基于引物设计和铜纳米簇的SARS-CoV-2德尔塔变异株检测方法

基于引物设计和铜纳米簇的sars-cov-2德尔塔变异株检测方法
技术领域
1.本发明属于生物传感器领域，具体涉及基于合理引物设计和铜纳米簇的sars-cov-2德尔塔变异株检测方法。


背景技术：

2.sars-cov-2是一类单链rna病毒，病毒粒子多呈圆形，有囊膜，外周有冠状排列的纤突，固因此而得名冠状病毒。病毒进入人体后首先和人体表面富含“血管紧张素转换酶2（ace2）受体的细胞结合，进而影响人的肺、心血管、肾脏，甚至是大脑。并且可以通过气溶胶进行人传人。虽然致死率比埃博拉、mers低，但是其传播性和致病性却很难攻克。目前世界卫生组织公布的值得关注的变异株就有阿尔法、贝塔、伽马、德尔塔，以及上个月在南非发现的奥密克戎。这些变异株无论是与细胞表面的结合能力，还是免疫逃逸、传染性等方面都在不断的变强。本研究检测的德尔塔变异株最早在2020年9月就有测序记录，经过一年多的变异，目前主要传播的德尔塔一代变异株有111种；二代变异株有30种；三代变异株有2种。目前检测新冠病毒的主要检测方法包括抗原、抗体检测，以及核酸检测。其中抗原检测检出率低；抗体检测操作便捷、检测迅速，但易出现“假阳性”和“假阴性”；核酸检测多用于早期诊断，灵敏度和特异性高，被认为是新冠检测的金标准。核酸检测包括病毒核酸特异基因检测和病毒基因组测序。
3.特异性基因检测可以通过恒温扩增技术和变温扩增技术实现，其中恒温扩增技术虽然降低了反应条件，但是易受气溶胶污染，假阳性率高，对检测环境要求高；而变温扩增技术虽然需要变温的pcr仪，但是能明显提高检测的特异性，并且普通的pcr仪是分子生物学实验室常备设备，因此基于变温扩增的检测方法也是易于实现的。其中，反转录荧光定量pcr（rt-pcr）被认为是最准确的检测方法之一，即为变温扩增技术。
4.pcr扩增结合双启动寡聚核苷酸引物（dual priming oligonucleotide, dpo）其扩增的特异性能够明显提升。而目前pcr产物的信号输出通常采用琼脂糖凝胶电泳、荧光染料、荧光探针、金纳米粒子、侧流层析等检测方法进行信号输出。上述方法不是操作步骤复杂，就是需要碱基修饰，提高检测复杂度和成本。因此，需要开发新的方法实现pcr产物的可视化检测。铜纳米簇（copper nanoclusters, cuncs）虽然可以以核酸为模板合成，但对核酸序列中碱基排布有要求。同时cuncs在紫外照射下能够发出红色荧光。因此，本技术提供一种sars-cov-2德尔塔变异株检测的方法，依赖dpo引物和at引物的结合，实现高特异性pcr扩增，并且pcr产物直接生成cuncs，实现靶标的特异性可视化检测。


技术实现要素：

5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一方面，构建一种sars-cov-2德尔塔变异株的检测方法，包括：（1）引物设计；（2）pcr扩增；（3）还原剂法生成铜纳米簇；（4）可视化检测；
所述引物设计包括dpo引物设计和at引物设计；所述pcr扩增，体系为1
×
supermix, 300~700 nm 引物和h2o；优选地，25 μl pcr扩增体系包括1
×
supermix, 600 nm 引物和补足ddh2o；所述还原剂法生成铜纳米簇，步骤为pcr 产物、cuso4、mops buffer和sa混合均匀，立即测定荧光；所述mops buffer是由10~20 mm mops, 100~200 mm nacl, ph 6~8组成；优选地，10 μl pcr 产物与10 μl 1 mm cuso4、 60 μl mops buffer（ph 7.6）和20 μl 10 mm sa混合，2min后测定荧光；所述可视化检测是指在紫外线照射的条件下cuncs呈现红色荧光。
6.所述dpo引物是由次黄嘌呤碱基链接的两段引物序列，两段引物序列与靶标序列互补，且5’端的碱基序列含有20~30 nt碱基，3’端的碱基序列的gc含量在40%~60%；优选地，dpo引物为r-1-down(dpo)-6i：cacaagtaaatgtaccatgcttaaiiiiiiactgacag (seq id no.15);所述at引物是由富at碱基的序列和特异性序列组成，5’端为富at碱基，3’端为与靶标序列互补的碱基;优选地，at引物为f-1-30at：atatatatatatatatatatatatatatatcttgtggacaacagcagacaac (seq id no.8)。
7.另一方面，一种含有dpo引物和at引物的sars-cov-2检测试剂盒。
8.所述dpo引物是由次黄嘌呤碱基链接的两段引物序列，两段引物序列与靶标序列互补，且5’端的碱基序列含有20~30 nt碱基，3’端的碱基序列的gc含量在40%~60%；优选地，dpo引物为r-1-down(dpo)-6i：cacaagtaaatgtaccatgcttaaiiiiiiactgacag (seq id no.15);所述at引物是由富at碱基的序列和特异性序列组成，5’端为富at碱基，3’端为与靶标序列互补的碱基;优选地，at引物为f-1-30at：atatatatatatatatatatatatatatatcttgtggacaacagcagacaac (seq id no.8)。
9.另一方面，一种含有铜纳米簇可视化sars-cov-2检测试剂盒。
10.所述铜纳米簇具体步骤为pcr 产物、cuso4、mops buffer和sa混合均匀，立即测定荧光；所述mops buffer是由10~20 mm mops, 100~200 mm nacl, ph 6~8组成；优选地，10 μl pcr 产物与10 μl 1 mm cuso4、 60 μl mops buffer（ph 7.6）和20 μl 10 mm sa混合，2min后测定荧光；所述可视化是指在紫外线照射的条件下cuncs呈现红色荧光。
11.另一方面，引物设计、检测方法在sars-cov-2或sars-cov-2德尔塔变异株检测方法、检测试剂以及试剂盒中的应用。
12.与现有技术相比，本发明的有益效果是：1. 本技术利用常规实验条件，借助pcr仪将dpo引物和at引物结合扩增，开发了一种sars-cov-2 德尔塔变异株的特异性、高灵敏、可视化检测新方法。
13.2．本技术中dpo 引物实现了单碱基缺失的snp检测，且具有高特异性，且首次将
dpo引物应用到sars-cov-2德尔塔检测。
14.3．本技术中at引物增加了pcr引物5’端的at碱基个数，促使pcr产物的at含量增加，使其适合于cuncs的模板要求，可以在2min内实现pcr产物的可视化检测。
15.4．本技术at引物还增加了反应的特异性，与dpo引物结合，增大了δct值。
16.5．本技术的可视化定量检出限达0.5pg/μl （约4拷贝/反应）， 50 ng/μl-0.5 pg/μl范围内， y=9.080*x + 74.28, r2=0.9893。
附图说明
17.图1 sars-cov-2 德尔塔变异菌株的快速检测方法。
18.图2 dpo引物检测sars-cov-2 德尔塔变异株的可行性。
19.图3 pcr产物的琼脂糖凝胶电泳结果. a是f-1 + r-1 和 f-1 + r-1-down (pt)的pcr扩增产物，b 是f-1 + r-1-down (dpo) 和f-2 + r-2的pcr扩增产物，c是f-2-up (pt) + r-2 and f-2-up (dpo) + r-2的pcr扩增产物。泳道1-3 是野生型sras-cov-2，泳道 4-6 是德尔塔变体, 泳道7-9 是阴性对照，泳道10-12是野生型sras-cov-2，泳道 13-15 是德尔塔变体, 泳道16-18 是阴性对照。
20.图4 退火温度优化。
21.图5 f-1和 r-1-down (dpo)引物浓度的优化。
22.图6 dpo引物3’端碱基个数优化。
23.图7 互补次黄嘌呤碱基个数的优化。
24.图8 非互补次黄嘌呤碱基个数的优化。
25.图9 at引物的优化。
26.图10 pcr产物的cuncs荧光。
27.图11 pcr产物cuncs生成条件优化。
28.图12 pcr产物cuncs的生成过程。
29.图13 检测方法的灵敏度和特异性。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1. 基于合理引物设计和铜纳米簇实现sars-cov-2 德尔塔变异株检测的设计原理为了更灵敏的检测新冠病毒的变异菌株，本研究基于引物设计和cuncs开发了一种sars-cov-2 德尔塔变异株的精准检测方法。其中引物设计包括pcr的上游引物和下游引物两部分。首先，为了提高检测的特异性，采用dpo引物进行突变位点的识别，其中dpo引物为聚次黄嘌呤连接的特异性引物，将单碱基缺失的突变位点设计在3’端，然后通过非特异性互补的次黄嘌呤连接引物5’端和3’端的互补碱基。同时，在5’端人为增加引物的at碱基含量，组建at引物以提高cuncs的荧光值，使其更易于可视化检测。根据sars-cov-2 德尔塔
变异株的单碱基缺失位点设计引物，后续用到的引物如表1所示。整个反应的过程如图1所示，即dpo引物与at引物对靶标进行pcr扩增，其pcr产物在还原剂存在的条件下即可生成cuncs，在紫外照射下即可出现红色荧光，实现可视化检测。需要注意的是根据新冠病毒传播特性、致病性和临床资料等信息，该病毒按照第二类病原微生物进行管理，对其检测实验室要求应符合生物安全三级及以上标准。实验条件和实验安全性的考虑，本技术采用假病毒的形式，替代真实样品。取sars-cov-2 delta变异株（genebank: ok091006.1）与sars-cov-2 （genebank: nc_045512.2 ）相同的部分序列，即在ofr 1ab基因的第5700碱基仅有一个c缺失的碱基为靶标序列。
32.表1 实验中用到的核酸序列注：“n”代表的是次黄嘌呤碱基（i）。
33.实施例2.实验可行性验证
采用pcr的方法，证明dpo引物区分野生型和单碱基缺失的德尔塔变异株的可行性。25 μl pcr反应体系包含 1
×
supermix, 600 nm 引物,和蒸馏水。扩增程序为93℃ 3 min；30循环95 ℃ 30 s， 65 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s。共分成6对引物：f-1和r-1、f-2和r-2、f-1和r-1-down(pt)、f-2-up（pt）和r-2、f-1和r-1-down(dpo)、f-2-up（dpo）和r-2。其中f-1和r-1、f-2和r-2是通过ncbi设计的普通pcr引物；f-1和r-1-down(pt)、f-2-up（pt）和r-2是普通引物，引物长度与f-1和r-1-down(dpo)、f-2-up（dpo）和r-2完全一致，只是后者中间部分是次黄嘌呤链接，而前者是与靶标完全互补的碱基链接。f-1和r-1-down(dpo)、f-2-up（dpo）和r-2两对引物的主要不同是突变位置设计不同，其中f-1和 r-1-down (dpo)的突变位点设计在下游引物的3’端，而f-2-up (dpo) 和 r-2的突变位点设计在上游引物的3’端。由图2a和2d可知普通引物在pcr扩增过程中很难区分野生型和突变型，而图2c和2f可知dpo引物可以区分单碱基缺失的突变菌株和野生菌株，并且图2b和2e不能明显区分野生型和突变型，因此可知dpo引物中的次黄嘌呤是提高特异性的主要原因。
34.实施例3 具体实验条件优化1.退火温度优化退火温度是实现特异性检测的关键因素，因此为了将上述现象更加明显的区分，同时对f-1和 r-1-down (dpo)、f-2-up (dpo) 和 r-2两对引物进行退火温度优化。结果如图3，3a-3f为f-1和 r-1-down (dpo)的退火温度优化的扩增曲线，由图可知随着温度的升高，检测方法的特异性越好；图4中4a-4f为f-2-up (dpo) 和 r-2的退火温度优化的扩增曲线，由图可知随着温度的升高，检测方法的特异性越好；而图3中3g、3h则展示了两对引物随温度变化δct值的变化。虽然f-2-up (dpo) 和 r-2的δct=9.3，大于f-1和 r-1-down (dpo)引物的δct=7.1，但是后续实验显示人工增加at序列也有利于δct的增加，且f-1和 r-1-down (dpo)引物更适合于纳米簇的合成，因此后续以f-1和 r-1-down (dpo)引物继续优化，且退火温度为65℃。
35.引物浓度优化f-1和 r-1-down (dpo)的引物浓度决定了扩增的灵敏度，因此选择0 μm、0.2 μm、0.3 μm、0.4 μm、0.5 μm、0.6 μm、0.7 μm的引物浓度进行扩增，由图5可以看出0.6 μm的浓度，扩增效果最好，因此后续选择0.6 μm的f-1和 r-1-down (dpo)引物进行继续优化。
36.实施例4 dpo引物优化1.dpo引物3’端碱基个数优化针对于dpo引物的设计，由于突变位点设计在3’端，因此首先要考虑3’端的碱基个数和gc含量。由下图6所示，首先设计了3条下游引物，与上游引物组成f-1 + r-1-down (dpo)-3’1, f-1 + r-1-down (dpo)-3’2, f-1 + r-1-down (dpo)三对引物。实时定量pcr的结果δct值显示f-1 + r-1-down (dpo)对引物的特异性区分更加明显。其中r-1-down (dpo)引物的3’端包含8个碱基，gc含量在50%，更适合于单碱基缺失碱基的识别。
37.次黄嘌呤碱基个数的优化次黄嘌呤碱基个数是dpo引物实现特异性识别的关键因素，因此对次黄嘌呤碱基个数进行优化。由于次黄嘌呤与碱基之间弱的相互作用，因此本研究采用两种方案对其碱基个数进行优化。第一种是设计次黄嘌呤碱基的个数与模板碱基个数完全互补，仅依靠弱氢键作用，实现3’端的高特异性识别，其结果见图7所示。由图可知，r-1-down (dpo)-6i的
扩增效果最好，δct=13.7。另外一种是固定3’端和5’端的碱基序列，依靠次黄嘌呤和空间位阻的效果进行实时荧光定量pcr，其结果见图8所示。由图可知，两种方案的趋势一致，6个连续的次黄嘌呤引物r-1-down (dpo)-6i和r-1-down (dpo)-poly6i的扩增效果较好。因此选择r-1-down (dpo)-6i引物继续后面的研究。
38.实施例4 at引物的优化通过上述dpo引物的优化，基本上能够区分单碱基缺失的德尔塔变异株的检测，但是必须依靠实时荧光定量pcr仪，不能实现可视化检测。同时cuncs能够以双链dna为模板在短时间内生成红色荧光。因此，希望将pcr产物作为模板生成cuncs荧光实现可视化检测。但是直接利用pcr产物生成cuncs的荧光值非常低（虽然引物设计的时候考虑到了at含量，达到了62%左右），不能实现肉眼识别。因此增加上游引物的at含量，提供cuncs的生成效率。由图9可知，at含量的增加不仅仅提高了cuncs的荧光，而且对于δct的增加也具有意想不到的促进作用。图10为具体的pcr产物生成的cuncs效果，随着上游引物at含量的增加，cuncs的荧光也逐渐增加；当at含量达到30个碱基时，pcr产物的at含量能够达到67%，即可大大增加cuncs的荧光值，提高信噪比。另一个原因可能是由于人工增加的at碱基为连续的碱基序列，中间没有其他碱基插入，因此更易于cuncs的生成。
39.实施例5 pcr产物cuncs生成条件优化为了优化pcr产物生成cuncs的条件，首先对cuso4和抗坏血酸钠（sodium ascorbate, sa）的浓度进行优化。10 μl pcr 产物与10 μl 1 mm cuso4、 60 μl mops buffer (10 mm mops, 150 mm nacl, ph 7.6)和20 μl 10 mm sa混合，2min后测定荧光。由图11可知，1 mm的cuso4更有利于cuncs的生成，这主要原因是cuso4作为cuncs的前体物质，因此浓度越高越有利于cuncs的生成；但是当浓度超过5 mm时则不利于cuncs的生成，主要原因是高浓度的cu
2+
会对核酸发生氧化损伤，进而降低核酸模板的浓度，从而不利于cuncs的生成。sa的浓度只要超过5 mm即可有效的生成cuncs，且随着sa浓度的怎能增加实现微弱的增加，但是增幅程度不明显，因此选择10 mm的sa作为后续实验浓度。同时，图12还反应了pcr产物在2 min内即可实现cuncs的生成，且在10 min内能够维持荧光信号的稳定。因此，能够满足pcr产物现场可视化的检测需求。
40.实施例6 灵敏度和特异性首先利用实时荧光定量pcr的方法进行灵敏度测定，由图13 a可知，该检测方法在50 ng/μl-50 fg/μl具有良好的线性关系,且定量检测线（loq）是50 fg/μl，线性关系为 y=-3.258*x + 13.97, r2=0.9860。进一步利用cuncs荧光进行灵敏度测试（图13 b），在50 ng/μl-0.5 pg/μl 的线性范围内，线性关系为y=9.080*x + 74.28, r2=0.9893, 且loq为 0.5 pg/μl。然后采用上述方法，分别对sars-cov-1、flua、mers和rhinovirus病毒进行检测，由图13c、13d所示，只有目标突变德尔塔病毒实现检测，因此证明本方法具有良好的特异性。
41.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。