一种检测用透明质酸酶液体制剂及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种检测用透明质酸酶液体制剂及其应用。


背景技术：

2.透明质酸酶(hyaluronidase，haase)，也称玻璃酸酶，是一种能够特异性水解透明质酸的酶类的总称。
3.早在1928年duran-reynals在研究哺乳动物睾丸及其他组织提取物时发现了一种“扩散因子”，可以促进皮下注射的疫苗、染料、毒素等更好地扩散。1940年meyer将这种“扩散因子”命名为hyaluronidase。此后，人们在许多组织及生物体内检测到了透明质酸酶，包括细菌病毒、细菌、真菌等，非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物的毒液中也产生透明质酸酶。脊椎动物中，在蛇、蜥蜴的毒液中，睾丸及其他器官如肝脏、肾脏、淋巴系统及皮肤中均发现透明质酸酶的存在。
4.透明质酸酶同样是透明质酸相关研究不可或缺的工具酶，专利cn201811508968.x一种测定透明质酸含量的方法，提供了利用透明质酸酶酶解透明质酸盐及相关产品进而测定透明质酸含量的方法。专利cn201810999774.8一种测定交联透明质酸凝胶体外酶解性能的方法，利用透明质酸酶对交联透明质酸酶解速率的不同，提供了一种测定交联透明质酸凝胶体外酶解性能的方法。专利cn201911259050.0一种三偏磷酸钠交联透明质酸粉末的制备方法及所得产品和应用，利用透明质酸酶确认了三偏磷酸钠交联透明质酸粉末与透明质酸相比的抗酶解性能。专利cn202010243080.9交联或高分子量透明质酸类物质的微生物限度检测方法，利用透明质酸酶降低交联或高分子量透明质酸溶液黏度，进而对其进行微生物限度的检测方法。
5.透明质酸酶制剂，常使用复杂的酶活保护剂、稳定剂、缓冲剂来保持其酶活的稳定性。专利cn201610081945.x一种重组人透明质酸酶液体制剂及其制备方法和应用，提供了一种重组人透明质酸酶液体制剂，包含组分：1400000～500000000iu重组人透明质酸酶、5～10g缓冲剂、60～180g冷冻保护剂、180～300g赋形剂、5～12g酶活保护剂和0.3～5g表面活性剂。专利cn201380057659.4用于透明质酸酶的稳定剂和包括透明质酸酶的液体制剂，所述稳定剂含有：缓冲剂，以提供ph 4.0至6.0；0.001至0.5v/v％的非离子表面活性剂；和0.1至5mm的螯合剂或mgcl2。这些稳定剂、保护剂、表面活性剂均会对透明质酸酶的应用产生一定的影响和干扰，特别是在含有透明质酸的复杂体系中，如饮料、化妆品溶液中的含量检测等。同时，若使用冻干粉制剂进行检测，在使用之前应重新制备成液体形式，使用不方便，同时在低浓度称量时，易导致检测不准确。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种检测用透明质酸酶液体制剂及其应用，具体来说，本发明涉及如下方面：
7.1、一种检测用透明质酸酶液体制剂，其特征在于，所述液体制剂包括含有透明质
酸酶的发酵产品、无机盐和纯化水，其中所述无机盐为不引起220-235nm紫外区吸收的盐。
8.2、根据项1所述的液体制剂，其特征在于，以所述液体制剂的体积为基准，所述液体制剂中透明质酸酶的含量为106～108iu/l。
9.3、根据项1所述的液体制剂，其特征在于，以所述液体制剂的体积为基准，所述无机盐的含量为10～300g/l，优选的含量为30～100g/l。
10.4、根据项1所述的液体制剂，其特征在于，所述含有透明质酸酶的发酵产品中透明质酸酶比活为104iu/mg～106iu/mg。
11.5、根据项1所述的液体制剂，其特征在于，所述含有透明质酸酶的发酵产品由芽孢杆菌(bacillus sp.)a50 cgmcc no.5744生产并纯化得到。
12.6、根据项1所述的液体制剂，其特征在于，所述无机盐为含氯无机盐。
13.7、根据项6所述的液体制剂，其特征在于，所述无机盐选自氯化钠和氯化钾中的一种或两种。
14.8、根据项1所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂由含有透明质酸酶的发酵产品、无机盐和纯化水构成。
15.9、根据项1所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂分装于无菌容器中。
16.10、透明质酸酶液体制剂在检测中的应用，所述透明质酸酶液体制剂为项1-9中任一项所述的液体制剂。
17.本发明与现有技术相比，本发明提供了一种芽孢杆菌透明质酸酶液体制剂的极简配方，能够长期维持透明质酸酶酶活的稳定性，具有以下优点：
18.该透明质酸酶制剂采用芽孢杆菌透明质酸酶为主料，以10～300g/l的无机盐为稳定剂及防腐剂，成分单一，且为常用惰性盐分，不会对透明质酸酶制剂的使用产生干扰。
19.尽管该透明质酸酶制剂配方简单，但是能够保持良好的酶活稳定性，其在-20℃冷冻条件下，透明质酸酶酶活可以在24个月内维持80％以上，在25℃下条件下酶活可以在30天内维持80％以上，在40℃条件下酶活可以在7天内维持80％以上，从而保证了良好的储存、使用、运输条件下的稳定性。
具体实施方式
20.下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
21.除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
22.如上所述，透明质酸酶是透明质酸相关研究不可或缺的工具酶，在检测领域具有广泛的应用，例如可以用于测定样品中透明质酸或其盐的含量，测定透明质酸凝胶的体外酶解性能，测定交联透明质酸酶的抗酶解性能等。当前使用透明质酸酶进行检测时，通常需要将透明质酸冻干制剂配制为酶液进行使用。这种方式使用不方便，同时由于每次称量的量比较少，以及每次操作的差异，容易造成检测误差。而将透明质酸酶配制成液体制剂进行
检测，往往需要加入复杂的稳定剂或保护剂。为了解决上述问题，本发明提供一种使用方便的透明质酸酶液体制剂，所述液体制剂包括含有透明质酸酶的发酵产品、无机盐和纯化水，其中所述无机盐为不引起220-235nm紫外区吸收的盐。进一步地，所述无机盐可以为含氯无机盐，优选的选自氯化钠和氯化钾中的一种或两种。无机盐在所述透明质酸酶制剂中作为透明质酸酶的稳定剂或保护剂，同时不会对检测产生影响。
23.其中，在配制料液时，含有透明质酸酶的发酵产品的形式不受限定，例如可以为发酵液上清、盐析复溶酶液、超滤酶液、离子交换洗脱酶液等。其中，发酵液上清是透明质酸酶发酵后离心得到的上清液，盐析复溶酶液是指将发酵上清液采用硫酸铵盐析—离心获得沉淀-沉淀复溶液体得到的酶液，超滤酶液是指将发酵上清液采用超滤法纯化获得的酶液，离子交换酶液为将超滤酶液经阴离子交换树脂纯化获得的酶液。
24.本发明所述含有透明质酸酶的发酵产品可以是任何来源的含有透明质酸酶的发酵产品，优选由芽孢杆菌(bacillus sp.)a50 cgmcc no.5744生产并纯化得到。具体的，芽孢杆菌(bacillus sp.)a50 cgmcc no.5744产透明质酸酶的制备可以参考cn201210497017.3(名称为一种芽孢杆菌、一种透明质酸酶及其制备方法和用途)。纯化方法可以是本领域任何已知的方法，例如可以为离心、过滤、盐析、超滤、离子交换，凝胶层析。因此，该透明质酸酶冻干制剂的制备方法的适用范围非常广泛，无论是不经纯化的发酵液上清还是经过不同步骤纯化的酶液均可以采用本发明的方法进行制备。
25.在一个具体的实施方式中，所述含有透明质酸酶的发酵产品中透明质酸酶比活为104iu/mg～106iu/mg，例如可以为104iu/mg、2
×
104iu/mg、5
×
104iu/mg、8
×
104iu/mg、105iu/mg、2
×
105iu/mg、5
×
105iu/mg、8
×
105iu/mg、106iu/mg。
26.其中iu是用来表示酶活力大小的单位。酶活测定方法可以参照2020版《中国药典》第四部1207《玻璃酸酶测定法》执行。
27.在一个具体的实施方式中，所述无机盐为含氯无机盐。
28.在一个优选的实施方式中，所述无机盐选自氯化钠和氯化钾中的一种或两种，例如可以为氯化钠，或者氯化钾，或者氯化钠和氯化钾的混合物。
29.在一个具体的实施方式中，以所述液体制剂的体积为基准，所述液体制剂中所述透明质酸酶的含量为106～108iu/l，例如可以为106iu/l、2
×
106iu/l、5
×
106iu/l、8
×
106iu/l、107iu/l、2
×
107iu/l、5
×
107iu/l、8
×
107iu/l、108iu/l。所述无机盐的含量为10～300g/l，优选的含量为30-100g/l，例如可以为10g/l、20g/l、30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、150g/l、200g/l、250g/l、300g/l。
30.所述的透明质酸酶液体制剂可以直接使用，也可以分装于合适的无菌包装器材中，优选装液量为1ml/支，可以直接用于一次检测。
31.进一步，本发明还提供一种由含有透明质酸酶的发酵产品、无机盐和纯化水构成的透明质酸酶液体制剂。其中，所述透明质酸酶产品和无机盐的选择和限定如上所述。
32.本发明还提供上述透明质酸酶液体制剂在检测中的应用。
33.所述检测选自对透明质酸及其衍生物进行定量或定性检测、对交联透明质酸进行定量或定性检测、对硫酸软骨素进行定量或定性检测、对杂质进行定量或定性分析检测、和对抗酶解性能进行测试中的一种或两种以上。例如，cn202010547909.4描述了一种快速测定发酵液中透明质酸含量的方法，即对透明质酸盐及其衍生物定量检测的方法。该方法采
用透明质酸酶将发酵液中的透明质酸彻底酶解为4,5-不饱和双糖，然后检测酶解前后发酵液的紫外吸收值，进而计算发酵液中的透明质酸含量。cn201811508968.x同样涉及对透明质酸定量的检测方法，描述了一种利用透明质酸酶对包含透明质酸的待测样品进行酶解，检测由透明质酸酶酶解后的透明质酸，并进一步基于检测结果计算该待测样品中所含的透明质酸的含量。cn202010243080.9描述了交联或高分子量透明质酸类物质的微生物限度检测方法，该方法在低温弱酸条件下对待检的交联或高分子量透明质酸类物质进行酶解处理，以降低交联或高分子量透明质酸类物质溶液的粘度，然后将粘度降低的酶解液配制检液，实现待检样品的微生物限度检测。cn201811508981.5提供一种测定包含有柠檬酸的溶液中透明质酸含量的方法，其包括：利用透明质酸酶对包含透明质酸和柠檬酸的待测样品进行酶解；使用用于分析有机酸的离子交换柱，利用不含盐的流动相，检测由透明质酸酶酶解后的透明质酸；以及基于检测结果计算透明质酸的含量。cn201810999774.8描述了一种测定交联透明质酸凝胶体外酶解性能的方法，该方法利用透明质酸酶酶解交联透明质酸凝胶，然后采用紫外-可见分光光度法测定酶解过程中产生的酶解液，从而对抗酶解性能进行测试。通过吸光度计算交联透明质酸凝胶的体外酶解率。
34.本发明的透明质酸酶液体制剂采用芽孢杆菌透明质酸酶为主料，以10～300g/l的无机盐为稳定剂及防腐剂，成分单一，不会对透明质酸酶制剂的使用产生干扰。且具有良好的酶活稳定性，其在-20℃冷冻条件下，透明质酸酶酶活可以在24个月内维持80％以上，在25℃条件下，酶活可以在30天内维持80％以上，在40℃条件下酶活可以在7天内维持80％以上，从而更便于储存和检测使用。
35.实施例
36.(1)制备含有透明质酸酶的发酵液上清
37.参照cn201210497017.3(一种芽孢杆菌、一种透明质酸酶及其制备方法和用途)中描述的方法进行透明质酸酶发酵，离心后获得发酵液上清。其中，测定含有透明质酸酶的发酵液上清的酶比活为1.4
×
104iu/mg～3.0
×
104iu/mg。
38.其中，含有透明质酸酶的发酵产品的酶活测定方法参照2020版《中国药典》第四部1207《玻璃酸酶测定法》执行，蛋白质的测定方法采用考马斯亮蓝法。
39.其中，透明质酸酶比活(iu/mg)＝透明质酸酶酶活/蛋白含量。
40.(2)制备含有透明质酸酶的超滤酶液
41.发酵液上清液采用30kda～50kda的超滤膜超滤得到超滤酶液。其中，测定含有透明质酸酶的超滤酶液的酶比活为1
×
105iu/mg～4
×
105iu/mg。
42.(3)制备含有透明质酸酶的盐析复溶酶液
43.发酵液上清，25％-35％硫酸铵分级沉淀离心后，采用等体积纯化水重溶得到盐析复溶酶液。其中，测定含有透明质酸酶的盐析复溶酶液的酶比活为2
×
105iu/mg～6
×
105iu/mg。
44.(4)制备含有透明质酸酶的离子交换酶液
45.超滤酶液或者盐析复溶酶液经过deae-fast flow离子树脂吸附，0-1m nacl梯度洗脱得到离子交换洗脱液，并经过透析除盐获得。其中，测定含有透明质酸酶的离子交换酶液的酶比活为2
×
105iu/mg～1
×
106iu/mg。
46.实施例1
47.将步骤(4)中含有6.7
×
106iu透明质酸酶的离子交换酶液加入30g氯化钠，充分溶解后，经过0.2微米的无菌滤膜过滤除菌。将经过121℃，20min灭菌放凉后的纯化水，加入上述溶液中，定容至1l，得到透明质酸酶液体制剂。进一步将配制的透明质酸酶液体制剂分装于预灭菌的3ml西林瓶中，装液量为1ml/支。
48.实施例2-4
49.实施例2-4与实施例1的不同在于液体制剂中透明质酸酶的含量不同。其它反应条件与实施例1相同。具体的，实施例2中的透明质酸酶的含量为5.8
×
107iu/l，实施例3中的透明质酸酶含量为2.4
×
108iu/l，实施例4中的透明质酸酶含量为5
×
106iu/l。
50.实施例5-7
51.实施例5-7与实施例1的不同在于，含有透明质酸酶的发酵产品中透明质酸酶比活。其它反应条件与实施例1相同。
52.具体的，实施例5中透明质酸酶为盐析复溶酶液，其酶比活为5.3
×
105iu/mg。
53.实施例6中透明质酸酶为超滤酶液，其酶比活为4.4
×
105iu/mg。
54.实施例7中透明质酸酶为发酵上清液，其酶比活为2.6
×
104iu/mg。
55.实施例8
56.实施例8与实施例7的不同在于，透明质酸酶液体制剂中使用同样含量的氯化钾代替氯化钠。其它反应条件与实施例1相同。
57.实施例9-12
58.实施例9-12与实施例7的不同在于，透明质酸酶液体制剂中氯化钠的含量不同。其它反应条件与实施例7相同。具体的，实施例9中的氯化钠的含量为100g/l，实施例10中氯化钠的含量为50g/l，实施例11中的氯化钠的含量为250g/l，实施例12中的氯化钠的含量为10g/l。
59.对比例1
60.对比例1与实施例7的不同在于，透明质酸液体制剂中使用甘露醇、海藻糖各15g/l作为保护剂代替氯化钠。其他的反应条件与实施例1相同。
61.对比例2
62.对比例2与实施例7的不同在于，透明质酸液体制剂中使用柠檬酸钠代替氯化钠，其总量为30g/l。其他的反应条件与实施例1相同。
63.具体的各实施例和对比例的主要反应条件如表1所示。
64.表1各实施例和对比例的反应条件
65.[0066][0067]
实验例1
[0068]
测定分装后的透明质酸酶液体制剂在不同条件下的酶活稳定性，其中，液体制剂的酶活百分比用来表征透明质酸酶液体制剂在不同温度下的储存稳定性，指当将透明质酸酶液体制剂在不同温度条件下储存一定时间后，透明质酸酶活性与液体制剂中最初透明质酸酶活性的比值。
[0069]
具体的：将透明质酸酶液体制剂置于-20℃冷冻条件下，测定24月之后的酶活；将透明质酸酶液体置于25℃下，测定30天之后的酶活；将透明质酸酶液体置于40℃下，测定7天之后的酶活。
[0070]
其中，具体的酶活测定方法参照2020版《中国药典》第四部1207《玻璃酸酶测定法》执行。
[0071]
针对上述实施例和对比例得到的透明质酸酶的液体制剂的酶活测定结果如表2所示。
[0072]
表2透明质酸酶液体制剂的酶活稳定性
[0073][0074]
实验例2
[0075]
分别采用实施例7与对比例2的透明质酸酶制剂测定发酵液中透明质酸含量，具体测定方法参照cn202010547909.4(一种快速测定发酵液中透明质酸含量的方法)中实施例7描述的方法执行。测定一批次马链球菌兽疫亚种透明质酸发酵液中透明质酸含量，平行测定三次。测定结果为，透明质酸含量分别为6.75g/l；6.88g/l；6.84g/l；而对比例2的透明质酸酶制剂由于柠檬酸钠含量过高，会在232nm处产生较高量的吸收值，从而导致透明质酸无法测定。