一种生产CBGA前体的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用与流程

laere，a.r.d.voet，p.van dijck，f.r.delvaux，j.m.thevelein，the saccharomyces cerevisiae eht1 and eeb1 genes encode novel enzymes with medium-chain fatty acid ethyl ester synthesis and hydrolysis capacity，journal of biological chemistry，281(2006)4446-4456；j.gajewski，r.pavlovic，m.fischer，e.boles，m.grininger，engineering fungal de novo fatty acid synthesis for short chain fatty acid production，nat commun，8(2017)14650-14650.]。将酵母体内这三个硫酯水解酶敲除后，能否抑制己酰辅酶a的水解，从而促进产物更高效地往oa方向转移？这些问题至今没有被研究报道。


技术实现要素：

6.基于此，本发明的目的之一在于提供一种用于生产cbga前体的酰基激活酶。
7.具体技术方案如下：
8.一种用于生产cbga前体的酰基激活酶，其包括at4g05160，ataae1，ataae12或csaae3。
9.所述酰基激活酶表达基因at4g05160，ataae1，ataae12，csaae3及csaae1序列利用gene optimizer选择酵母偏好性密码子进行优化。分别将没有去除信号肽的基因或蛋白序列定位为全长(full length，fl)，去除信号肽的基因或蛋白序列定义为截短多肽(truncated peptide，tp)。
10.所述at4g05160的基因序列如seq id no.6所示，或为与seq id no.6完全互补配对的序列，或为如seq id no.6所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或与seq id no.6所示至少有相似度为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列；或，所述at4g05160的基因序列如seq id no.10所示，或为与seq id no.10完全互补配对的序列，或为如seq id no.10所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或与seq id no.10所示至少有相似度为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列；
11.所述ataae1的基因序列如seq id no.7所示，或为与seq id no.7完全互补配对的序列，或为如seq id no.7所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或与seq id no.7所示至少有相似度为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列；或，所述ataae1的基因序列如seq id no.11所示，或为与seq id no.11完全互补配对的序列，或为如seq id no.11所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或与seq id no.11所示至少有相似度为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列；
12.所述ataae12的基因序列如seq id no.8所示，或为与seq id no.8完全互补配对的序列，或为如seq id no.8所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或与seq id no.8所示至少有相似度为80％以上、
85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列；或，所述ataae12的基因序列如seq id no.12所示，或为与seq id no.12完全互补配对的序列，或为如seq id no.12所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或与seq id no.12所示至少有相似度为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列；
13.所述csaae3的基因序列如seq id no.9所示，或为与seq id no.9完全互补配对的序列，或为如seq id no.9所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或与seq id no.9所示至少有相似度为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列；或，所述csaae3的基因序列如seq id no.13所示，或为与seq id no.13完全互补配对的序列，或为如seq id no.13所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或与seq id no.13所示至少有相似度为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列。
14.本发明的目的之一还在于提供一种生产cbga前体的酿酒酵母工程菌的构建方法。
15.实现上述目的的技术方案如下：
16.一种生产cbga前体的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤：
17.(1)构建能够同时表达四酮合酶、橄榄酸环化酶和上述酰基激活酶的重组表达载体2；
18.(2)制备硫酯水解酶基因被敲除酿酒酵母感受态细胞1；
19.(3)将步骤1得到的重组表达载体2转化至酿酒酵母感受态细胞1；获得生产cbga前体的酿酒酵母工程菌。
20.在其中一些实施例中，上述硫酯水解酶基因敲除包括以下步骤：
21.(3.1)构建靶向敲除硫酯水解酶的引导rna表达载体；
22.(3.2)将步骤3.1得到的引导rna表达载体转化至酿酒酵母感受态细胞1，获得突变菌株感受态细胞；
23.(3.3)将所述重组表达载体2转化至步骤3.2得到的突变菌株感受态细胞，获得生产cbga前体的酿酒酵母工程菌。
24.在其中一些实施例中，上述酰基激活酶基因为ataae1，其核酸序列为如seq id no.8所示的未去除信号肽的全长序列，或为与seq id no.8完全互补配对的序列，或为如seq id no.8所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或与seq id no.6所示至少有相似度为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列；或，所述ataae1的基因序列如seq id no.12所示的去除信号肽的截短序列，或为与seq id no.12完全互补配对的序列，或为如seq id no.12所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列或与seq id no.6所示至少有相似度为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列。
25.在其中一些实施例中，上述硫酯水解酶基因为eht1，eeb1及mgl2中至少一种。
26.在其中一些实施例中，上述突变菌株感受态细胞中eht1，eeb1及mgl2三个基因同时被敲除。
27.本发明的目的之一还在于提供一种生产cbga前体的酿酒酵母工程菌。
28.实现上述目的的技术方案如下：
29.一种生产cbga前体的酿酒酵母工程菌，通过上述构建方法构建得到。
30.本发明的目的之一还在于提供一种生产cbga前体的方法。
31.实现上述目的的技术方案如下：
32.一种生产cbga前体的方法，包括如下步骤：
33.(1)构建如权利要求7所述生产cbga前体的酿酒酵母工程菌；
34.(2)发酵培养步骤(1)中生产cbga前体的酿酒酵母工程菌，得到发酵培养产物；
35.(3)将步骤(2)中得到的发酵培养产物进行提取纯化，得到cbga前体。
36.在其中一些实施例中，上述发酵培养可以采用连续培养、或在分批工艺中(分批培养)或在分批补料或重复分批补料工艺中不连续地培养。关于已知培养方法的一般性质的总结在chmiel的教材(bioprozebtechnik.1：einfiihrung in die bioverfahrenstechnik(gustav fischer verlag，stuttgart，1991))或storhas的教材(bioreaktoren和periphere einrichtungen(vieweg verlag，braunschweig/wiesbaden，1994))中可获得。
37.在其中一些实施例中，上述发酵培养产物提取纯化包括但不限于选自由以下组成的组的一种或多种措施：a)部分(＞0％至＜80％)至完全(100％)或基本上完全(＞80％、＞90％、＞95％、＞96％、＞97％、＞98％或＞99％)除去水；b)部分(＞0％至＜80％)至完全(100％)或基本上完全(＞80％、＞90％、＞95％、＞96％、＞97％、＞98％或＞99％)除去生物质，后者任选地在除去之前是失活的；c)部分(＞0％至＜80％)至完全(100％)或基本上完全(＞80％、＞90％、＞95％、＞96％、＞97％、＞98％、＞99％、＞99.3％或＞99.7％)除去在培养过程中形成的有机副产物；以及d)部分(＞0％)至完全(100％)或基本上完全(＞80％、＞90％、＞95％、＞96％、＞97％、＞98％、＞99％、＞99.3％或＞99.7％)从耗尽培养基中除去所用发酵培养基或起始材料中在培养中未被消耗的成分，从而实现期望目标代谢产物的浓缩或纯化。以此方式分离具有期望含量的cbga前体，进一步优选为间苯三酚化合物。
38.本发明的目的之一还在于提供一种同时表达四酮合酶、橄榄酸环化酶和酰基激活酶的重组表达载体。
39.本发明的目的之一还在于提供一种上述重组表达载体在生产cbga、cbg、thca、cbda、cbd中的应用。
40.本发明的目的之一还在于提供一种cbga的制备方法，其包含如下步骤：
41.(1)构建表达四酮合酶、橄榄酸环化酶和酰基激活酶的酿酒酵母工程菌，所述酰基激活酶能在酿酒酵母体内催化己酰辅酶a的生成；
42.(2)在由步骤(1)得到的酿酒酵母工程菌中，通过所述酰基激活酶催化己酸生成己酰辅酶a，进而在四酮合酶、橄榄酸环化酶的催化下生成间苯三酚化合物；
43.(3)通过由步骤(2)生成的间苯三酚化合物，制备得到cbga。
44.在其中的一些实施例中，上述酰基激活酶基因为ataae1。
45.在其中的一些实施例中，上述ataae1的基因序列如seq id no.7或seq id no.11所示。
46.在其中的一些实施例中，上述步骤(1)中的酿酒酵母工程菌的构建方法包括如下步骤：
47.(1-1)构建将四酮合酶，橄榄酸环化酶基因整合在基因组上的酿酒酵母工程菌；
48.(1-2)构建所述酰基激活酶的基因的表达载体；
49.(1-3)构建得到同时表达四酮合酶、橄榄酸环化酶和所述酰基激活酶的酿酒酵母工程菌。
50.在其中的一些实施例中，上述步骤(1)中，还包括敲除所述酿酒酵母工程菌中的硫酯水解酶基因的步骤。
51.在其中的一些实施例中，上述敲除的硫酯水解酶基因为eht1和eeb1中的一者或两者。
52.在其中的一些实施例中，上述敲除的硫酯水解酶基因为eht1、eeb1及mgl2。
53.本发明的目的之一还在于提供一种酰基激活酶在制备cbga中的应用。
54.在其中的一些实施例中，上述酰基激活酶为ataae1，所述ataae1的基因序列如seq id no.7或seq id no.11所示。
55.在其中的一些实施例中，上述酰基激活酶在酿酒酵母体内催化己酸生成己酰辅酶a。
56.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
57.本发明的发明人通过构建了四酮合酶，橄榄酸环化酶基因整合在基因组上的酿酒酵母工程菌(底盘菌株1)，找到能在酵母体内有效催化己酰辅酶a生成的酰基激活酶表达基因ataae1，并成功构建得到同时表达四酮合酶、橄榄酸环化酶和酰基激活酶的酿酒酵母菌株(表达重组表达载体的底盘菌株2)；在此基础上，通过构建靶向敲除硫酯水解酶的引导rna表达载体，将其转化至底盘菌株2，获得能够大量生产cbga前体的酿酒酵母工程菌。
58.通过测定oa含量，验证各硫酯水解酶突变对oa产量的影响结果可知：当在底盘菌株2中分别敲除eht1，eeb1能够提高酵母体内oa的含量1.5倍及1.2倍。eht1，eeb1两个基因同时敲除的突变菌株中oa含量提高了1.6倍，eht1，eeb1，mgl2三个基因同时敲除的突变菌株中oa含量提高了1.81倍。
59.该酿酒酵母工程菌通过优化酰基激活酶的表达和下调硫酯水解酶的表达，经验证可有效提高菌株的oa产量，预测可同步提高己酰辅酶a的产量，为后续进一步构建新的高效合成cbga前体oa菌株奠定基础。
附图说明
60.图1为实施例3中酰基激活酶酵母重组表达载体pyes2-gal1p-ataae1fl-cyt1t示意图。
61.图2为实施例4中酿酒酵母工程菌中部分表达酰基激活酶oa的产量对比统计图，其中ck组为负对照组。
62.图3为实施例4中酿酒酵母工程菌中部分表达酰基激活酶oa的产量对比统计图，其中ck组为负对照组。
63.图4为实施例6中靶向敲除硫酯水解酶的引导rna表达载体示意图。
64.图5为实施例6中敲除硫酯水解酶后酿酒酵母工程菌生长情况及oa产量对比统计图，其中a为：生长情况对比统计图，b为oa产量对比统计图，图中实验组host为硫酯水解酶基因未敲除对照组。
具体实施方式
65.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
66.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
67.在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
68.此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
69.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
70.实施例1底盘菌株1的构建
71.参考文献[x.luo，m.a.reiter，l.d’espaux，j.wong，c.m.denby，a.lechner，y.zhang，a.t.grzybowski，s.harth，w.lin，h.lee，c.yu，j.shin，k.deng，v.t.benites，g.wang，e.e.k.baidoo，y.chen，i.dev，c.j.petzold，j.d.keasling，complete biosynthesis of cannabinoids and their unnatural analogues in yeast，nature，567(2019)123-126]所述方法将序列cstks-csoac插入到载体pyes2中的位点pgal1与cyc1t之间。得到表达盒pyes2-cstks-csoac，其中cstks-csoac的合成(通用生物合成)序列分别如下：
[0072]
＞cstks-csoac(seq id no.1)
[0073][0074]
用表1-3中引物1114-gal1p-f-49及1114-cyc1t-r-50扩增表达盒pyes2-cstks-csoac，大小为2623bp。用扩增程序如下：
[0075]
表1-1
[0076]
组分体积2xphusion master mix with hf buffer25ul模板(20ng/ul)2ul引物1(10um)1ul引物2(10um)1ul加水补充至50ul
[0077]
扩增条件如下：
[0078]
表1-2
[0079][0080]
[0081]
表1-3底盘菌1构建所用引物
[0082][0083]
电泳检测目的条带特异性，并进行切胶回收。将表达盒pyes2-cstks-csoac插入到酿酒酵母菌株(cen.pk2-1c)基因组ars1114a位点，挑取cen.pk2-1c单克隆，接种至5ml ypd，30℃震荡摇床中230rpm培养过夜。以1∶200转接至新ypd培养基(每个转化约10ml菌体量进行)，起始od600在0.1左右。待od600＝0.4时，离心菌体，用0.1m liac，ph5.7洗菌体一次，离心收集菌体，每个转化样品加入试剂如下表所示：
[0084]
表1-4
[0085]
试剂体积peg 3500 50％w/v240μlliac 1.0m36μlboiled ss-carrier dna(10mg/ml)10μldna mix plus water74μl总体积360μl
[0086]
每个样品分别加入100ng pcas-ars1114a sgrna质粒(pcas-ars1114a sgrna质粒构建方法参考实例6中硫脂水解酶靶向位点载体构建方法)与对应表达盒片段500ng。放置30分钟后，42度热激15分钟。4000g离心5分钟，去除上清。菌体用500ul ypd重悬30度孵育过夜。第二天吸取100ul细胞涂在ypd+300ng/ml g418抗性板上，吹干后放置30度培养2-3天。长出的克隆用表1-3中引物v1114-f-71和gal1r，进行菌落pcr鉴定，确认是否正确插入到菌株cen.pk2-1c基因组ars1114a位点。正确的克隆ypd摇菌后保存菌株，作为底盘菌1，用做下一步酰基激活酶候选基因的游离表达和整合表达。
[0087]
实施例2酰基激活酶基因序列的优化
[0088]
在酵母中的表达外源基因往往由于密码子的不适用性而达不到预期效果。发明人根据at4g05160，ataae1，ataae12，csaae3及csaae1序列利用gene optimizer选择酵母偏好性密码子进行优化。将没有去除信号肽的基因或蛋白序列定位为全长(full length，fl)，去除信号肽的基因或蛋白序列定义为截短多肽(truncated peptide，tp)，过氧化物酶体信号肽一般为蛋白的c端skl。fl及tp序列分别如下所示，各基因序列确定后交由通用生物合成。
[0089]
优化后核苷酸序列分别如下：
[0090]
＞at4g05160 fl(seq id no.6)
[0091][0092]
＞ataae1 fl(seq id no.7)
[0093][0094]
[0095]
＞atae12 fl(seq id no.8)
[0096][0097]
＞csaae3 fl(seq id no.9)
[0098][0099]
＞at4g05160 tp(seq id no.10)
[0100][0101]
[0102]
＞atae1 tp(seq id no.11)
[0103][0104]
＞atae12 tp(seq id no.12)
[0105]
[0106][0107]
＞csaae3 tp(seq id no.13)
[0108][0109]
实施例3酰基激活酶酵母表达载体的构建
[0110]
根据上述实施例2合成得到的序列，设计表中引物(如表3-3所示)，分别克隆至pyes2载体gal1启动子3’端以正确驱动各序列的表达。插入片段获得及线性化pyes2载体由2
×
phusion master mix with hf buffer(neb)扩增，具体扩增体系可参考如下：
[0111]
表3-1
[0112]
组分体积2
×
phusion master mix with hf buffer25ul
模板(20ng/ul)2ul引物f(10um)1ul引物r(10um)1ul加水补充至50ul
[0113]
扩增条件如下：
[0114]
表3-2
[0115][0116]
表3-3构建候选基因fl及tp表达载体所用引物
[0117]
[0118][0119]
注：在碱基序列中，加粗碱基代表同源序列，非加粗部分为扩增引物。
[0120]
目标条带经电泳检测条带大小是否正确单一，并将正确条带进行切胶回收。按照neb hifi dna assembly说明书将基因载体构建。反应体系为：0.2pmol线性化pyes2载体，片段摩尔数与载体摩尔数之比为3∶1，5ul 2
×
hifi master mix，加水补充至10ul。50℃反应30分钟。全部的反应体系转化至dh5a感受态，并在lb/amp培养基上筛选阳性克隆子。经过菌落pcr后测序验证其正确性，测序正确的克隆进行质粒提取，并用nanodrop测定其浓度及纯度。经验证，每个候选酰基激活酶基因的fl及tp载体均顺利构建完毕，其中基因ataae1fl的表达载体构建示意图如图1所示。
[0121]
实施例4酵母中酰基激活酶基因的表达及功能验证
[0122]
游离表达酰基激活酶时各蛋白功能的验证：将100ng各酰基激活酶表达载体分别转入到底盘菌1中，在sd-ura筛选平板上筛选阳性转化子。挑取阳性转化子，在96孔深孔板中加入400ul sd-ura，30℃高速摇床800rpm培养24小时。按1∶40将酵母细胞接入400ul sg-ura培养基中，加入1mm己酸(100mm己酸母液用0.1mnaoh配制)，30℃高速摇床800rpm培养72-96小时。
[0123]
等体积加入乙腈，30℃高速摇床震荡30min进行酵母细胞的破碎，3000rpm离心10min。将上清转入uplc上样瓶中，uplc检测各样品中oa及其相关化合物的生成情况。
[0124]
整合表达酰基激活酶时各蛋白功能的验证：以构建好的酵母表达载体为模板，用表4-1中引物分别扩增不同酰基激活酶的表达盒。电泳检测目的条带特异性，切胶回收目的条带，该片段用于整合表达不同酰基激活酶的表达盒。
[0125]
制备底盘1感受态，加入100ng x2位点sgrna载体及500ng表达盒片段，在ypd+300ng/ml g418的平板上筛选阳性克隆。用引物x2-up-260/gal1r进行菌落pcr确定表达盒插入到基因组上。检测阳性克隆用400ul ypd培养基培养24小时后按1∶40接种至400ul ypg培养基中诱导表达目的基因表达，72小时后裂解细胞，测定总oa含量。
[0126]
表4-1酰基激活酶基因整合表达引物
[0127][0128]
统计结果如图2、3所示，实验表明，游离表达时，ataae1不管fl还是tp均能够在酵母中催化己酸生成己酰辅酶a，从而进一步在cstks及csoac催化下生成oa。其他蛋白at4g05160，ataae12及csaae3没有发现该趋势。将ataae1整合到酵母基因组上之后，相对与负对照(为没有转化aae基因的底盘菌1)中oa含量，进一步确定了ataae1能够有效催化己酸生成己酰辅酶a，之后再在cstks和csoac催化下生成oa，进而应用到cbga的异源生产中。
[0129]
实施例5底盘菌株2的构建
[0130]
方法1
[0131]
参考实施例1所述方法分别用于将序列cstks-csoac-csaae1插入到载体pyes2中的位点pgal1与cyc1t之间。其中cstks-csoac-csaae1的合成(通用生物合成)序列分别如下：
[0132]
＞cstks-csoac-csaae1(seq id no.38)
[0133]
[0134]
[0135][0136]
参考上述实施例1中相同方法及试剂，验证并得到正确将表达盒pyes2-cstks-csoac-csaae1插入到菌株cen.pk2-1c基因组ars1114a位点的菌株，作为底盘菌2。
[0137]
方法2
[0138]
将上述实施例3中酰基激活酶酵母表达载体插入实施例1构建的底盘菌1中，同理构建得到底盘菌2，构建方法参考实施例4。
[0139]
实施例6硫酯水解酶基因敲除及验证
[0140]
虽然己酰辅酶a能够在酵母中顺利生成，但酵母中存在的硫脂水解酶能够将己酰辅酶a水解为己酸，降低己酸往oa及cbga代谢途径的流向。为探究降低硫酯水解酶表达能否改善这一过程，发明人设计了敲除酵母基因组中三个硫酯水解酶的实验，并分别构建了sceeb1，sceht1及scmgl2这三个基因单突菌株，双突及三突的酵母菌株，测定oa含量，分析硫脂水解酶功能。具体过程如下：
[0141]
首先构建基因eeb1，eht1及mgl2的sgrna表达载体，靶向相应的基因并引入突变。各sgrna序列见表6-1，sgrna表达载体示意图谱如图4所示。构建过程如下：每个sgrna的f引物与cas9r-0001搭配，扩增出sgrna表达的第一个片段，每个sgrna的r引物与cas9f-0001引物搭配，扩增出sgrna表达的第二个片段。用xmai/bglii双酶切pcas质粒，切胶回收目的条带。按照neb hifi dnaassembly说明书将基因载体构建。
[0142]
反应体系为：0.2pmol线性化pcas载体，片段摩尔数与载体摩尔数之比为3∶1，5ul 2
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hifi master mix(neb)，加水补充至10ul。50℃反应30分钟。全部的反应体系转化至dh5a感受态，并在lb/amp培养基上筛选阳性克隆子。经过菌落pcr后测序验证其正确性，测序正确的克隆进行质粒提取，并用nanodrop测定其浓度及纯度。
[0143]
表6-1硫酯水解酶基因eeb1，eht1及mgl2 sgrna及突变序列
[0144][0145]
各基因突变供体dna的制备：参考按照以下体系混匀各样品：
[0146]
表6-2
[0147][0148][0149]
pcr仪中设置程序如下：
[0150]
表6-3
[0151][0152]
突变体的制备：按照实施例1所述方法制备底盘菌2的感受态，将100ng pcas-eht sgrna，pcas-eeb sgrna，pcas-mgl2 sgrna分别与制备好的5ul供体dna共同转化底盘菌2(其中酰基激活酶为csaae1)，并在ypd+300ng/ul g418抗性平板上进行筛选。得到的阳性克隆子进行菌落pcr扩增，pcr产物进行sanger测序，确认相应的基因突变的正确性。同样的双突变体及三突变体制备过程同单突变体制备过程，不同的是感受态不同。
[0153]
eht1，eeb1及mgl2单突变体，双突变体及三突变体单克隆用400ul ypd摇菌，高速摇床800rpm震荡培养24小时，按1：40接种于ypd+1mm己酸培养基中，培养72小时后测定oa含量，结果如图5。结果表明，敲除eht1，eeb1时，酵母生长没有受到明显影响，但酵母中oa产量分别提高了1.5倍，1.2倍。而敲除mgl2时，oa产量没有明显升高。双突变体eeb1/eht1中oa产量提高到对照得到1.6倍，三突变体eeb1/eht1/mgl2中oa产量提高到对照的1.81倍。说明在酵母体内敲除三个硫酯水解酶能够有效抑制己酰辅酶a的水解，促进oa的产生。这一发现能够与前述酰基激活酶ataae1功能相互补充，为构建新的高效合成cbga前体oa菌株奠定基础。
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以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。