一种制备双链RNA的方法

一种制备双链rna的方法
技术领域
1.本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种制备双链rna的方法。


背景技术：

2.双链rna（dsrna）结构在自然界中普遍存在，其常作为长链rna，如核糖体rna（rrna）、信使rna（mrna）以及类病毒（一种仅由rna组成的病毒）等的一小部分。长度为几百~几千个碱基对的长双链rna，如pre-mirna（其由mrna的一部分和与其互补的rna链组成）和双链rna病毒等也被发现广泛存在。其中最有前景的应用之一是以小干扰rna（small interfering rnas，sirnas）为工具来发挥作用的rna干扰（rna interference, rnai）技术，其是用于转录后基因调控的有力工具（nature genet,2002,32,107-108；embo j,2001,20,6877-6888；proc natl acad sci usa,2002,99,9942-9947.）。近年来rnai技术被尝试应用于农业（病虫害防治）（insect sci,2013,20,4-14；pest manag sci,2016,72,801-809）和水产养殖业（虾病防治）（j biotechnol,2020,321,48-56；j virol methods,2013,188,64-69；iop conf ser earth environ sci,2020,584,012051.）中。但目前dsrna的大量、高效合成尚未实现，这在很大程度上制约了rnai农（渔）药、rnai疫苗的推广使用。因此，亟需建立一种可满足dsrna高效、低成本、简易制备的方法，以满足科研需求和市场需求。
3.dsrna在体内/外均可制备（anal bioanal chem,2018,410,3239-3252）。体内制备（重组过表达）时需要先将用于转录的模板重组到质粒载体当中，然后将其导入大肠杆菌（e.coli）（j. biotechnol,2020,321,48-56；j virol methods,2013,188,64-69；iop conf.ser.earth environ sci,2020,584,012051.）、植物细胞（uk patent,no.wo2020183416-a1,sep17,2020）或哺乳动物细胞（methods mol biol,2013,942,291-314.）中进行诱导培养。整个过程需经历表达载体构建、转染、细胞培养、裂解、产物提取纯化（需去除宿主自身的rrna等杂质）等诸多步骤，较为繁琐；并且胞内机质复杂，产物易被核酸酶降解的同时生物安全性也难以保证。目前这些体内制备技术尚处于研究阶段，未被用于实际生产。
4.体外制备方法可分为化学合成和酶法合成（转录）两大类。化学合成法（固相合成）存在合成步骤繁琐（embo j,2001,20,6877-6888；nat struct biol,1998,5,203-212；isr j chem,2013,53,326-349）、产物纯度较差（anal biochem,2001,298,196-206；chin j biotech,2018,34,664）、难以实现大量合成、生物安全性较差（使用多种有机试剂）（chin j biotech,2018,34,664）等诸多缺陷。相较化学合成而言，酶法因在液相环境中进行而更易于实现大规模生产，且由于在整个过程中没有涉及到有害有机试剂，因此产品的安全性更好（isr j chem,2013,53,326-349；chimia,2005,59,812-816）。近些年的研究还表明酶法可满足带修饰rna的合成，发展前景良好（org biomol chem,2018,16,5800-5807；molecules,2020,25,5492）。按照模板为线性还是环状，现有dsrna酶法合成方法可分为线性转录和滚环转录。线性转录可分为两种情况，一种是用两种线性双链dna模板分别转录出sense链和antisense链，然后退火杂交获得dsrna（nucleic acids res,2002,30,e46；
nucleic acids res,2003,31,e38）；另一种是直接用含有回文序列的线性双链dna模板制备得到同时含有sense序列和antisense序列的发卡型结构的rna，再由体内的dicer酶加工处理得到目标sirna（mol biotechnol,2017,59,73-83）。上述两种方法中所用到的线性双链dna模板中均包含启动子序列，且为了能高效起始转录，有些模板中启动子下游的最初两个碱基须为gg，要想得到精确的产物，后续需酶切去除多余转录出的cc（nucleic acids res,2003,31,e38）。由此可见上述线性转录法均较繁琐，且效率低下，难以满足实际应用需求。相较线性转录而言，滚环转录的效率要高出许多。现有滚环转录法也可分为两类。一类是直接用一个环状单链dna（哑铃环（oligonucleotides,2006,16,353-363）或“y”型单环（nano lett,2018,18,4279-4284））同时转录出sense序列和antisense序列。这种方法虽较简便，但需对模板进行加长设计，这样就会额外转录出无用序列，需后续纯化。还有一类是用两种环状单链dna分别转录出sense序列和antisense序列，再退火杂交得到目的dsrna（sci rep,2017,7,10005；adv sci (weinh),2017,4,1600523）。采用这种方法时，由于环状单链dna的转录效率易受模板序列和自身二级结构的影响（j am chem soc,1995,117,7818-7819；proc natl acad sci usa,2002,99,54-59；nucl acids res,2013,41,2552-2564；nucl acids res,2014,42,10596-10604；science advance today,2015,25226.），可能会发生不对称转录（一个环状单链dna转录效率高，一个转录效率低），使得产物为dsrna和ssrna（单链rna）的混合物。由此可见现有方法均难以实现dsrna的大量、高效合成。


技术实现要素：

5.针对现有双链rna制备方法步骤繁琐、效率低、成本高昂且难以实现大量制备的问题，本发明提供了一种制备双链rna的方法，针对要制备的双链rna，先设计一个含有5-15bp泡状结构（bubble）的、无启动子的环状双链dna模板；然后在体系中同时加入上述环状双链dna模板、rna聚合酶、核糖核酸酶h、ntps、rna酶抑制剂、无机焦磷酸酶进行转录。在转录过程中rna聚合酶进行无偏好性的高效双向滚环转录，rnase h则在该模板中泡状结构处未杂交的dna部分的辅助下及时实现对转录产物的酶切。在rna聚合酶、核糖核酸酶h和含泡状结构无启动子环状双链dna模板三者之间的默契配合下实现了目的双链rna产物的一步、高效、大量制备。该方法非常简便高效，低成本，可操作性较强，适用于工业化大规模生产。
6.本发明采用的技术方案如下：一种制备双链rna的方法，包括以下步骤：步骤一，设计并制备环状双链dna模板，所述环状双链dna模板含有不互补的泡状结构部分和互补部分，不含启动子序列，所述互补部分与要制备的双链rna长度相同且序列相同，序列中t对应u，所述泡状结构处于环状双链dna模板中互补部分的两端，泡状结构的长度为5-15bp，泡状结构的两条链之间连续互补的碱基不超过2个；步骤二，将制备的环状双链dna模板纯化，去除环状双链dna模板中混杂着的线性单链dna；步骤三，将纯化的环状双链dna模板、rna聚合酶、核糖核酸酶h、ntps、rna酶抑制剂、无机焦磷酸酶和相应的rna聚合酶缓冲液混合，进行转录，所述rna聚合酶为 t7 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶或者t3 rna聚合酶，在转录过程中rna聚合酶进行无偏好性的高效双向滚环转录，核糖核酸酶h则在环状双链dna模板中泡状结构处单链dna的辅助下及时实现
对含有重复序列的转录产物的酶切，获得满足要求的目的双链rna单体。
7.泡状结构的上、下链的序列相同或不同均可。泡状结构处的上、下链中均应避免形成发卡结构或polya、polyt等序列。
8.泡状结构尺寸应在5-15碱基之间，否则会导致双链rna的产量降低。
9.不考虑环状双链dna模板制备的难易程度，所述本发明可制备的双链rna产物单体的长度为70bp以上；优选70-1000bp，再优选为90-437bp，更优选为96-278bp。
10.进一步的，当所述环状双链dna模板长度小于90bp时，采用一段法，设计一条成环前体线性链制备环状单链dna，环状单链dna和线性单链dna退火杂交后加入dna连接酶和对应的连接酶缓冲液进行连接反应；当所述环状双链dna模板长度大于90bp时，采用一锅法或分步法制备环状单链dna，然后将环状单链dna和其互补链所对应的多条短dna链混合，退火杂交后加入dna连接酶和对应的连接酶缓冲液进行连接反应；所述环状单链dna和线性单链dna杂交后，线性单链dna的两端距离泡状结构的边缘应大于15 nt。设计成环前体线性链时，需避免将断点设计在泡状结构处，否则在制备环状双链dna模板的退火杂交过程中无法形成nick（连接酶发挥连接作用所必需的结构）。
11.进一步的，所述制备环状双链dna模板的方法，当所述环状双链dna模板长度为70-90bp时，采用一步法环化制备所述环状单链dna；当所述环状双链dna模板长度大于90bp时，设计多段40-90nt的5
¢
磷酸化的dna片段和相应的splint，采用一锅法，进行一步或分步连接反应制备环状单链dna或线性单链dna。
12.进一步的，所述退火杂交条件为：先在90℃下保温1-3min，然后以0.1℃/s的速度降温至20-25℃并保温10min。
13.进一步的，当使用t4dna连接酶和相应的t4dna连接酶缓冲液时，在4-37℃范围内保温2-24h进行连接；当使用taqdna连接酶和相应的taqdna连接酶缓冲液时，在45-80℃范围内保温2-24h进行连接。
14.进一步的，当使用t4dna连接酶时，采用终浓度为0.05-1
×
的缓冲液，当缓冲液浓度为1
×
时，其组成为：40mm tris-hcl，10mm mgcl2，10mm dtt，500μm atp(ph 7.8@25℃)；当使用taq dna连接酶时，采用终浓度为1
×
的缓冲液，其组成为：20mm tris-hcl，25mm kac，10mm mg(ac)2，10mm dtt，1.0mm nad，0.1%triton x-100(ph 7.6@25℃)。
15.进一步的，所述步骤二的环状双链dna模板的纯化过程中，用exo i和exo iii共同酶切去除环状双链dna模板中混杂着的所有线性单链dna，exo i的酶切反应采用终浓度为0.5
×
的缓冲液，其组成为：33.5mm glycine-koh(ph 9.5@25℃)，3.35mm mgcl2，0.5mm dtt；exo iii的酶切反应采用终浓度为0.5
×
的缓冲液，其组成为：33mm tris-hcl(ph 8.0@30℃)，0.33mm mgcl2。
16.进一步的，所述步骤三在37℃下恒温反应0.5-72h制备双链rna。
17.进一步的，双链rna的制备过程中，rna聚合酶的转录反应采用终浓度为1
×
的缓冲液，其组成为：40mm tris-hcl(ph 7.9@25℃)，6.0mm mgcl2，10mm dtt，10mm nacl和2mm spermidine。
18.有益效果：本发明制备双链rna的方法中所用到的转录模板中无需引入启动子序列，因而转
录产物中不会引入由启动子转录产生的多余序列，极大方便了后续的产物纯化过程。
19.双向转录效率相同，避免了非对称转录导致的一条rna链过量的情况的发生，特别适合制备双链rna。
20.相较于现有的双链rna制备方法，本发明所涉及的制备双链rna的方法非常简便、易操作，无需严苛条件，仅需扩大反应体系、延长转录时间、供给转录体系充足的ntps即可实现目的双链rna产物的大量制备。
21.利用本方法制备得到的双链rna本身纯度较高（仅首尾两端的2-8nt为单链rna），若对产物纯度要求较高，后续可用rnase a/rnase 1/rnase t1等酶切去除首尾两端的单链rna，用dnase i等dna酶去除环状双链dna模板，用抽提醇沉、hplc等方式对产物进一步纯化。
22.综上，本发明大大简化了双链rna的制备流程，具有良好的应用潜力。
附图说明
23.图1实施例1制备双链rna的示意图；图2实施例1环状单链dna的制备方法示意图；图3实施例1环状双链dna模板的制备方法示意图；图4实施例1用b15制备双链rna的结果（用t7 rna聚合酶制备），其中a为b15的序列设计示意图，b为b15在75℃下制备的结果示意图；c为用b15制备双链rna的结果以及对转录产物的酶切验证结果；图5实施例2用b12制备双链rna的结果，其中a为b12的序列设计示意图，b为b12在75℃下制备的结果示意图；c为用b12制备双链rna的结果以及对转录产物的酶切验证结果；图6实施例3用b9制备双链rna的结果，其中a为b9的序列设计示意图，b为b9在75℃下制备的结果示意图；c为用b9制备双链rna的结果以及对转录产物的酶切验证结果；图7实施例4用b5制备双链rna的结果，其中a为b5的序列设计示意图，b为b5在75℃下制备的结果示意图；c为用b5制备双链rna的结果以及对转录产物的酶切验证结果；图8实施例5用b9t制备双链rna的结果，其中a为b9t的序列设计示意图，b为b9t在75℃下制备的结果示意图；c为用b9t制备双链rna的结果以及对转录产物的酶切验证结果；图9实施例6用b5t制备双链rna的结果，其中a为b5t的序列设计示意图，b为b5t在75℃下制备的结果示意图；c为用b5t制备双链rna的结果以及对转录产物的酶切验证结果；图10实施例7用环96制备双链rna的结果，其中a为环96的序列设计示意图，b为环96在65℃下制备的结果示意图；c为用环96制备双链rna的结果以及对转录产物的酶切验证结果；图11实施例8用环155制备双链rna的结果，其中a为环155的序列设计示意图，b为环155在65℃下制备的结果示意图；c为用环155制备双链rna的结果以及对转录产物的酶切验证结果；图12实施例9用环278制备双链rna的结果，其中a为环278的序列设计示意图，b为环278在65℃下制备的结果示意图；c为用环278制备双链rna的结果以及对转录产物的酶切验证结果；图13实施例10用b15制备双链rna的结果（用sp6 rna聚合酶制备）。
c1-ba，终浓度为2μm）、t4 dna连接酶（t4 dnl，终浓度为0.125u/μl）和对应的t4 dna连接酶缓冲液（终浓度为1
×
）混合，37℃下反应12h制备c1。
[0029]1×
t4 dnl buffer的组成：40mm tris-hcl，10mm mgcl2，10mm dtt，500μm atp(ph 7.8@25℃)。
[0030]
la的制备：将前体线性链（a-a和a-b，终浓度为1μm）、splint（splint a-ab，终浓度为2μm）、t4 dna连接酶（t4 dnl，终浓度为0.125u/μl）和对应的t4 dna连接酶缓冲液（终浓度为1
×
）混合，37℃下反应12h制备la。
[0031]1×
t4 dnl buffer的组成：40mm tris-hcl，10mm mgcl2，10mm dtt，500μm atp (ph 7.8@25℃)（3）制备b15（泡状结构长度为15bp的环状双链dna模板）先将c1（终浓度为1μm）、la（终浓度为1.2μm）以及taq dnl buffer（终浓度为1
×
）混的mix在90℃下保温1~3min，然后以0.1℃/s的速度降温至60℃，再以0.1℃/s的速度降温至20-25℃并保温10min使得c1和la充分杂交形成nick。将pcr调到75℃下运行，然后在样品中加入taq dnl（终浓度为4u/μl）在75℃下连接12h。
[0032]1×
taq dnl buffer的组成：20mm tris-hcl，25mm kac，10mm mg(ac)2，10mm dtt，1mm nad，0.1%triton x-100(ph 7.6@25℃)。
[0033]
（4）纯化b15在（3）中制备得到的b15中加入exo i（终浓度约为1u/μl）、exo iii（终浓度约为4u/μl）及其对应的buffer（各自终浓度均为0.5
×
）。颠倒混匀并离心后在37℃下过夜酶切，以去除体系中剩余的la以及splint。
[0034]
0.5
×
exo i buffer的组成为：33.5mm glycine-koh (ph 9.5@25℃)，3.35mm mgcl2，0.5mm dtt；0.5
×
exo iii buffer的组成为：33mm tris-hcl(ph 8.0@30℃)，0.33mm mgcl2。
[0035]
（5）用b15转录制备双链rna转录体系及反应条件（100μl）：[b15]=50 nm，[each ntp]=0.5mm，[t7 rnap]=2u/μl，[rnase inhibitor]=2u/μl，[rnap buffer]=1
×
，（[rnase h]）=0.25u/μl。在37℃下转录12h，再在70℃下处理10min终止反应。
[0036]1×
rnap buffer的组成为：40mm tris-hcl(ph 7.9@25℃)，6mm mgcl2，10mm dtt，10mm nacl和2mm spermidine。
[0037]
（6）用shortcut rnase iii酶切转录产物以确认转录产物为双链：取出10μl转录产物，然后在体系中（总体积为20μl）加入shortcut rnase iii（终浓度为0.2u/μl）、shortcut reaction buffer（终浓度为1
×
）和mncl2（终浓度为1
×
）。在37℃下酶切40 min，然后取出部分酶切产物与loading buffer混合（loading buffer中有edta，可以螯合掉金属离子，从而终止反应）。
[0038]
（7）电泳检测对实验结果进行8%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，再用image lab软件分析环状双链dna模板的制备结果、其对应的双链rna的制备结果（转录结果）以及shortcut rnase iii的转录产物酶切结果。
[0039]
图4为结果图，其中图4中a为b15的序列设计示意图，其含有一个上、下链序列相同、方向相反的15bp泡状结构；图4中b为b15在75℃下制备的结果示意图；图4中c为用b15制备双链rna（体系中仅有t7 rnap或t7 rnap和rnase h共存）的结果以及shortcut rnase iii对转录产物的酶切验证结果，图中的标注“s”指shortcut rnase iii酶切的结果。结果表明当转录体系中仅有t7 rnap时，转录产物为堵在胶孔处的多聚串联重复序列；当t7 rnap和rnase h共存于转录体系时，转录产物集中分布于一个固定的长度；shortcut rnase iii酶切后，上述转录产物均被切短了，长度集中在一小段固定区域，根据该酶的酶切特性（其可将长双链rna酶切成18-25bp的短双链rna），可以判定b15的转录产物为我们想要的双链rna。
[0040]
实施例2（1）原料a-a链（5
¢→3¢
）：actccggtggaatgaaggaccaagtctgtcatgcactgaaatcagtctcattgctttataa（5
¢‑
磷酸化，长度为61nt，seq id no：1）；a-b链（5
¢→3¢
）：acaaccagctaagacactgccataccctgtagaaccgaatttgtgcag（5
¢‑
磷酸化，长度为48nt，seq id no：2）；splint a-ab（5
¢→3¢
）：agctggttgtttataaagca（长度为20nt，seq id no：3）；splint a-ba（5
¢→3¢
）：accggagtctgcacaa（长度为16nt，seq id no：4）；c2-a链（5
¢→3¢
，同c1-a）：ttataaagcaatgagactgatttcagtgcatgacagacttggtccttcattccaccgga（5
¢‑
磷酸化，长度为59nt，seq id no：5）；c2-b链（5
¢→3¢
）：gtctgcacaaattcggttctacacccataccgtcagtcttagctggttgt（5
¢‑
磷酸化，长度为50nt，seq id no：9）；splint c1-ab（5
¢→3¢
）：gtgcagactccggtgg（长度为16nt，seq id no：7）；splint c1-ba（5
¢→3¢
）：ctttataaacaaccag（长度为16nt，seq id no：8）。
[0041]
环状单链dna（c2）的制备、b12（泡状结构长度为12bp的环状双链dna模板）的制备及纯化、用b12制备双链rna的反应体系及条件以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
[0042]
（2）转录结束后在转录产物中加入a链或c2链的一部分与之杂交，然后加入rnase h进行二次酶切以判断转录产物为单/双链的体系及反应条件：在10μl转录产物中加入lc2-a（lc1-a）/la-a（终浓度为0.1μm）和rnase h buffer（终浓度为0.5
×
），然后在65℃下处理10min，再以0.1℃/s的速度降温至37℃，再在37℃下保持5min，接着加入rnase h（终浓度为0.25u/μl），在37℃下酶切40min。反应结束后在70℃
下处理10min，以灭活rnase h。
[0043]
图5中c为实验结果，可以看到加入rnase h进行二次酶切后泳道上方的弥散条带减少了，且泳道靠下位置处的短产物量得到了提高。这表明加入的单链dna并未发挥作用（其若发挥作用，产物会被切成寡核苷酸，而是新加入的rnase h识别了泡状结构处的单链与rna产物杂交产生的dna/rna chimera并进一步发挥了酶切作用。上述结果说明b12的转录产物为双链，不是单链。
[0044]
实施例3（1）原料a-a链（5
¢→3¢
）：actccggtggaatgaaggaccaagtctgtcatgcactgaaatcagtctcattgctttataa（5
¢‑
磷酸化，长度为61nt，seq id no：1）；a-b链（5
¢→3¢
）：acaaccagctaagacactgccataccctgtagaaccgaatttgtgcag（5
¢‑
磷酸化，长度为48nt，seq id no：2）；splint a-ab（5
¢→3¢
）：agctggttgtttataaagca（长度为20nt，seq id no：3）；splint a-ba（5
¢→3¢
）：accggagtctgcacaa（长度为16nt，seq id no：4）；c3-a链（5
¢→3¢
，同c1-a）：ttataaagcaatgagactgatttcagtgcatgacagacttggtccttcattccaccgga（5
¢‑
磷酸化，长度为59nt，seq id no：5）；c3-b链（5
¢→3¢
）：gtctgcacaaattcggttctacacccataccgagtgtcttagctggttgt（5
¢‑
磷酸化，长度为50nt，seq id no：10）；splint c1-ab（5
¢→3¢
）：gtgcagactccggtgg（长度为16nt，seq id no：7）；splint c1-ba（5
¢→3¢
）：ctttataaacaaccag（长度为16nt，seq id no：8）。
[0045]
环状单链dna（c3）的制备、b9（泡状结构长度为9bp的环状双链dna模板）的制备及纯化、用b9制备双链rna的反应体系及条件、b9转录产物的shortcut rnase iii酶切表征实验以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
[0046]
图6中c为实验结果，可以看到结果同图4中c基本一致，因此我们判定b9的转录产物为双链rna。
[0047]
实施例4（1）原料a-a链（5
¢→3¢
）：actccggtggaatgaaggaccaagtctgtcatgcactgaaatcagtctcattgctttataa（5
¢‑
磷酸化，长度为61nt，seq id no：1）；a-b链（5
¢→3¢
）：
acaaccagctaagacactgccataccctgtagaaccgaatttgtgcag（5
¢‑
磷酸化，长度为48nt，seq id no：2）；splint a-ab（5
¢→3¢
）：agctggttgtttataaagca（长度为20nt，seq id no：3）；splint a-ba（5
¢→3¢
）：accggagtctgcacaa（长度为16nt，seq id no：4）；e-a链（5
¢→3¢
，同c1-a）：ttataaagcaatgagactgatttcagtgcatgacagacttggtccttcattccaccgga（5
¢‑
磷酸化，长度为59nt，seq id no：5）；e-b链（5
¢→3¢
）：gtctgcacaaattcggttctacacccattggcagtgtcttagctggttgt（5
¢‑
磷酸化，长度为50nt，seq id no：11）；splint c1-ab（5
¢→3¢
）：gtgcagactccggtgg（长度为16nt，seq id no：7）；splint c1-ba（5
¢→3¢
）：ctttataaacaaccag（长度为16nt，seq id no：8）。
[0048]
环状单链dna（ce）的制备、b5（泡状结构长度为5bp的环状双链dna模板）的制备及纯化、用b5制备双链rna的反应体系及条件、b5转录产物的shortcut rnase iii酶切表征实验以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
[0049]
图7中c为实验结果，可以看到结果同图4中c基本一致，因此我们判定b5的转录产物为双链rna。但应当注意的是，当泡状结构尺寸为5bp时，可以看到当t7 rnap和rnase h共存于转录体系时，转录结束后并没有固定长度的短rna产物出现，只是有弥散条带出现，大部分产物仍集中在胶孔处，说明这么小的泡状结构尺寸限制了rnase h对转录产物的酶切分离，使得产物单体的分离效果不理想。因此在设计转录模板时泡状结构尺寸应≥5bp。
[0050]
实施例5（1）原料a-a链（5
¢→3¢
）：actccggtggaatgaaggaccaagtctgtcatgcactgaaatcagtctcattgctttataa（5
¢‑
磷酸化，长度为61nt，seq id no：1）；a-b链（5
¢→3¢
）：acaaccagctaagacactgccataccctgtagaaccgaatttgtgcag（5
¢‑
磷酸化，长度为48nt，seq id no：2）；splint a-ab（5
¢→3¢
）：agctggttgtttataaagca（长度为20nt，seq id no：3）；splint a-ba（5
¢→3¢
）：accggagtctgcacaa（长度为16nt，seq id no：4）；h2-a链（5
¢→3¢
，同c1-a）：ttataaagcaatgagactgatttcagtgcatgacagacttggtccttcattccaccgga（5
¢‑
磷酸化，长度为59nt，seq id no：5）；
h2-b链（5
¢→3¢
）：gtctgcacaaattcggttctacatttttttttagtgtcttagctggttgt（5
¢‑
磷酸化，长度为50nt，seq id no：12）；splint c1-ab（5
¢→3¢
）：gtgcagactccggtgg（长度为16nt，seq id no：7）；splint c1-ba（5
¢→3¢
）：ctttataaacaaccag（长度为16nt，seq id no：8）。
[0051]
环状单链dna（ch2）的制备、b9t（带有polyt的泡状结构长度为9bp的环状双链dna模板）的制备及纯化、用b9t制备双链rna的反应体系及条件、以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
[0052]
（2）转录结束后在转录产物中加入a链或h2链的一部分与之杂交，然后加入rnase h进行二次酶切以判断转录产物为单/双链的体系及反应条件：在10μl转录产物中加入lh2-a（lc1-a）/la-a（终浓度为1μm）和rnase h buffer（终浓度为0.5
×
），然后在65℃下处理10min，再以0.1℃/s的速度降温至37℃，再在37℃下处理5min，接着加入rnase h（终浓度为0.25u/μl），在37℃下酶切2h。反应结束后在70℃下处理10min，以灭活rnase h。
[0053]
图8中c为实验结果，可以看到结果与图5中c类似，在加入rnase h进行二次酶切后泳道上方的弥散条带减少了，且泳道靠下位置处的短产物量得到了极大提高。这表明加入的单链dna并未发挥作用，说明b9t的转录产物也为双链。但应当注意的是，与b9的转录结果（图6中c）相比，可以看到泡状结构处polyt的存在很大程度上影响了rnase h对转录产物的酶切分离，在设计转录模板时应尽量避免此类特殊序列。
[0054]
实施例6（1）原料a-a链（5
¢→3¢
）：actccggtggaatgaaggaccaagtctgtcatgcactgaaatcagtctcattgctttataa（5
¢‑
磷酸化，长度为61nt，seq id no：1）；a-b链（5
¢→3¢
）：acaaccagctaagacactgccataccctgtagaaccgaatttgtgcag（5
¢‑
磷酸化，长度为48nt，seq id no：2）；splint a-ab（5
¢→3¢
）：agctggttgtttataaagca（长度为20nt，seq id no：3）；splint a-ba（5
¢→3¢
）：accggagtctgcacaa（长度为16nt，seq id no：4）；j2-a链（5
¢→3¢
，同c1-a）：ttataaagcaatgagactgatttcagtgcatgacagacttggtccttcattccaccgga（5
¢‑
磷酸化，长度为59nt，seq id no：5）；j2-b链（5
¢→3¢
）：gtctgcacaaattcggttctacattttttggcagtgtcttagctggttgt（5
¢‑
磷酸化，长度为50nt，seq id no：13）；
splint c1-ab（5
¢→3¢
）：gtgcagactccggtgg（长度为16nt，seq id no：7）；splint c1-ba（5
¢→3¢
）：ctttataaacaaccag（长度为16nt，seq id no：8）。
[0055]
环状单链dna（cj2）的制备、b5t（带有polyt的泡状结构长度为5bp的环状双链dna模板）的制备及纯化、用b5t制备双链rna的反应体系及条件、以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
[0056]
（2）转录结束后在转录产物中加入a链或j2链的一部分与之杂交，然后加入rnase h进行二次酶切以判断转录产物为单/双链的体系及反应条件：在10μl转录产物中加入lj2-a（lc1-a）/la-a（终浓度为1μm）和rnase h buffer（终浓度为0.5
×
），然后在65℃下处理10min，再以0.1℃/s的速度降温至37℃，再在37℃下处理5min，接着加入rnase h（终浓度为0.25u/μl），在37℃下酶切40min。反应结束后在70℃下处理10min，以灭活rnase h。
[0057]
图9中c为实验结果，可以看到在加入rnase h进行二次酶切后堵在胶孔处的长产物未减少，这表明加入的单链dna未发挥作用，说明b5t的转录产物也为双链。
[0058]
实施例7（1）原料a链（5
¢→3¢
）：ccaggaatcagcggcaaattcctctactttcctcgtcacatctt（5
¢‑
磷酸化，长度为44nt，seq id no：14，下划线处为泡状结构所在位置）；b链（5
¢→3¢
）：cgactcctgtactgacaacactctcacacgacacatccgcgtcacaaaaggt（5
¢‑
磷酸化，长度为52nt，seq id no：15）；splint ab（5
¢→3¢
）：acaggagtcgaagatgtgac（长度为20nt，seq id no：16）；splint ba（5
¢→3¢
）：tgattcctggaccttttgtg（长度为20nt，seq id no：17）；a1链（5
¢→3¢
）：aagatgtgagctcctttcatctccaatttgccgctgattcctgg（5
¢‑
磷酸化，长度为44nt，seq id no：18，下划线处为泡状结构所在位置）；b1链（5
¢→3¢
）：accttttgtgacgcggatgtgtcgtgtgagagtgttgtcagtacaggagtcg（5
¢‑
磷酸化，长度为52nt，seq id no：19）；splint a1b1（5
¢→3¢
）：cacaaaaggtccaggaatca（长度为20nt，seq id no：20）；splint b1a1（5
¢→3¢
）：ctcacatcttcgactcctgt（长度为20nt，seq id no：21）。
[0059]
96nt的单环制备方法同实施例1，但96bp的环状双链dna模板的制备方法与实施例1-6均不同。具体地：将制备好的96nt单环和与其互补链对应的两条短dna链（a1和b1）退火
dnl，终浓度为0.25u/μl）和对应的t4 dna连接酶缓冲液（终浓度为1
×
）混合，37℃下反应2h。
[0063]
c-a1b1c1的制备：将制备好的l-a1b1（终浓度为2μm）、c1（终浓度为2μm）、splint（splint a1c1和splint c1b1，终浓度均为3μm）、t4 dna连接酶（t4 dnl，终浓度为0.125u/μl）和对应的t4 dna连接酶缓冲液（终浓度为0.5
×
）混合，37℃下反应2h。
[0064]
155bp的环状双链dna模板的制备方法与实施例7相同。具体地：将制备好的155nt单环和与其互补链对应的三条短dna链（a、b和c）退火杂交（退火条件同实施例1）后直接加入taq dnl进行连接。155bp的环状双链dna模板的纯化方法及后续的转录条件同实施例1，此处不再赘述。
[0065]
图11为用长度为155bp的环状双链dna模板制备双链rna的结果。结果显示转录产物也为双链rna，表明本方法具有良好的通用性。
[0066]
实施例9（1）原料b链（5
¢→3¢
）：cgactcctgtactgacaacactctcacacgacacatccgcgtcacaaaaggt（5
¢‑
磷酸化，长度为52nt，seq id no：15）；c链（5
¢→3¢
）：gaagaaactcatgacatcgaattgttgagcgaagaatatgacgccactcctttcatcaa（5
¢‑
磷酸化，长度为59nt，seq id no：22）；d链（5
¢→3¢
）：aatcggcagtccattcgcagaagcaactgtactcaaattcggtaaactccaacgc（5
¢‑
磷酸化，长度为55nt，seq id no：28，下划线处为泡状结构所在位置）；e链（5
¢→3¢
）：actcagtacgcatacttcgtcactgctgatgacatcagggttggttcaatgtccgccga（5
¢‑
磷酸化，长度为59nt，seq id no：29）；f链（5
¢→3¢
）：cggctaccacaacatttctaccaaggatggtgactgcggttcactcctctttg（5
¢‑
磷酸化，长度为53nt，seq id no：30）；splint bc（5
¢→3¢
）：gagtttcttcaccttttgtg（长度为20nt，seq id no：23）；splint cd（5
¢→3¢
）：actgccgattttgatgaaag（长度为20nt，seq id no：31）；splint de（5
¢→3¢
）：cgtactgagtgcgttggagt（长度为20nt，seq id no：32）；splint ef（5
¢→3¢
）：gtggtagccgtcggcggaca（长度为20nt，seq id no：33）；splint fb（5
¢→3¢
）：acaggagtcgcaaagaggag（长度为20nt，seq id no：34）；
b1链（5
¢→3¢
）：accttttgtgacgcggatgtgtcgtgtgagagtgttgtcagtacaggagtcg（5
¢‑
磷酸化，长度为52nt，seq id no：19）；c1链（5
¢→3¢
）：ttgatgaaaggagtggcgtcatattcttcgctcaacaattcgatgtcatgagtttcttc（5
¢‑
磷酸化，长度为59nt，seq id no：25）；d1链（5
¢→3¢
）：gcgttggagtttaccgaatttgagttgtcaacgaagacgcaatggactgccgatt（5
¢‑
磷酸化，长度为55nt，seq id no：35，下划线处为泡状结构所在位置）；e1链（5
¢→3¢
）：tcggcggacattgaaccaaccctgatgtcatcagcagtgacgaagtatgcgtactgagt（5
¢‑
磷酸化，长度为59nt，seq id no：36）；f1链（5
¢→3¢
）：caaagaggagtgaaccgcagtcaccatccttggtagaaatgttgtggtagccg（5
¢‑
磷酸化，长度为53nt，seq id no：37）；splint c1b1（5
¢→3¢
）：cacaaaaggtgaagaaactc（长度为20nt，seq id no：27）；splint d1c1（5
¢→3¢
）：ctttcatcaaaatcggcagt（长度为20nt，seq id no：38）；splint e1d1（5
¢→3¢
）：actccaacgcactcagtacg（长度为20nt，seq id no：39）；splint f1e1（5
¢→3¢
）：tgtccgccgacggctaccac（长度为20nt，seq id no：40）；splint b1f1（5
¢→3¢
）：ctcctctttgcgactcctgt（长度为20nt，seq id no：41）。
[0067]
278nt的单环制备方法同实施例8，即采用分步的方式制备。具体地，先制备l-b1c1和l-d1e1，再以l-d1e1和f1为原料制备l-d1e1f1，最后以l-b1c1和l-d1e1f1为原料制备c-b1c1d1e1f1（278nt的单环）。
[0068]
l-b1c1的制备：将b1和c1（终浓度为4μm）、splint（splint c1b1，终浓度为6μm）、t4 dna连接酶（t4 dnl，终浓度为0.25u/μl）和对应的t4 dna连接酶缓冲液（终浓度为1
×
）混合，37℃下反应2h。
[0069]
l-d1e1的制备：将d1和e1（终浓度为4μm）、splint（splint e1d1，终浓度为6μm）、t4 dna连接酶（t4 dnl，终浓度为0.25u/μl）和对应的t4 dna连接酶缓冲液（终浓度为1
×
）混合，37℃下反应2h。
[0070]
l-d1e1f1的制备：将制备好的l-d1e1（终浓度为2μm）、f1（终浓度为2μm）、splint（splint f1e1，终浓度为3μm）、t4 dna连接酶（t4 dnl，终浓度为0.125u/μl）和对应的t4 dna连接酶缓冲液（终
浓度为0.5
×
）混合，37℃下反应2h。
[0071]
c-b1c1d1e1f1的制备：将制备好的l-d1e1f1（终浓度为1μm）和l-b1c1（终浓度为1μm）、splint（splint d1c1和splint b1f1，终浓度均为1.5μm）、t4 dna连接酶（t4 dnl，终浓度为0.0625u/μl）和对应的t4 dna连接酶缓冲液（终浓度为0.25
×
）混合，37℃下反应2h。
[0072]
278bp的环状双链dna模板的制备方法与实施例7和实施例8相同。具体地：将制备好的278nt单环和与其互补链对应的五条短dna链（b、c、d、e和f）退火杂交（退火条件同实施例1）后直接加入taq dnl进行连接。278bp的环状双链dna模板的纯化方法及后续的转录条件同实施例1，此处不再赘述。图12为用长度为278bp的环状双链dna模板制备双链rna的结果。结果显示转录产物也为双链rna，表明本方法具有良好的通用性。
[0073]
实施例10所用的原料，单环、单链及环状双链dna的制备及纯化方法同实施例1，此处不再赘述。不同之处在于这里用sp6 rna聚合酶进行转录，转录条件同实施例1。
[0074]
图13为b15在sp6 rna聚合酶的作用下制备双链rna的结果。结果显示转录产物也为双链rna，表明本方法具有良好的通用性，适用于多种常见的rna聚合酶。
[0075]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。