针对FOLR1的单域抗体及其衍生蛋白和应用的制作方法

本发明属于免疫学领域，涉及针对folr1的单域抗体及其衍生蛋白和应用。

背景技术：

1、olr是人叶酸受体蛋白家族成员之一，包括folr1、folr2、folr3三种亚型。其中folr1(folate binding proteinl)是糖基化磷脂酰基醇偶联的糖蛋白，相对分子质量38～40kd，由folr1基因编码，完全暴露于细胞外膜，可通过细胞吞饮转移机制介导叶酸进入细胞内，参与dna复制和损伤修复，对细胞分裂、增殖和组织生长有非常重要的作用。

2、近年来，许多文献报道folr1在正常组织表达较低，但在许多肿瘤细胞如卵巢癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、肺癌、睾丸癌、室鼓膜瘤和脉络膜瘤等存在过度表达，所以folr1可作为上述恶性肿瘤的诊断指标。研究发现folr1可从肿瘤脱落的游离受体通过自身孔道进入血液系统，提示血清folr1可成为早期肿瘤标志物。

3、近年来folr1在卵巢恶性肿瘤方面的研究是一个热点，卵巢恶性肿瘤的死亡率在全部女性恶性肿瘤中高居第四位并有逐渐上升的趋势，而上皮性卵巢癌(eoc)占卵巢恶性肿瘤的85-90％，是妇科癌症死亡的首要原因。由于早期筛查效果欠佳，因此预防和早期诊断难度大。目前一线治疗方式包括手术和化疗，但是往往因转移、手术残留灶、化疗耐药等原因，eoc的五年生存率始终难以提高，因此发展新的治疗方法和策略对eoc患者具有重要意义。而有研究表示，对于eoc，血清folr1可能是一个高度特异性的诊断标志物，并且有望成为上皮性卵巢癌诊断、靶向治疗及化疗疗效监测的一个参考指标。

4、ca125是最广泛使用的卵巢癌血清肿瘤标志物，fda批准其用于监测化疗效果和对盆腔包块患者的鉴别诊断。但血清ca125水平升高常与其他病理情况有关，如子宫内膜异位症、子宫腺肌症、子宫肌瘤、盆腔炎性疾病、卵巢良性肿瘤等，且在早期卵巢癌患者中仅有一半血清ca125升高。因此，ca125对早期卵巢癌敏感性较差，对卵巢癌总体特异性较差。由于这些原因，ca125既没有作为卵巢癌的筛查的生物标志物，也没有作为早期诊断卵巢癌的生物标志物块患者中区分上皮性卵巢癌患者的检验效能优于ca125。研究者根据不同研究方法对卵巢恶性肿瘤患者的标本，均提出folr1可作为诊断早期卵巢恶性肿瘤标志物的观点。目前已有的研究结果表明folr1与卵巢恶性肿瘤患者临床关系紧密。目前，一些folr1靶向治疗药物正在进行临床试验，这可能对化疗疗效监测有用。

5、为了提高卵巢恶性肿瘤诊断的灵敏度，有人研究了eoc患者血清高迁移率族蛋白a2(hmga2)、白细胞介素-22(il-22)、叶酸受体1(folr1)水平与临床指标的相关性，研究结果表明，血清hmga2、il-22、folr1联合诊断具有更好的灵敏度(95％)、特异度(96.7％)。另外，对folr1与msln在eoc发病中相互作用以及联合检测两者来判断eoc患者的预后进行探索，结果发现，folr1高表达的eoc患者预后好，msln高表达的患者预后差。两种蛋白可能共同参与了eoc的进程，联合检测folr1和msln两种蛋白的表达，有助于eoc的预后判断，为卵巢癌的诊断、治疗和预后判断提供了新的思路。

6、紫杉醇是一种从短叶红豆杉中提取的具有体外抗肿瘤活性的药物，是一种抗微管解聚的细胞毒类药物。年经批准紫杉醇作为治疗卵巢癌的新药应用于临床。目前，大量研究证实紫杉醇可将肿瘤细胞阻滞于g2/m期。而此阶段肿瘤细胞对放疗敏感，可以到放疗增敏的作用。因此,紫杉醇应用于鼻咽癌的同期放化疗也越来越广泛，并已取得了理想疗效。但是，紫杉醇也和其它化疗药物一样长期使用将会导致肿瘤细胞耐药，从而导致化疗失败。有研究证明靶向folr1的脱氧核酶drze能明显增加鼻咽癌紫杉醇耐药细胞对紫杉醇的敏感性。在另一方面，最近的一项研究表明，folr1的高表达增加了卵巢癌细胞对顺铂治疗的敏感性，这有可能与改善患者预后相关。基于目前的tcga大样本分析，结合最新报道的机制研究(folr1增加顺铂敏感性)，研究者认为folr1高表达是卵巢的有利预后因素，原因可能在于:folr1高表达的患者，化疗敏感性增加，从而预后得到改善。

7、近年来肿瘤免疫治疗的发展突飞猛进，pd-1(programmed death-1)、pd-l1(programmed death-ligan1)、ctla-4(cytotoxic t-lymphocyte associated protein 4)抗体的市场化应用，car-t技术在血液系统肿瘤取得巨大成功(如白血病中的cd19-car)。2017年被称为car-t元年，美国fda批准了两款用于急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤的car-t疗法，临床应用中的高缓解率加上商业化的推广使得过继细胞治疗(adoptive celltransfer therapy，act)备受瞩目。car-t疗法的最主要特点是直接赋予了t细胞靶向识别功能，是临床应用中“活的药物”。

8、国内已有人研究靶向叶酸受体α和间皮素串联型car-t的构建及其在上皮性卵巢癌的应用，他们构建了人源化的folr1-car慢病毒质粒，包含两个共刺激分子(cd28/4-1bb)和il-12基因，包装慢病毒并感染cd3细胞。结果筛选并验证了其在eoc中高表达的taa，成功构建了靶向folr1的第四代car-t，相较于单靶点car-t，它在体外的杀伤效能更强，能分泌高水平的细胞因子，b-ndg小鼠荷瘤模型表明folr1-car在体内仍有抗肿瘤能力。

9、目前全球car-t临床注册试验获批500多项，虽然car-t在实体瘤取得一定疗效，但完全缓解率(complete response,cr)和部分缓解(partial response,pr)仍较低，使得其大规模临床应用受限，其副作用细胞因子释放综合征给病人带来的伤害也不可小觑。

10、纳米抗体，基于骆驼重链抗体的vhh单域抗体的特殊结构，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎完美克服了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷。单域抗体(single domain antibody，sdab)是指包含了抗体中单个可变域的片段，是抗体分子的最小抗原结合单元，大约12～15kd。虽然小但和完整的抗体相同，它可以选择性地和特定抗原结合。此外，它还有传统抗体所没有的优势，如改进的筛选，改进的分离技术，以及不需要动物牺牲。由于其分子量小，可穿透血脑屏障，在生物医药的开发方面有着天然的优势，这或许可以成为治疗卵巢癌等恶性肿瘤的最佳药物。本领域仍需要能够folr1高亲和力结合，能介导adcc或发生内化，并具有较好成药性的抗folr1抗体，特别是抗folr1重链单域抗体。

技术实现思路

1、为了克服上述缺陷，本发明的目的是提供针对folr1的单域抗体及其衍生蛋白和应用，使用生物基因工程技术筛选出特异性针对folr1单域抗体，这些抗体初步亲和力明显，并且具有阻断特定细胞释放细胞因子，通过原核表达即具有良好的结合活性，具有一定的成药性。

2、本发明的第一方面，提供了针对folr1的单域抗体，所述的单域抗体由重链构成，重链包括重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3；

3、所述的重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3的氨基酸序列为下述(1)-(7)的一种：

4、(1)seq id no:16所示的cdr1，seq id no:22所示的cdr2，seq id no:32所示的cdr3；

5、(2)seq id no:15所示的cdr1，seq id no:24所示的cdr2，seq id no:29所示的cdr3；

6、(3)seq id no:19所示的cdr1，seq id no:27所示的cdr2，seq id no:34所示的cdr3；

7、(4)seq id no:20所示的cdr1，seq id no:25所示的cdr2，seq id no:33所示的cdr3；

8、(5)seq id no:18所示的cdr1，seq id no:28所示的cdr2，seq id no:34所示的cdr3；

9、(6)seq id no:17所示的cdr1，seq id no:23所示的cdr2，seq id no:31所示的cdr3；

10、(7)seq id no:21所示的cdr1，seq id no:26所示的cdr2，seq id no:30所示的cdr3。

11、即，所述的重链包括互补决定区cdr；所述互补决定区cdr包括重链cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列。以上cdr序列(1)-(7)依次与seq id no.1-7对应。上述所有序列，可以替换为与该序列具有“至少80％同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列；优选为“至少85％同源性”，更优选为“至少90％同源性”，更优选为“至少95％同源性”，最优选为“至少98％同源性”。

12、在优选实施例中，所述的单域抗体的序列还包括框架区fr；所述框架区fr包括fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列；

13、所述的单域抗体的框架区fr的序列为下述(a)-(g)中的一种；

14、(a)seq id no:36所示的fr1，seq id no:39所示的fr2，seq id no:49所示的fr3，seq id no:52所示的fr4，或其变体，所述变体在所述fr中包含至多3个氨基酸的替换；

15、(b)seq id no:36所示的fr1，seq id no:44所示的fr2，seq id no:51所示的fr3，seq id no:52所示的fr4，或其变体，所述变体在所述fr中包含至多3个氨基酸的替换；

16、(c)seq id no:36所示的fr1，seq id no:42所示的fr2，seq id no:48所示的fr3，seq id no:52所示的fr4，或其变体，所述变体在所述fr中包含至多3个氨基酸的替换；

17、(d)seq id no:36所示的fr1，seq id no:40所示的fr2，seq id no:50所示的fr3，seq id no:52所示的fr4，或其变体，所述变体在所述fr中包含至多3个氨基酸的替换；

18、(e)seq id no:38所示的fr1，seq id no:42所示的fr2，seq id no:47所示的fr3，seq id no:52所示的fr4，或其变体，所述变体在所述fr中包含至多3个氨基酸的替换；

19、(f)seq id no:35所示的fr1，seq id no:43所示的fr2，seq id no:45所示的fr3，seq id no:52所示的fr4，或其变体，所述变体在所述fr中包含至多3个氨基酸的替换；

20、(g)seq id no:37所示的fr1，seq id no:41所示的fr2，seq id no:46所示的fr3，seq id no:52所示的fr4，或其变体，所述变体在所述fr中包含至多3个氨基酸的替换。

21、在一个实施方案中，所述针对folr1的单域抗体与选自seq id no：1-7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同源性，并且能够特异性结合folr1抗原。

22、在另一个优选实施例中，所述针对folr1的单域抗体与选自seq id no：1-7的氨基酸序列具有至少95％序列同源性，并且能够特异性结合folr1抗原。

23、本发明的第二方面是提供针对folr1的单域抗体，所述单域抗体分别如seq idno.1-7所示，或者所述单域抗体与seq id no.1-7的氨基酸序列具有至少95％序列同源性。

24、在一个实施方案中，编码所述针对folr1的单域抗体的核酸分子与选自seq idno：8-14的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同源性，并且其编码的针对folr1单域抗体能够特异性结合folr1抗原。

25、优选的，所述单域抗体的编码序列分别如seq id no.8-14所示，或者与seq idno.8-14具有至少95％序列同源性。

26、本发明的第三方面是提供前述的针对folr1的单域抗体的fc融合抗体或人源化抗体。

27、本发明的第四个方面是提供编码前述的针对folr1单域抗体的核苷酸分子，其核苷酸序列分别如seq id no：8-14所示，或者与seq id no.8-14具有至少95％序列同源性。

28、本发明的第五个方面是提供一种表达载体，其包含编码前述的单域抗体或者前述的fc融合抗体的核苷酸分子或者前述的核苷酸分子。

29、本发明的第六个方面是提供一种宿主细胞，其可以表达出前述的针对folr1的单域抗体，或其包含前述的表达载体。

30、本发明还提供一种产生针对folr1的单域抗体或其fc融合抗体的方法，包括步骤：(a)在适合产生单域抗体或其fc融合抗体的条件下，培养前述的宿主细胞，从而获得含所述针对folr1单域抗体或其fc融合抗体的培养物；(b)从所述培养物中分离或回收所述的针对folr1单域抗体或其fc融合抗体；以及(c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的针对folr1单域抗体或其fc融合抗体。

31、本发明的第七个方面是提供一种药物组合物，所述药物组合物含有：(i)如前述的针对folr1的单域抗体、或前述的针对folr1的单域抗体的fc融合抗体；以及(ii)一种或几种药学上可接受的赋型剂。

32、本发明还提供前述的针对folr1的单域抗体在制备抑制folr1基因表达的药物或抗肿瘤药物中的用途。抑制folr1基因表达的药物可适用于folr1基因高表达的任何病症。优选的，所述的肿瘤包括但不限于卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、宫颈癌。

33、本发明还提供针对folr1的单域抗体在制备介导细胞内化、adcc或cdc作用的制剂中的应用。

34、本发明还提供前述的针对folr1的单域抗体、或前述的针对folr1的单域抗体的fc融合抗体的用途，用于制备试剂、检测板或试剂盒；其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中folr1蛋白的存在和/或含量。

35、所述的单域抗体为vhh，其仅包含抗体重链，不包含抗体轻链。

36、相对于现有技术，本发明使用生物基因工程技术筛选出特异性针对folr1的单域抗体，这些抗体初步亲和力明显，并且具有阻断特定细胞释放细胞因子，通过原核表达即具有良好的结合活性，具有一定的成药性，这些单域抗体具有以下优势：

37、(1)这些单域抗体的表达体系选择灵活，既可以在原核系统中表达也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞的真核系统中表达，且其在原核表达系统中的表达成本低，可降低后期生产成本。

38、(2)由于单域抗体为单结构域抗体，所以其抗体的多组合形式改造更为简单，通过基因工程的方式简单的串联即可以获得多价、多特异性的抗体，并且其免疫异质性很低，在不经过人源化改造的情况下也不会产生较强的免疫反应。

39、(3)正如多篇文献报道的那样，单域抗体的亲和力范围更为宽泛，在未进行亲和力成熟之前，其亲和力范围可以从nm级别至pm级别，为后期不同用途的抗体提供多个选择。