其中a为轻链突变位点前段pcr产物；b为轻链突变位点后段pcr产物；c为overlap-pcr产物。
15.图4为elisa检测cd24单克隆抗体与重组人cd24抗原的结合。
16.图5为western blot检测cd24单克隆抗体与肿瘤cd24抗原的结合。a：lane 1为bel-7402细胞裂解物；b：lane 1为mda-mb-468细胞裂解物；c：lane 1为hct-116细胞裂解物。
17.图6为流式细胞术检测cd24单克隆抗体与肿瘤细胞的结合，其中a为bel-7402，b为ht-29，c为hepg2，d为mda-mb-468。
具体实施方式
18.实例1cd24单克隆抗体的制备
19.1.杂交瘤细胞的制备
20.1)用pbs溶解重组蛋白gst-hcd24至终浓度为1mg/ml后，与快速佐剂等体积混合，六周龄balb/c小鼠。免疫流程参照quickantibody说明书进行。
21.2)于融合前一天取icr小鼠(spf级，购自扬州大学比较医学院)腹腔巨噬细胞，重悬于hat培养液(购自gibco公司，含有黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷)。接种于96孔板，置37℃，5％co2培养箱中培养24h。
22.小鼠骨髓瘤细胞株sp20-ag14用普通的dmem完全培养基(含15％fbs，购自gibco公司)分瓶培养骨髓瘤细胞，以使细胞能生长良好。每一个融合准备250ml生长密度为2
×
l06cells/m1处于对数生长中期的健康细胞。
23.处死免疫的小鼠，用酒精浸润后取出脾脏。把脾脏置于细胞筛网上，并用无菌手术剪将脾脏剪成碎片。注射器内芯挤压研磨脾脏后，用5ml dmem不完全培养基冲洗，使细胞通过过筛网进入50ml离心管中。收集脾脏细胞悬液，用于融合。
24.3)融合
25.a.准备20ml无血清的dmem培养基和1ml peg1450(购自sigma公司)放于37℃保温。
26.b.收集骨髓瘤细胞及脾脏细胞，常温下1500rpm离心5min，用无血清培养基洗两次，然后将其悬浮于10ml无血清培养基中。将5
×
108脾细胞和1
×
108骨髓瘤细胞充分混合，1500rpm离心5min，弃上清。轻轻敲击管子底部使细胞松散。
27.c.取出在37℃预热的培养基和peg，把细胞置于37℃水浴中，1min内匀速缓慢逐滴加1ml peg，加完后及时用无血清的培养基终止。离心弃上清并用50ml hat培养液重悬细胞，轻轻混匀。
28.d.将细胞加入5块已铺有滋养细胞的96孔板中，每孔100μl。置37℃，5％co2培养箱中培养4天。根据细胞生长状态，在筛选前用hat培养液半换液1～3次，避免孔内培养基变黄。
29.e.融合后7天后，改用含有ht培养液全换液。24h后，吸取细胞培养上清，间接elisa检测筛选阳性克隆。
30.2.抗体重轻链可变区基因的克隆
31.1)收集107个对数期杂交瘤细胞，用rna提取试剂盒提取总rna，溶于20～50μl无rna酶水，-70℃保存。以总rna为模板反转录合成cdna第一链，反应按产品说明书进行。
32.2)聚合酶为primerstar高保真聚合酶。根据抗体可变区fr1、ch1基因，设计合成上游及下游简并引物，其中轻链vlf(上游引物)和vlb(下游引物)以及重链vhf1、vhf2和vhb引物序列为：
33.vlf：gg gag ctc gay att gtg mts acm car wct mca；
34.vlb：ggt gca tgc gga tac agt tgg tgc agc atc；
35.vhf1:ctt ccg gaa ttc sar gtn mag ctg sag tc
36.vhf2:ctt ccg gaa ttc sar gtn mag ctg sag tcw gg
37.vhb:gga aga tct ata gac aga tgg ggg tgt cgt ttt ggc
38.(简并密码子说明：r＝a,g；y＝c,t；m＝a,c；s＝c,g；w＝a,t)
39.反应体积为50μl，反应条件为：94℃5min；94℃30s，58℃1min，72℃1min，循环30次；72℃10min。
40.3.cd24全长抗体的构建
41.1)通过overlap-pcr将抗体轻链可变区和人igκ链恒定区进行拼接，将抗体重链可变区和人igg1恒定区进行拼接，得到cd24单克隆抗体cg7。
42.2)将编码cd24单克隆抗体cg7的轻、重链的重组质粒按2:1的比例转染hek293细胞，培养5天后4℃离心收集上清，经protein a柱纯化后得到cd24单克隆抗体，通过sds-page检测其分子量和纯度，并使用羊抗人igg抗体(武汉三鹰)检测cd24抗体类型。结果如图1所示。a：cd24单克隆抗体非还原电泳；b：还原电泳；c：western blot检测抗体类型，lane1非还原电泳，lane2还原电泳；m：marker，下同。
43.实例2cd24单克隆抗体的制备和工程化半胱氨酸的改造：
44.通过overlap-pcr将亲本cd24单克隆抗体cg7重链239位(eu编号)丝氨酸(tca)突变为半胱氨酸(tgc)，泳结果如图1所示。a：lane 1是重链突变位点前段pcr产物(805bp)，lane 2是重链突变位点后段pcr产物(656bp)；b:lane 1是重链overlap-pcr产物(1421bp)。
45.将轻链211位(eu编号)的缬氨酸(gtc)突变为半胱氨酸(tgc)。得到带有工程化半
胱氨酸的cd24单克隆抗体cg7sv。突变位点上下游pcr产物及overlap-pcr产物电泳结果如图2所示。a：lane 1是轻链突变位点前段pcr产物(728bp)；b：lane 1是轻链突变位点后段pcr产物(65bp)；c:lane 1是轻链overlap-pcr产物(763bp)。
46.实例3elisa检测cd24单克隆抗体与重组人cd24蛋白的结合：
47.抗体和抗原的结合能力可用elisa来初步判断。这里我们将重组人cd24蛋白固定在酶条上，加入一系列浓度梯度的cd24抗体进行检测。
48.1.首先通过紫外照射30分钟活化酶条；
49.2.每孔加入100μl，浓度为0.5ug/ml的重组人cd24蛋白，bsa作为阴性对照，4℃过夜包被；
50.3.加200μl的pbst洗3次，每次5min，加200μl 5％脱脂牛奶，37℃封闭2h；
51.4.弃去脱脂牛奶，加200μl pbs洗3次，每次5min，加入0.08～2.5nm的cd24单克隆抗体作为一抗，同时设置同型对照，37℃孵育2h；
52.5.吸弃一抗，加200μl pbst洗5次，每次5min，加100μl羊抗人igg(武汉三鹰，1:20000稀释)，37℃孵育1h；
53.6.吸弃二抗，pbst洗5次，加100μl tmb显色液，室温避光孵育15～20min；
54.7.加50μl 2m的稀硫酸终止反应，酶标仪测定od450和od630的数值。
55.实验重复3次，结果如图4所示，cg7的ec50值为0.1524nm，cg7sv的ec50值为0.1530nm。说明本发明的cd24单克隆抗体具有特异性结合cd24蛋白的能力，并可应用于elisa实验。
56.实例4western blot检测cd24单克隆抗体与肿瘤cd24抗原的结合：
57.1.肿瘤细胞裂解物经10％sds-page分离后，转移至pvdf膜上，用5％的脱脂奶粉37℃孵育2h进行封闭；
58.2.用tbst漂洗5min，加入终浓度1μg/ml的cd24单克隆抗体(5％脱脂奶粉稀释)作为一抗，37℃孵育2h；
59.3.弃去一抗，用tbst漂洗3次，每次10min，加入hrp标记的羊抗人igg抗体(生工生物，1:50000稀释)作为二抗，37℃孵育1h；
60.4.将ecl化学发光显色液(翌圣生物，a、b液按1:1混合)均匀滴加在pvdf膜表面，置于曝光仪中曝光。结果如图5所示，a：lane 1为bel-7402细胞裂解物，m为marker(下同)；b：lane 1为mda-mb-468细胞裂解物；c：lane 1为hct-116细胞裂解物。cd24阳性细胞(bel7402、mda-mb-468)裂解物在相应位置出现条带，而阴性细胞株(hct-116)则没有出现条带，说明本发明的cd24单克隆抗体具有特异性结合肿瘤cd24蛋白的能力，并可以应用于western blot检测。
61.实例5流式细胞术检测cd24单克隆抗体与肿瘤细胞的结合：
62.1.高表达cd24的人肿瘤细胞株ht-29、bel-7402、hepg2用含10％fbs的1640培养基，37℃，5％co2条件下培养；mda-mb-468细胞株用含10％fbs的l-15培养基，37℃，100％空气条件下培养。
63.2.将生长状态良好的肿瘤细胞用胰酶消化，加入新鲜培养基重悬后计数，每管取2*105个细胞，4℃、1500rpm离心3min，弃上清。加入500ul含有2％fbs的预冷pbs洗涤两次。
64.3.加入250μl浓度为100nm的cd24单克隆抗体作为一抗，重悬细胞，加入100nm无关
抗体作为同型对照，4℃孵育1h，使抗体和细胞结合；
65.4.4℃、1500rpm离心3min，弃上清。加入500ul含有2％fbs的预冷pbs洗涤两次。
66.5.加入250μl fitc标记的羊抗人igg抗体(武汉三鹰，1:100稀释)作为二抗，重悬细胞，4℃孵育1h；
67.6.4℃、1500rpm离心3min，弃上清。加入500ul含有2％fbs的预冷pbs洗涤两次。加入300μl pbs重悬，使用流式细胞仪进行检测。结果如图6所示，本发明的cd24单克隆抗体能够有效的和cd24高表达的肿瘤细胞结合，具有良好的肿瘤细胞靶向能力。