一种降低发酵生产S-ABA杂质的工艺方法与流程

一种降低发酵生产s-aba杂质的工艺方法
技术领域
1.本发明涉及一种生产s-诱抗素的发酵方法，具体的涉及一种降低发酵生产s-aba杂质的工艺方法。


背景技术：

2.s-诱抗素(天然型-aba)是具有重要生理活性的国际公认的五大类植物内源生长调节物质之一，是植物的“抗逆诱导剂”。它可启动植物体本身对逆境的抵抗或适应机制，提高植物的抗旱、抗寒、抗病和抗盐碱能力，减少农药施用量，维持作物在非正常气候、土壤条件下的生存能力并获得好收成，其应用领域涉及农产品的品质与安全性、生态建设、绿色环保等政府与百姓、乃至全球均普遍关注的领域。其作为一类非常重要的植物激素，将会在农业生产中发挥其应有的作用和价值。
3.由于结构上的特殊性，s-诱抗素的来源一直是世界难题，人工合成的外消旋型脱落酸是天然型-aba与非天然型aba的混合物，单纯的天然型脱落酸生产成本极高，昂贵的价格导致s-诱抗素的应用困难。上世界70-90年代，发现通过真菌能产生天然型-aba，90年代后日本东丽公司开始aba工业化生产开发研究，其报道的最高产量达到0.8g/l培养基。中国科学院成都生物研究所于上世纪90年代也进行了大量的菌种筛选工作，利用其菌种脱落酸产量达到1.0/l发酵液。
4.因其在植物体内的重要作用及在农业生产中巨大的应用前景，2000年，本发明人开始天然脱落酸生产技术的产业化研究。现有的5种化学合成路径与目前发明人的液体发酵法生产s-诱抗素对比，发酵法生产s-诱抗素具有全球领先的技术。发明人拥有的发酵法生产s-诱抗素发酵水平高，提取工艺简单，一次性收率高，制剂效果显著，属世界领先水平。与其他国内其他原药产品相比，福生公司原药产品纯度高(95％)，杂质含量低，晶体均一流动性好。
5.但在现有发酵法生产工艺下，通过产品检测，发现产品特征杂质共1种，纯度占比0.1％，发明人通过逐步研究发明一种可以有效降低发酵过程中杂质产生数量的方法。
6.申请内容
7.为了克服现有技术的不足，本发明提供一种可以有效降低发酵过程中杂质产生数量的方法。
8.本发明提供一种降低发酵生产s-aba杂质的工艺方法，其中s-aba发酵工艺包括以下步骤：
9.1)将种子液在种子培养基中培养得到种子培养液；所述种子培养基的有效成分选自碳源、有机氮源、天然油脂、多元醇、微量元素中的一种或多种；
10.2)将所述种子培养液在发酵培养基中进行发酵培养得到发酵液；所述发酵培养基的有效成分为碳源、有机氮源、无机磷酸盐或多元醇中的一种或多种；
11.3)在步骤2)的发酵过程中梯度降低发酵过程中的通气量。
12.优选地，本发明采用的菌种为：灰葡萄孢霉菌，菌种来源为中科院成都生物所。
13.优选的，梯度降低发酵过程中的通气量以如下方式进行：发酵周期为18天，在发酵第3天、第5天、第8天、第11天、第14天、第17天调整通气量为原通气量的80-90％。
14.更优选的，梯度降低发酵过程中的通气量以如下方式进行：发酵周期为18天，在发酵第3天、第5天、第8天、第11天、第14天、第17天调整通气量为原通气量85.6％。
15.优选的，初始通气量为1500-1800nm3/h。
16.本发明发酵方法采用的菌种为灰葡萄孢霉菌。
17.本发明的种子液在第一培养基中培养70-85h，得到种子培养液。
18.本发明的s-aba发酵工艺中控制第二培养基的ph值在4.0-7.0。
19.本发明的s-aba发酵工艺发酵步骤是在发酵罐中进行，罐中发酵温度在20-40℃，s-aba发酵工艺中通入的气流为压缩空气，压力为0.15-0.24mpa。
20.通过本发明的方法，s-aba发酵工艺中未经纯化工艺的s-aba产品中杂质含量在5％以下，优选的达到杂质含量在3％以下。
21.本发明的方法还包括发酵液进行灭菌、冷却的步骤。
22.本发明的种子培养在种子罐中进行，发酵是在发酵罐中进行。
23.本发明采用的培养基具体如下：
24.种子培养基：大豆粉或麦麸或玉米蛋白粉一种或多种(氮源)、乳糖、葡萄糖、环糊精、糊精、淀粉、甘油等(碳源)一种或多种、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸钠、硫酸亚铁中的一种或多种无机盐、维生素va、vb、vc等、菜籽油、大豆油、玉米胚芽油、橄榄油一种或多种。
25.发酵培养基：大豆粉、大豆蛋白粉、玉米蛋白粉一种或多种(氮源)、糊精、葡萄糖、淀粉、环糊精、甘油等一种或多种(碳源)、无机盐(硫酸盐、磷酸盐)、菜籽油、大豆油、玉米胚芽油、橄榄油一种或多种。
26.本发明主要通过调整s-aba发酵过程中通气量，通过该方式有效降低杂质含量、减少后续纯化提取过程的除杂难度，降低成本，有效减少发酵过程中特征杂质的产生的方法。s-aba纯品特征杂质种类、成品中杂质的纯度占比低。
附图说明
27.图1s-诱抗素原药试样hplc图谱，1为s-aba
具体实施方式
28.下面通过具体实施方式来进一步说明本技术的技术方案，但不构成对本技术的任何限制。
29.1、实施例
30.s-aba发酵工艺包括以下步骤：
31.1)将种子液在第一种子罐中进行培养，第一种子培养基为：
32.组分含量(重量比)葡萄糖2麦麸15色拉油7甘油2
乙酸钠2硫酸镁0.5
33.然后转入第二种子罐中继续进行培养得到种子培养液，第二种子培养基为：
34.组分含量(重量比)葡萄糖2麦麸15色拉油1甘油2硫酸锰1丙酮酸钠4
35.2)将所述种子培养液转入事先配料、灭菌、冷却后的发酵罐中在第二培养基中进行发酵培养得到发酵液；所述发酵培养基为：
[0036][0037][0038]
发酵培养过程中按照下表工艺控制ph、通气量(压缩空气)、温度等工艺参数(参考申请人的专利cn106906250a)，以达到代谢诱抗素的目的，然后完成发酵、灭活下罐。
[0039]
序号工艺控制项一级种子罐二级种子罐发酵罐1温度(℃)2929312罐压(mpa)0.040.040.043ph3.23.24.0
±
0.14溶氧(％)///7空气管压力(mpa)0.240.240.248空气流量(nm3/h)2845028009基础体积(l)52032003000010发酵周期52h25h20天
[0040]
发酵步骤中第1-18天的空气流量配置如下:
[0041][0042][0043]
采用的菌种灰葡萄孢霉菌，菌种来源为中科院成都生物所。
[0044]
诱抗素及杂质检测方法：
[0045]
液相色谱法：本鉴别试验可与s-诱抗素质量分数的测定同时进行。在相同的液相色谱条件下，试样溶液中某一色谱峰的保留时间与标样溶液中s-诱抗素色谱峰的保留时间，其相对差值应在1.5％以内。
[0046]
s-诱抗素质量分数
[0047]
1.方法提要
[0048]
试样用甲醇溶解，以甲醇+水(ph＝3)为流动相，以eclipse xdb-c18 3.5μ为填充物的不锈钢柱和紫外(uv)检测器，在254nm处对试样中的s-诱抗素进行高效液相色谱分离和测定。
[0049]
2.试样和溶液
[0050]
·
甲醇：色谱纯；
[0051]
·
s-诱抗素标准品：质量分数≥98％；
[0052]
·
流动相：φ(甲醇：水)＝5：5(v：v)，用磷酸调ph至3。
[0053]
3.仪器
[0054]
·
高压液相色谱仪：带可调波长紫外检测器；
[0055]
·
色谱柱：150mm
×
4.6mm c18不锈钢柱；
[0056]
·
柱填充物：c18；
[0057]
·
微量注射器：25μl。
[0058]
4.高压液相色谱操作条件
[0059]
·
柱温：30℃；
[0060]
·
流动相流速：1.5ml/min；
[0061]
·
检测波长：254nm；
[0062]
·
进样量：10μl；
[0063]
·
保留时间：8.65min；
[0064]
上述操作条件，系典型操作条件，可根据不同的仪器的特点，对给定操作参数作适当调整，以获最佳效果。
[0065]
5.测定步骤
[0066]
标样溶液的配制
[0067]
称取0.02g s-诱抗素的标样(精确至0.0001g)于50ml容量瓶中，用甲醇：水＝50：50的溶液溶解并定容至刻度，摇匀，用0.45μm孔径过滤器过滤，收集滤液备用。
[0068]
试样溶液的配制
[0069]
称取90％s-诱抗素原药的试样0.022g(精确至0.0001g)于50ml容量瓶中，用甲醇：水＝50：50的溶液溶解并定容至刻度，摇匀，用0.45μm孔径过滤器过滤，收集滤液备用。
[0070]
测定
[0071]
在上述操作条件下，待仪器基线基本稳定后，连续注入数针标样溶液，计算各针相对响应值的重复性，待相邻两针的相对响应值变化小于1.0％为止。然后按下列顺序进行液相色谱分析：标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液。
[0072]
计算
[0073]
将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中s-诱抗素峰面积(或峰高)，分别进行平均。
[0074]
试样中s-诱抗素的质量分数w1(％)，按式(1)计算：
[0075][0076]
式中：
[0077]
r1—标样溶液中，s-诱抗素峰面积的平均值；
[0078]
r2—试样溶液中，s-诱抗素峰面积的平均值；
[0079]
m1—s-诱抗素标样的质量，单位为克(g)；
[0080]
m2—试样的质量，单位为克(g)；
[0081]
p—标样中s-诱抗素的质量分数，数值以％表示。
[0082]
允许差
[0083]
两次平行测定的结果相对偏差应不大于1.5％，取其算数平均值，作为测定结果。
[0084]
2、对比例
[0085]
整个原料以及工艺参数与实施例相同，区别在于未采用梯度通气方式，通气量为1796nm3/h。
[0086]
对其实施例和对比例制备s-aba杂质含量进行检测结果如下：
[0087][0088][0089]
可以发现通过本发明的改变通气量的方法，各阶段s-aba产物的杂质均偏低，最终杂质含量约为改善前通气量的11.4％，同比降低88.57％。