同时检测EHNV、VNNV和RSIV的引物和探针组合的制作方法

同时检测ehnv、vnnv和rsiv的引物和探针组合
技术领域
1.本发明涉及一套同时检测ehnv、vnnv和rsiv的引物和探针组合，以及检测试剂盒，及其应用，属于病毒检测技术领域。


背景技术：

2.近年来，我国很多地区引进国外观赏鱼，而流行性造血器官坏死病毒(epizootic haematopietic necrosis virus，ehnv)、病毒性神经坏死病毒(viral nervous necrosis virus，vnnv)和真鲷虹彩病毒(red sea bream iridovirus，rsiv)作为鱼类重要传染病，被海关总署列为必须检疫的传染病。现有技术中的检测方法只能对这三种病毒进行单独的检测(普通pcr方法或荧光pcr方法)，需要分别提取各病毒的核酸，再分别进行检测，检测周期2～3天，不利于疫病的及时检出，也无法提高海关的效率和通关速度。


技术实现要素：

3.针对上述现有技术，为提高检测效率，本发明提供了一套同时检测ehnv、vnnv和rsiv的引物和探针组合，以及检测试剂盒，及其应用。本发明根据流行性造血器官坏死病毒、鱼类病毒性神经坏死病毒和真鲷虹彩病毒各自的基因保守区设计了特异性引物和探针，用荧光pcr技术在同一反应体系中对ehnv、vnnv和rsiv的核酸进行体外扩增检测，不仅提高了检测敏感度，而且也大大提高了检测效率，用4～5小时即可完成三种病毒的检测工作，加快了通过海关的速度。
4.本发明是通过以下技术方案实现的：
5.一套同时检测ehnv、vnnv和rsiv的引物和探针组合，包括：针对ehnv的两条特异性引物(正向引物和反向引物)和一条探针，针对vnnv的两条特异性引物和一条探针，针对rsiv的两条特异性引物和一条探针，具体如下：
6.针对vnnv的两条特异性引物和一条探针的核苷酸序列如下所示：
7.202106051347f1：5
’‑
ggacctcgtcgggaaaggag-3’，如seq id no.1所示；
8.202106051347r1：5
’‑
gacacagcactgacacgttga-3’，如seq id no.2所示；
9.202106051347p1：5
’‑
cgtcacctggtcggctgatactcctgt-3’，如seq id no.3所示；
10.针对ehnv的两条特异性引物和一条探针的核苷酸序列如下所示：
11.流行性造血器官坏死病毒f：5
’‑
caacctctcattcaacgacatca-3’，如seq id no.4所示；
12.流行性造血器官坏死病毒r：5
’‑
atcgctggtgttgcctatcat-3’，如seq id no.5所示；
13.流行性造血器官坏死病毒p：5
’‑
cacggcatacctggacgcctgg-3’，如seq id no.6所示；
14.针对rsiv的两条特异性引物和一条探针的核苷酸序列如下所示：
15.202106051347f2：5
’‑
ttgagcagtgcatctacacca-3’，如seq id no.7所示；
16.202106051347r2：5
’‑
gacaacatgacacccttgctg-3’，如seq id no.8所示；
17.202106051347p2：5
’‑
ttcgctgcttgccatcgcgtgtga-3’，如seq id no.9所示；
18.所述各条探针的3’端连接有荧光标记基团。
19.进一步地，所述荧光标记基团可选自fam、vic、cy5。
20.进一步地，所述三条探针的3’端连接的荧光标记基团不同，以方便区分；比如：针对ehnv的探针连接fam，针对vnnv的探针连接vic、针对rsiv的探针连接cy5。
21.所述同时检测ehnv、vnnv和rsiv的引物和探针组合在制备同时检测ehnv、vnnv和rsiv的检测试剂盒中的应用、在同时检测ehnv、vnnv和rsiv中的应用。
22.一种同时检测ehnv、vnnv和rsiv的检测试剂盒，包括上述同时检测ehnv、vnnv和rsiv的引物和探针组合，各引物和探针的浓度均为10pmol/l。
23.进一步地，还包括pcr扩增反应所需的试剂，如dntp、taq酶、ddh2o、缓冲液等。
24.所述同时检测ehnv、vnnv和rsiv的检测试剂盒在同时检测ehnv、vnnv和rsiv中的应用。
25.一种同时检测ehnv、vnnv和rsiv的检测方法，包括以下步骤：取待检测样品，提取基因组dna，加入上述同时检测ehnv、vnnv和rsiv的引物和探针组合或上述同时检测ehnv、vnnv和rsiv的检测试剂盒，进行实时荧光定量pcr扩增；pcr扩增后，检测相关荧光标记，若能检测到荧光信号，说明待检测样品中含有与该荧光标记相对应的病毒(比如检测ehnv的探针上连接有fam荧光标记基团，若检测到fam的荧光信号，则说明待检测样品中含有ehnv)。
26.进一步地，所述pcr扩增的反应体系为(以20μl计)：待检测样品的dna，2μl；6条特异性引物，各0.1μl；3条探针，各0.08μl；pcr反应缓冲液(butter)5μl；taq酶1μl，四种dntp，各0.5μl；ddh2o，余量。
27.进一步地，所述pcr扩增的反应程序为：42℃，20min；95℃、10min预变性；94℃变性15s，60℃退火延伸30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。
28.本发明根据流行性造血器官坏死病毒、鱼类病毒性神经坏死病毒和真鲷虹彩病毒的基因保守区设计特异性引物和探针，用荧光pcr技术在同一反应体系中对ehnv、vnnv和rsiv核酸进行体外扩增检测，不仅提高了检测敏感度，而且也大大提高了检测效率，用4～5小时即可完成三种疫病的检测工作，加快了通关速度。同时该方法与普通pcr方法相比还提高了检测敏感性。
29.本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
30.图1：荧光定量检测结果示意图(fam通道)。
31.图2：荧光定量检测结果示意图(vic通道)。
32.图3：荧光定量检测结果示意图(cy5通道)。
具体实施方式
33.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明
进行各种变化和修饰。
34.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
35.实施例1引物与探针的设计
36.根据流行性造血器官坏死病毒、鱼类病毒性神经坏死病毒和真鲷虹彩病毒的基因保守区设计特异性引物和探针，各条探针的3’端连接有荧光标记基团，具体为：针对ehnv的探针连接fam，针对vnnv的探针连接vic、针对rsiv的探针连接cy5。
37.三种病毒基因保守区序列如下所示：
38.vnnv：5
’‑
39.ccgacctcagtacacccgtacgctcctctggacctcgtcgggaaaggagcagcgtctcacgtcacctggtcggctgatactcctgtgtgttggcaacaacactgatgtggtcaacgtgtcagtgctgtgtcgctggagtgttcgactgagcgttccatctcttgaga-3’，如seq id no.10所示。
40.ehnv：5
’‑
41.tagcagccttgcaacctctcattcaacgacatcagcgcccagtcctttaacacggcatacctggacgcctggagcgagtacaccatgccagaggccaagcgcataggctactataacatgataggcaacaccagcgatgttgaacgtg-3’，如seq id no.11所示。
42.rsiv：5
’‑
43.ccttctttgagcgcccggtgcgcctcgagtttgagcagtgcatctacaccaagttcatcatcttcaccaagaaacgttatgtgtacagggcattcacacgcgatggcaagcagcgaacaggcagcaagggtgtcatgttgtccagacgcgacagcgccatgtgtgccagaaacacgtatgcggcaatcat-3’，如seq id no.12所示。
44.设计得到的特异性引物和探针的核苷酸序列如下所示：
45.针对vnnv的两条特异性引物和一条探针的核苷酸序列如下所示：
46.202106051347f1：5
’‑
ggacctcgtcgggaaaggag-3’，如seq id no.1所示；
47.202106051347r1：5
’‑
gacacagcactgacacgttga-3’，如seq id no.2所示；
48.202106051347p1：5
’‑
cgtcacctggtcggctgatactcctgt-3’，如seq id no.3所示
49.针对ehnv的两条特异性引物和一条探针的核苷酸序列如下所示：
50.流行性造血器官坏死病毒f：5
’‑
caacctctcattcaacgacatca-3’，如seq id no.4所示；
51.流行性造血器官坏死病毒r：5
’‑
atcgctggtgttgcctatcat-3’，如seq id no.5所示；
52.流行性造血器官坏死病毒p：5
’‑
cacggcatacctggacgcctgg-3’，如seq id no.6所示
53.针对rsiv的两条特异性引物和一条探针的核苷酸序列如下所示：
54.202106051347f2：5
’‑
ttgagcagtgcatctacacca-3’，如seq id no.7所示；
55.202106051347r2：5
’‑
gacaacatgacacccttgctg-3’，如seq id no.8所示；
56.202106051347p2：5
’‑
ttcgctgcttgccatcgcgtgtga-3’，如seq id no.9所示。
57.实施例2
58.同时检测ehnv、vnnv和rsiv，步骤如下：取待检测样品(含ehnv、vnnv和rsiv的样
品)，提取基因组dna，加入同时检测ehnv、vnnv和rsiv的引物和探针组合，进行实时荧光pcr扩增；pcr扩增后，检测相关荧光标记，若能检测到荧光信号，说明待检测样品中含有与该荧光标记相对应的病毒(比如检测ehnv的探针上连接有fam荧光标记基团，若检测到fam的荧光信号，则说明待检测样品中含有ehnv)。
59.所述pcr扩增的反应体系为(以20μl计)：待检测样品的dna，2μl；6条特异性引物，各0.1μl；3条探针，各0.08μl；pcr反应缓冲液(butter)5μl；taq酶1μl，四种dntp，各0.5μl；ddh2o，余量。
60.所述pcr扩增的反应程序为：42℃，20min；95℃、10min预变性；94℃变性15s，60℃退火延伸30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。
61.以202106051347g1为阳模，检测敏感性，结果如表1所示，能检测到10-9
模板的病毒。
62.202106051347g1：5
’‑
63.ccgacctcagtacacccgtacgctcctctggacctcgtcgggaaaggagcagcgtctcacgtcacctggtcggctgatactcctgtgtgttggcaacaacactgatgtggtcaacgtgtcagtgctgtgtcgctggagtgttcgactgagcgttccatctcttgagatagcagccttgcaacctctcattcaacgacatcagcgcccagtcctttaacacggcatacctggacgcctggagcgagtacaccatgccagaggccaagcgcataggctactataacatgataggcaacaccagcgatgttgaacgtgccttctttgagcgcccggtgcgcctcgagtttgagcagtgcatctacaccaagttcatcatcttcaccaagaaacgttatgtgtacagggcattcacacgcgatggcaagcagcgaacaggcagcaagggtgtcatgttgtccagacgcgacagcgccatgtgtgccagaaacacgtatgcggcaatcatatagtagggaggattaaatcagcctattcagacgaaaatgacctagtggaggaactcattgactctaggaccgtcagtaagagcaaagagactaacctggaccaccttattaaggaattggctgatatgcggaggggggagttccgctcaatcactctaggaacgggtgccggaaaaacgacagaacttcccagacaatacctcaccacagtgggtgcccataagtc-3’，如seq id no.13所示。
64.表1
[0065] 678a阳模10-5
阳模10-5
阳模10-5
b阳模10-6
阳模10-6
阳模10-6
c阳模10-7
阳模10-7
阳模10-7
d阳模10-8
阳模10-8
阳模10-8
e阳模10-9
阳模10-9
阳模10-9
fntcntcntcgntcntcntchntcntcntc
[0066]
荧光定量结果如图1、2、3所示。结果表明：各通道扩增曲线良好，ntc无翘尾，真鲷虹彩病毒病rsiv、鱼类病毒性神经坏死病vnn、流行性造血器官坏死病毒ehnv三重荧光定量验证通过，可转至生产。
[0067]
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。