一种食源性致病菌洗脱方法

1.本发明涉及食品安全领域，尤其涉及一种食源性致病菌的高效洗脱获取方法。


背景技术：

2.随着社会的发展，营养均衡的观念逐渐深入人心，低脂、低热量、高膳食纤维的蔬菜广受关注，其中可鲜食蔬菜能最大程度的保留营养成分，而且菜肴制作简单，也越来越受青睐。生菜、苦菊、甘蓝、黄瓜、辣椒、洋葱、胡萝卜、香菜、罗勒、葱等蔬菜，不管是传统还是现代饮食都会存在不加热烹饪直接鲜食的情况，随着东西方文化的融合越来越多的鲜食蔬菜会融入现代生活。但对于鲜食蔬菜而言，不加热处理就有可能让食源性致病菌有可乘之机，危害人们健康。
3.传统的食源性致病菌检测方法均基于培养法，需要经过增菌、选择性培养基培养、生化鉴定等一系列的操作，往往需要4-7天，存在耗时长，且只能检测样品中存活的缺陷，对于高流通与高周转的鲜食蔬菜来说，存在较大的局限性；此外，快速检测方法的研究也一直是人们关注的热点，但现在的快速检测方法大多重视后端的检测，对于前端的致病菌洗脱等环节较少关注，如果在前端无法从复杂的样品中得到检测目标菌，则极易出现假阴性结果，其后的检测步骤无论多么灵敏都无济于事，会危害广大消费者安全。
4.因此迫切需要改进和提高即食蔬菜致病菌检测方法，实现无需增菌过程的快速检测，有效降低检测的假阴性率。


技术实现要素：

5.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是前端无法从复杂的样品中得到检测目标菌，传统检测存在增菌过程耗时长的缺陷，本发明提供一种食源性致病菌洗脱方法，无需采取耗时的培养增菌方法，让食品污染到的食源性致病菌尽可能被洗脱下来，配合后续的检测方法，实现无需增菌的快速检测。
6.为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
7.一种食源性致病菌洗脱方法，包括以下步骤：
8.步骤1、配制洗脱液；
9.步骤2、洗脱液与样品按比例混合，放入无菌容器中孵育，收集洗脱液，作为待测液。
10.所述步骤1包括以下步骤：
11.步骤1.1、配制1-100mm tris
·
hcl缓冲溶液作为基础缓冲液；
12.步骤1.2、在步骤1.1的基础缓冲液中加入蛋白胨、nacl、表面活性剂吐温20，121℃灭菌15min；
13.步骤1.3、使用前加入用0.22μm的无菌滤膜过滤的纤维素酶溶液；
14.优选的，tris
·
hcl缓冲溶液ph值为ph9～11。
15.优选的，蛋白胨添加量为0.005％-1％，nacl添加量为0～3％，表面活性剂吐温20
添加量0～0.5％。
16.优选的，纤维素酶溶液加入洗脱液后的终浓度为100～500u/l。
17.优选的，步骤1.2配制的洗脱液，可以配成10
×
～50
×
的母液，121℃灭菌15min后保存，在使用前稀释成工作液。
18.优选的，步骤2洗脱液与样品按质量比9：1的比例放入带滤网的容器中混合。
19.优选的，样品质量为10～25g。
20.优选的，孵育时间为室温下10～60min。
21.进一步，优选的，步骤2还包括将孵育后的带滤网的无菌均质袋中摇晃30min，放入拍打式均质机拍打均质2min，拍打后取滤网另一侧溶液作为待测液。
22.本发明的优点是：
23.1、可以通过简单的处理，高效的从蔬菜中洗脱被污染的食源性致病菌；
24.2、无需增菌，可以保证食物样品中食源性致病菌检测的快速性；
25.3、具有普适性，可以针对各种食源性致病菌进行前端洗脱。
附图说明
26.图1是本发明对沙门氏菌的洗脱效果比较图；
27.图2是本发明对单核细胞增生李斯特菌的洗脱效果比较图；
28.图3是本发明对金黄色葡萄球菌的洗脱效果比较图。
具体实施方式
29.以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。
30.本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
31.实施例1：对生菜中污染的沙门氏菌进行洗脱收集
32.将25g生菜人工污染沙门氏菌(atcc13076，经过人工诱导处理具有利福平抗性)，污染量为105cfu/g，在超净台中风干后储藏在4℃冰箱中储存1天，以此作为污染有沙门氏菌的生菜样品。
33.配置10mm tris
·
hcl(ph9.5)缓冲液，分别包含0.9％nacl、0.01％蛋白胨、300u/l纤维素酶等。
34.将生菜加入到带有滤网的无菌均质袋中，加入225ml洗脱液，摇晃30min，从滤膜另一侧倒出洗脱液。取洗脱液在添加了100μg/ml利福平的lb固体培养基上37℃涂板计数。
35.同时，取同样处理的样品(除均质袋为无滤网均质袋，其他条件相同)，用均质机高速打碎匀浆，取相同体积溶液进行涂板计数，作为阳性对照。
36.取同批次生菜样品，均质后直接在利福平抗性平板涂布计数，如果有菌落生长则实验无效，反之实验数据有效。
37.如附图1中所示，1：10mm pbs缓冲液(ph7.2)洗脱；2：10mm柠檬酸缓冲液(ph4.5)洗脱；3：10mm tris
·
hcl缓冲溶液(ph9.5)洗脱；4：含0.01％蛋白胨的10mm tris
·
hcl缓冲溶液(ph9.5)洗脱；5：含0.9％nacl的10mm tris
·
hcl缓冲溶液(ph9.5)洗脱；6：含300u/l纤维
素酶的10mm tris
·
hcl缓冲溶液(ph9.5)洗脱。
38.结果显示，tris
·
hcl缓冲溶液(ph9.5)、pbs缓冲液(ph7.2)、柠檬酸缓冲液(ph4.5)洗脱人工污染沙门氏菌的生菜洗脱率为41％、53％以及64％，显然，碱性的tris
·
hcl缓冲溶液具有较好的洗脱效果。
39.故选用tris
·
hcl缓冲溶液(ph9.5)作为基础缓冲液。在此基础上分别添加0.01％蛋白胨、0.9％nacl、300u/l纤维素酶，洗脱效果分别为82％、78％和84％，显然蛋白胨、nacl、纤维素酶的添加都会提高对于沙门氏菌的洗脱效率。
40.实施例2：对香菜中污染的单核细胞增生李斯特菌进行高效洗脱
41.将10g香菜人工污染单核细胞增生李斯特菌egdev(经过人工诱导处理具有利福平抗性)，污染量约为105cfu/g。在超净台中风干后储藏在4℃冰箱中储存1天，以此作为污染有沙门氏菌的香菜样品。
42.从100m tris
·
hcl(ph9.5)缓冲液包含0.1％蛋白胨的母液中取100ml十倍稀释，调节ph为9.5，最终补足体积到1000ml，配置好后121℃灭菌15min。冷却后加入0.22μm无菌滤膜过滤的纤维素酶，最终的纤维素酶浓度为300u/l。冰箱冷藏保存，以此作为洗脱液。纤维素酶使用时加入，加入之后当天使用。
43.将10g香菜加入到带有滤网的无菌均质袋中，加入90ml洗脱液。摇晃30min后，用拍打式均质机拍打均质2min。从滤膜另一侧倒出洗脱液，取洗脱液在添加了100μg/ml利福平的bhi固体培养基上37℃涂板计数。
44.同时，取同样处理的样品(除均质袋为无滤网均质袋，其他条件相同)，用均质机高速打碎匀浆，取相同体积溶液也进行涂板计数，作为阳性对照。
45.取同批次香菜样品，均质后直接在利福平抗性平板涂布计数，如果有菌落生长则实验无效，反之实验数据有效。
46.此外，为了对比本发明确实具有良好的洗脱效果，同时和其他几种洗脱方法进行比较。
47.如附图2所示1：10mm tris
·
hcl缓冲溶液(ph9.5)洗脱；2；10mm pbs缓冲液(ph7.2)洗脱；3：10mm柠檬酸缓冲液(ph4.5)洗脱；4：本发明混合缓冲液洗脱；5：商品化0.01％蛋白胨拍打均质；6:本发明缓冲液混合洗脱后拍打均质。
48.结果显示，tris
·
hcl缓冲溶液(ph9.5)、pbs缓冲液(ph7.2)、柠檬酸缓冲液(ph4.5)三种缓冲溶液直接洗脱相比，碱性ph9.5有最好的洗脱效果，而常见的pbs缓冲溶液效果较差(只有27％)。
49.用蛋白胨水直接拍打均质进行致病菌的洗脱也是一种常见的洗脱方式，经过对比洗脱率约为88％，低于本发明中直接用混合液洗脱的效果(洗脱率93％，p《0.05)，即在没有拍打均质机的情况下，用本发明的洗脱液直接洗脱就可以达到超过一般添加蛋白胨水拍打均质的洗脱效果。
50.经过本发明的混合洗脱液洗脱之后，再均质拍打可以达到约100％的回收率，即达到最高效的洗脱效果。
51.实施例3：对生菜中污染的金黄色葡萄球菌进行高效洗脱
52.将10g生菜人工污染金黄色葡萄球菌(atcc29213，经过人工诱导处理具有利福平抗性)，污染量约为105cfu/g。在超净台中风干后储藏在4℃冰箱中储存1天，以此作为污染
有金黄色葡萄球菌的生菜样品。
53.从100m tris
·
hcl(ph9.5)缓冲液包含0.1％蛋白胨的母液中取100ml十倍稀释，调节ph为9.5，最终补足体积到1000ml，配置好后121℃灭菌15min。冷却后加入0.22μm无菌滤膜过滤的纤维素酶，最终的纤维素酶浓度为300u/l。冰箱冷藏保存，以此作为洗脱液。纤维素酶使用时加入，加入之后当天使用。
54.将10g生菜加入到带有滤网的无菌均质袋中，加入90ml洗脱液。摇晃30min后，用拍打式均质机拍打均质2min。从滤膜另一侧倒出洗脱液，取洗脱液在添加了100μg/ml利福平的tsb固体培养基上37℃涂板计数。
55.同时，取同样处理的样品(除均质袋为无滤网均质袋，其他条件相同)，用均质机高速打碎匀浆，取相同体积溶液也进行涂板计数，作为阳性对照。
56.取同批次生菜样品，均质后直接在利福平抗性平板涂布计数，如果有菌落生长则实验无效，反之实验数据有效。此外，为了对比本发明确实具有良好的洗脱效果，同时和其他几种洗脱方法进行比较。
57.如附图3所示，1：纯水洗脱；2：10mm pbs缓冲液(ph7.2)洗脱；3:10mm tris
·
hcl缓冲溶液(ph9.5)洗脱；4：含0.01％甘氨酸的10mm tris
·
hcl缓冲溶液(ph9.5)洗脱；5：含0.01％蛋白胨的10mm tris
·
hcl缓冲溶液(ph9.5)洗脱；6：商品化0.01％蛋白胨水洗脱；7:商品化0.01％蛋白胨水洗脱后拍打均质；8:本发明缓冲液混合洗脱后拍打均质。
58.结果显示，用常见的pbs缓冲液(ph7.2)洗脱污染了生菜的金黄色葡萄球菌，洗脱率只有59％，甚至不如直接用纯水进行洗涤(洗脱率为68％)。而用ph9.5的tris
·
hcl洗脱进行洗脱，洗脱率可以提高到81％。
59.此外，tris
·
hcl缓冲液添加了0.01％甘氨酸并没有提高洗脱率(p》0.05)，而添加蛋白胨(0.01％)洗脱率可以提高到85％(p《0.05)。用商品化0.01％蛋白胨水拍打均质以及混合孵育后拍打均质洗脱效率为90％和92％，而用本发明的混合液混合孵育后拍打均质洗脱率可以达到100％。即使在没有拍打均质机的情况下，直接用本发明的混合洗脱液混合洗脱，洗脱率(94％)也高于蛋白胨水混合孵育后拍打均质的洗脱率。
60.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。