一种LPCTA纳米体系及其在miRNA检测中的应用

一种lpcta纳米体系及其在mirna检测中的应用
技术领域
1.本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及一种lpcta纳米体系及其在mirna检测中的应用。


背景技术：

2.microrna(mirna)是一类短的非编码rna分子(通常长度为19-24个核苷酸)，其在细胞增殖，迁移和凋亡等过程发挥重要作用。大量研究表明，特定mirna的异常表达与不同癌症或许多其他病理状况的发生和发展有着不可分割的联系。因此，mirna被认为是疾病诊断、治疗和预后的有效生物标志物，这也对mirna的检测灵敏度提出了更高的要求。
3.目前，rt-qpcr是mirna检测的标准方法，然而该方法涉及复杂的样品前处理工序，且仅能获取mirna的平均表达水平。由于mirna在细胞内含量较低，为实现mirna高灵敏检测，大量核酸扩增方法被发展用于mirna分析。这些信号扩增方法一般为基于生物酶的扩增方法和无生物酶参与的扩增方法。基于生物酶的扩增包括如恒温指数扩增(expar)、滚环扩增(rca)、环介导等温扩增(lamp)等，虽然上述方法的扩增效率高，但由于参与反应的生物酶难以转染进细胞易受细胞内复杂环境的干扰引起非特异性扩增不适用于细胞内mirna的分析。而无生物酶参与的扩增反应主要是基于toehold链置换的扩增，其类型包括杂交链反应(hcr)、催化发夹自组装(cha)等。除此之外，各种核酸转染试剂，比如脂质体、二氧化锰纳米粒子、石墨烯、dna纳米结构等，也被广泛用来转染基于无酶核酸扩增的发夹探针进入细胞实现细胞内mirna的检测。然而，这些方法中核酸探针进入细胞后是扩散的，导致低的反应动力学，降低了反应灵敏度。一些方法通过将连续的反应物限定在一定的空间结构上提高了反应物局域浓度和提升了反应速率。
4.而dna纳米线由于其结构简单、制备容易以及能够有效的转染核酸探针和结合多个探针，该特性引起了研究人员极大的兴趣，已用于限域toehold链置换扩增提高dna反应速率，以实现细胞内mirna的高灵敏分析。典型地，催化发夹组装(cha)反应的2条反应物探针(h1、h2)被依次结合到dna纳米线上，目标物mirna通过toehold链置换打开其中一个发夹h1，诱导打开的发夹h1进一步和另一发夹h2杂交形成双链并置换出目标mirna，置换出的目标mirna诱导新的h1和h2形成双链，不断循环，实现细胞内mirna的高灵敏分析。然而，由于h1和h2被交替结合在纳米线上，被置换出的目标物与新的h1反应需要跨过h2，易导致脱轨，限制了反应速率的进一步提高和痕量分析物的测定。
5.因此，本发明希望提出一中新的无酶扩增技术及产品，可进一步提高扩增反应速率，实现对mirna的高灵敏分析。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种lpcta纳米体系及其在mirna检测中的应用。本发明基于dna纳米线技术，经研究开发得到所述lpcta纳米体系，可用于无酶核酸扩增，并可实现mirna的快速、高灵敏度检测分析。
7.本发明提供了一种lpcta纳米体系，由dna纳米线与双链寡核苷酸h1s1、双链寡核苷酸h2s2经分子杂交形成；其中，
8.双链寡核苷酸h1s1包括h1和s1；双链寡核苷酸h2s2包括h2和s2；dna纳米线包括单链探针l1和l2；且，
9.双链寡核苷酸h1s1上标记有荧光基团和淬灭基团；
10.h1与s2的部分序列互补，h2与s1的部分序列互补；双链寡核苷酸h1s1可与目标核酸发生toehold链置换。
11.在所述lpcta纳米体系中，dna纳米线与双链寡核苷酸h1s1、双链寡核苷酸h2s2通过分子杂交实现结合，形成整体的lpcta纳米体系。而h1由依次的第一5’端悬挂链、第一中段链、第一3’端悬挂链组成，所述第一中段链与s1经分子杂交实现结合；h2由依次的第二5’端悬挂链、第二中段链、第二3’端悬挂链组成，所述第二中段链与s2经分子杂交实现结合；l1和l2均为单链探针，经互补杂交形成dna纳米线。因此，所述双链寡核苷酸h1s1、双链寡核苷酸h2s2和dna纳米线均为双链结构。
12.本发明所述lpcta纳米体系的检测原理为(以目标核酸为mirna为例)：
13.通过dna纳米线的作用，不仅可使lpcta纳米体系进入细胞，还可固定h1s1与h2s2之间的距离和位置，并提高反应物(h1s1、h2s2)的局域浓度。当待检测溶液或活细胞中不含目标mirna，dna纳米线上的h1s1、h2s2稳定存在，相互之间不发生反应，且荧光基团受淬灭基团的淬灭而不发光。在目标mirna存在的情况下，目标mirna通过toehold链置换作用与h1s1上的s1杂交形成更稳定的双链，从而置换出h1，导致h1上的荧光恢复(荧光基团发光)。被置换出的h1随即形成发夹结构(即发夹h1)，发夹h1可通过toehold链置换进一步与h2s2上的s2杂交形成稳定的双链并置换出h2。被置换出的h2随即也形成发夹结构(即发夹h2)，发夹h2又进一步通过toehold链置换与另一个h1s1上的s1杂交形成更稳定的双链和置换出h1。通过不断重复上述反应，大量h1上的荧光得到恢复，从而实现mirna的检测。
14.优选的，所述双链寡核苷酸h1s1、双链寡核苷酸h2s2交替结合于所述dna纳米线上。上述lpcta纳米体系中，h1s1和h2s2被交替结合、固定在dna纳米线上，通过交替设置h1s1和h2s2的方式，被置换出的h1、h2分别能够迅速与邻近的h2s2或h1s1反应，响应速度更快。
15.优选的，所述双链寡核苷酸h1s1中h1和s1上分别标记有荧光基团和淬灭基团。
16.优选的，所述h1的3’和5’端悬挂的序列与s2部分序列互补。
17.优选的，所述h2的3’和5’端悬挂的序列与s1部分序列互补。
18.优选的，所述dna纳米线中的l1、l2分别与s1、s2进行结合。上述结合的方式为基于碱基互补配对原则的分子杂交。
19.优选的，所述荧光基团选自fam、cy5、texas red、tet、hex中的任意一种，所述淬灭基团选自bhq1、bhq2、tamra、eclipse、mgb中的任意一种。
20.本发明还提供了上述lpcta纳米体系的制备方法，包括以下步骤：
21.(1)分别将用于合成双链寡核苷酸h1s1、双链寡核苷酸h2s2、dna纳米线的单链与mg
2+
和tris-hcl混合，采用以下温度进行反应：95℃5min、70℃30min、50℃30min、25℃2h，分别制得h1s1、h2s2、dna纳米线；
22.(2)将步骤(1)制得的双链寡核苷酸h1s1、双链寡核苷酸h2s2、dna纳米线混合，并加入mg
2+
和tris-hcl，于37℃下进行孵育，制得lpcta纳米体系。
23.其中，用于合成h1s1的单链为h1和s1；用于合成h2s2的单链为h2和s2；用于合成dna纳米线的单链为l1和l2。
24.优选的，步骤(2)中所述孵育的时间≥5h。
25.本发明还提供了上述lpcta纳米体系在核酸检测或制备检测试剂盒中的应用。
26.优选的，所述核酸为mirna。
27.本发明还提供了一种mirna检测试剂盒，包含有上述lpcta纳米体系。
28.本发明还提供了一种非诊断目的的mir-221的检测方法，采用上述lpcta纳米体系进行检测；其中，h1、s1、h2、s2、l1和l2的核苷酸序列分别如seq id no：1-6所示。
29.mir-221(其核苷酸序列如seq id no：7所示)属于mirna的一种，已知其会在乳腺癌和肺癌细胞等多种人类肿瘤中异常表达，因此mir-221常常作为疾病诊断、治疗或预后评价的生物标志物。采用上述检测方法，可对mir-221实现高灵敏度检测。
30.相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
31.(1)采用所述lpcta纳米体系进行mirna检测，具有操作简单、检测速度快且检测成本低廉的优势；
32.(2)本发明所述lpcta纳米体系的结构稳定，特异性好，可以很好的区别同类mirna的各种亚型；
33.(3)采用所述lpcta纳米体系进行检测，其线性范围宽，检测限低至51pm，可用于微量mirna的检测；
34.(4)本发明所述lpcta纳米体系具有良好的检测准确度，具备广阔的市场应用前景。
附图说明
35.图1为实施例1中基于线性dna双链传送的级联邻近扩增反应的原理示意图；
36.图2为实施例2中h1s1、h2s2、dna纳米线和lpcta纳米体系的合成凝胶电泳验证结果；
37.图3为实施例3中聚丙烯凝胶电泳验证方法可行性的结果；
38.图4为实施例4中荧光验证方法可行性的结果；
39.图5为实施例5中h1s1体系、cta体系和lpcta纳米体系动力学曲线对比图；
40.图6为实施例6中h1s1体系、cta体系和lpcta纳米体系在不同mir-221浓度下的荧光强度变化和标准曲线图；
41.图7为实施例7中lpcta纳米体系的特异性检测结果；
42.图8为实施例8中dna纳米线的保护作用的验证结果；
43.图9为实施例9中dna纳米线的细胞毒性的验证结果；
44.图10为实施例10中不同条件处理的mcf-7细胞的clsm图像；
45.图11为实施例10中不同条件处理的mda-mb-231细胞的clsm图像；
46.图12为实施例11中活细胞microrna成像准确度结果；
47.图13为实施例11中地塞米松调节细胞内microrna原位成像结果；
48.图14为实施例11中不同类型细胞内microrna原位成像结果；
49.图15为实施例11中采用rt-qpcr的验证结果。
具体实施方式
50.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
51.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
52.实施例1
53.本实施例提供一种可用于检测mir-221的lpcta纳米体系，由dna纳米线与双链寡核苷酸h1s1、双链寡核苷酸h2s2经分子杂交组装而成；其中，双链寡核苷酸h1s1由h1和s1杂交形成；双链寡核苷酸h2s2由h2和s2杂交形成；dna纳米线由单链探针l1和l2杂交形成；且，h1上标记有荧光基团，s1上标记有淬灭基团；l1和l2还分别与s1、s2进行杂交；h1与s2的部分序列互补，h2与s1的部分序列互补；h1s1可与目标核酸发生toehold链置换。
54.h1、s1、h2、s2、l1、l2和mir-221的核苷酸序列分别如seq id no：1-7所示。
55.h1：5
’‑
ttcgcaagctacc/ibhq1dt/cgagctacattgtctgctgccgctcgagatggtagcagt-3’(seq id no：1)；
56.s1：5
’‑
gacgactaataagattaatcctgttttgaaacccagcagacaatgtagctcga-fam-3’(seq id no：2)；
57.h2：5
’‑
agctacattgtcttgccttcgcaagctacatggtcggaaggcagctgggtttc-3’(seq id no：3)；
58.s2：5
’‑
tgtcctaattagaataatctcgagtttactgctaccatgtagcttgcgaaggc-3’(seq id no：4)；
59.l1：5
’‑
acaggattaatcttattagtcgtctcgttacttaaatggtcagaaatatgggattaaccatggtgtttatgatatgaagtgttggaagct-3’(seq id no：5)；
60.l2：5
’‑
ctcgagattattctaattaggacattaatcccatatttctgaccatttaacgaacgaagcttccaacacttcatatcataaacaccatgg-3’(seq id no：6)；
61.mir-221：5
’‑
agctacattgtctgctgggtttc-3’(seq id no：7)。
62.本实施例中lpcta纳米体系对mir-221的检测原理为(可参照图1)：在lpcta纳米体系中，h1s1、h2s2和dna纳米线均为双链结构。通过dna纳米线的作用，不仅可使lpcta纳米体系进入细胞，还可固定h1s1与h2s2之间的距离和位置，可提高反应物(h1s1、h2s2)的局域浓度。当待检测溶液或活细胞中不含目标mirna(mir-221)，dna纳米线上的h1s1、h2s2稳定存在，相互之间不发生反应，且荧光基团受淬灭基团的淬灭而不发光。在目标mirna(mir-221)存在的情况下，mir-221通过toehold链置换作用与h1s1上的s1杂交形成更稳定的双链，从而置换出h1，导致h1上的荧光恢复(荧光基团发光)。被置换出的h1随即形成发夹结构(即发夹h1，其3’和5’端悬挂序列靠近形成一条“长”的单链)，发夹h1可通过toehold链置换进一步与h2s2上的s2杂交形成稳定的双链并置换出h2。被置换出的h2随即也形成发夹结构(即发夹h2，其3’和5’端悬挂序列靠近形成一条“长”的单链)，发夹h2又进一步通过toehold链置换与另一个h1s1上的s1杂交形成更稳定的双链和置换出h1。通过不断重复上述反应，大量h1上的荧光得到恢复，从而实现mir-221的检测。上述lpcta纳米体系中h1s1和h2s2被交替固定在dna纳
米线上，通过交替设置h1s1和h2s2的方式，被置换出的h1、h2分别能够迅速与邻近的h2s2和h1s1反应，响应速度更快。
63.本实施例中lpcta纳米体系的制备方法，包括以下步骤：
64.(1)将用于合成h1s1的单链h1、s1，与mg
2+
、tris-hcl混合得到体系1，该体系1中单链h1、s1的浓度均为4μm、mg
2+
浓度为30mm、tris-hcl浓度为0.1m。
65.将用于合成h2s2的单链h2、s2，与mg
2+
、tris-hcl混合得到体系2，该体系2中单链h2、s2的浓度均为4μm、mg
2+
浓度为30mm、tris-hcl浓度为0.1m。
66.将用于合成dna纳米线的单链l1、l2，与mg
2+
、tris-hcl混合得到体系3，该体系3中单链l1、l2的浓度均为4μm、mg
2+
浓度为30mm、tris-hcl浓度为0.1m。
67.将上述体系1-3均采用以下温度进行反应：95℃5min、70℃30min、50℃30min、25℃2h，分别制得h1s1、h2s2、dna纳米线；
68.(2)将步骤(1)制得的h1s1、h2s2、dna纳米线混合，并加入mg
2+
和tris-hcl，得到体系4；体系4中h1s1、h2s2、dna纳米线的浓度1μm，mg
2+
浓度为30mm、tris-hcl浓度为0.1m；将体系4于37℃下孵育5h，制得lpcta纳米体系。
69.实施例2
70.采用聚丙烯凝胶电泳验证h1s1、h2s2、dna纳米线和lpcta纳米体系的合成。采用与实施例1相同的条件制得h1s1、h2s2、dna纳米线的单链，并与h1s1、h2s2、dna纳米线均通过12％聚丙烯凝胶在电压为220v运行0.5h进行电泳实验，然后通过对比单链和双链的亮度以及弥散情况判断双链的合成情况。将合成好的h1s1、h2s2和dna纳米线分别跑电泳与lpcta纳米体系电泳条带对比，判断lpcta纳米体系的合成情况。
71.测试结果如图2所示：由a图和b图可知，h1s1和h2s2的单链都比较清晰，合成后的双链则明显更粗更亮。c图中l链(即dna纳米线)由于其单链的碱基数较多，所以有出现弥散现象，但是合成的双链可以看到明显的弥散亮带，由于其分子量重未能跑开。而d图中，相较于dna纳米线双链(l链)，lpcta纳米体系的条带非常明亮且聚集明显。
72.实施例3
73.聚丙烯凝胶电泳验证可行性
74.将h1s1(200nm)、h2s2(200nm)、dna纳米线(200nm)和lpcta纳米体系(200nm)分别在有无目标mirna(mir-221)(50nm)的条件下制样，37℃孵育3h，通过12％的聚丙烯凝胶电泳实验，观察反应生成物的电泳情况，验证链式反应与扩增的形成是否可行。
75.测试结果如图3所示：泳道1、2和6都是比较明亮的单条带，说明h1s1、h2s2、dna纳米线都是比较分明的单个条带，其合成纯净，没有杂链存在。泳道3表明在不存在目标mirna时，h1s1和h2s2几乎不反应。泳道4产生了新的条带，因此证明目标mirna存在时发生了链置换反应。泳道7表明，h1s1、h2s2、dna纳米线三者进行组装后，生成了分子量更大的条带，表明h1s1和h2s2成功组装到dna纳米线上；泳道8中，在h1s1h2s
2-dna纳米线所组成的lpcta纳米体系中加入目标mirna(mir-221)，泳道出现长度不一的新条带，弥散程度好，且对比泳道5能够看到目标mirna条带的消失，证明其级联指数扩增能够发生，并且反应较完全。
76.实施例4
77.荧光验证方法的可行性
78.将分别标有荧光基团fam和淬灭基团bhq1的h1s1(100nm)体系、cta(100nm)体系(由
h1s1、h2s2组成)和lpcta纳米体系(100nm)，分别在有无目标mirna(mir-221)(50nm)的条件下，37℃孵育3h，然后反应溶液的荧光测量设定在492nm处激发，所得光谱记录在505nm和600nm之间，激发/发射狭缝宽度为3nm，检测其荧光强度验证链置换反应和扩增反应的发生。
79.由图4可知，在目标mirna(mir-221)不存在时，三个体系都只有相对微弱的荧光。h1s1与目标mirna(mir-221)反应时，可见轻微的荧光增长，说明发生了普通的链置换反应产；cta体系中存在目标mirna(mir-221)时，荧光更强，说明cta体系之间发生了简单的线性扩增；而lpcta体系中存在目标mirna(mir-221)时荧光最高，说明反应更快。这些数据表明线性dna双链传送的级联邻近扩增反应可行且扩增速度比普通toehold链置换和cta反应更快，效率更高。
80.实施例5
81.动力学曲线对比验证
82.将标有荧光基团fam和淬灭基团bhq1的h1s1(100nm)体系、cta(100nm)体系(由h1s1、h2s2组成)和lpcta纳米体系(100nm)，分别在有无目标mirna(mir-221)(20nm)的条件下，用荧光pcr仪检测fam荧光3h的变化速率，对比随时间变化荧光增长趋势。
83.测试结果如图5所示：在目标mirna(mir-221)不存在时，三个体系的反应速率都很低。cta体系中，在存在目标mirna(mir-221)时，发生了普通的链置换反应产生了荧光，反应速率逐渐提高；而lpcta纳米体系中，在目标mirna(mir-221)时存在时，其反应速率更高，证明线性dna双链传送的级联邻近扩增反应可行且扩增速度比普通线性扩增更快，效率更高。
84.实施例6
85.标准曲线的绘制
86.分别配置标有荧光基团fam和淬灭基团bhq1的h1s1体系、cta体系(由h1s1、h2s2组成)和lpcta纳米体系三个体系，并分别配制一系列不同目标mirna(mir-221)浓度(0.1nm-100nm)的待测溶液；然后分别将上述体系与mg
2+
(30mm)溶液、tris缓冲液(0.1m)混合配置为相应反应溶液，37℃孵育3h，反应溶液的荧光测量设定在492nm处激发，所得光谱记录在505nm和600nm之间，激发/发射狭缝宽度为3nm，通过荧光分光光度计测定能量共振转移荧光强度。通过不同目标mirna(mir-221)浓度以及相应的fam荧光强度绘制标准曲线。
87.由图6可知，上述三体系的荧光强度均随着mir-221的浓度升高而增强，lpcta纳米体系(a图和b图)的拟合方程为y＝24576x+376980(r2＝0.995)，检测限为51pm。而普通h1s1体系的拟合方程为y＝9712x+239333(r2＝0.999)，检测限为2.86nm(c图和d图)。而cta体系的拟合方程为y＝15895x+301886(r2＝0.998)，检测限为1.1nm(e图和f图)。
88.实施例7
89.特异性评估
90.将标有荧光基团fam和淬灭基团bhq1的lpcta纳米体系，分别在有无目标mirna(mir-221)以及含错配碱基或无关的mirna条件下，37℃孵育3h，最后反应溶液的荧光测量设定在492nm处激发，所得光谱记录在505nm和600nm之间，激发/发射狭缝宽度为3nm，通过荧光分光光度计观察其荧光强度变化，同时评估该反应的特异性。
91.上述含错配碱基或无关的mirna基因序列包括：
92.mis1-221：5
’‑
agctacattgtctgctggctttc-3’(seq id no：8)；
93.mis2-221：5
’‑
agctacattctctgctcggtttc-3’(seq id no：9)；
94.mir-222：5
’‑
agctacatctggctactgggtctc-3’(seq id no：10)；
95.mir-1246：5
’‑
aatggatttttggagcagg-3’(seq id no：11)；
96.mir-373：5
’‑
gaagtgcttcgattttggggtgt-3’(seq id no：12)。
97.检测结果如图7所示：只有在mir-221存在的条件下才能产生较强的荧光，空白和错配链以及无关的mirna链所产生的荧光都非常弱，表明本发明所构建的lpcta纳米体系具有较高的特异性。
98.实施例8
99.验证dna纳米线的保护作用
100.运用与上述实施例相同的纳米体系合成方法，将标记有荧光基团fam和淬灭基团bhq1的cta体系(由h1s1、h2s2组成)与合成的lpcta纳米体系，分别在加入细胞裂解液或氧核糖核酸酶的条件下，用荧光pcr仪检测fam荧光的变化，对比是否存在纳米线l的情况下荧光的强度变化。
101.测试结果如图8所示：在lpcta纳米体系中加入细胞裂解液或氧核糖核酸酶，其荧光值均无显著变化，而无dna纳米线双链的条件下，标记荧光基团的探针很快被细胞裂解液或氧核糖核酸酶裂解，导致荧光基团和淬灭基团分离从而产生较强的荧光。因此证明dna纳米线双链可以保护lpcta体系几乎不被细胞裂解液和脱氧核糖核酸酶裂解。
102.实施例9
103.验证dna纳米线的细胞毒性
104.将mcf-7和mcf-10a细胞平铺于96孔板中，每孔大约6000个细胞，孵育过夜后加入不同浓度的dna纳米线，37℃孵育24小时后，弃去培养液，加入100μl 10％的mtt溶液，37℃孵育24小时后，弃去mtt，加入100μl的dmso摇晃10min，测得在490nm处吸收。
105.图9中结果表明，经过dna纳米线处理的正常乳腺细胞mcf-10a和乳腺癌细胞mcf-7活性都在95％以上，因此可以证明dna纳米线对乳腺细胞几乎没有毒性。
106.实施例10
107.验证活细胞中线性dna双链传送的级联邻近扩增反应的发生
108.鉴于dna纳米线的良好的转运性能，该自组装线性dna双链反应体系被用来研究其活细胞内转运效率以及扩增反应的可实施性，取四组相同的mcf-7和mda-mb-231细胞，第一组加入h1s1，第二组加入dna纳米线+h1s1，第三组加入cta体系(由h1s1、h2s2组成)，第四组加入lpcta纳米体系，然后将四组细胞分别用37℃恒温孵箱，孵育3h后，通过倒置共聚焦激光显微镜观察四组细胞内fam荧光强度，验证纳米体系是否转入细胞并且发生级联扩增。
109.检测结果如图10-11所示，只有存在有dna纳米线的lpcta纳米体系和dna纳米线+h1s1观察到荧光，并且lpcta纳米体系的荧光更强，而h1s1和cta体系的几乎观察不到不到荧光，说明dna纳米线具备转运核酸链的作用。
110.实施例11
111.活细胞内microrna原位成像
112.(1)活细胞microrna成像准确度
113.以上实施例证实了lpcta纳米体系在体外核酸检测的良好性能，本实施例采用该lpcta纳米体系用来研究活细胞内检测目标核酸的含量。取三组相同的mda-mb-231细胞，第
一组预先用mir-221反义序列孵育2小时，第二组不做处理，第三组预先加入mir-221序列孵育2小时，将三组预处理后的细胞分别加入lpcta纳米体系后，用37℃恒温孵育3h后，通过倒置共聚焦显微镜观察三组细胞fam荧光强度，验证细胞内检测目标核酸的准确度。
114.检测结果如图12所示：用mir-221预处理后的mda-mb-231细胞与lpcta纳米体系反应后荧光显著增强；用反义mir-221预处理后的mda-mb-231验证细胞即使与lpcta纳米体系反应其荧光强度也非常弱，这证明了预处理时第一组中的细胞内的mir-221与反义mir-221结合从而导致细胞内的mir-221下调而降低靶标的触发反应，证明了该方法可以成功检测细胞内mir-221表达水平的变化。
115.(2)地塞米松调节细胞内microrna原位成像
116.为验证地塞米松可调节细胞内的mir-221，取三组mda-mb-231细胞，第一组不做处理，第二组预先加入10μm的地塞米松孵育24小时，第三组预先加入100μm的地塞米松孵育24小时，将三组预处理后的细胞分别加入lpcta纳米体系后，用37℃恒温孵育3h后，通过倒置共聚焦显微镜观察三组细胞fam荧光强度，验证细胞内检测目标核酸的准确度。
117.检测结果如图13所示：相较于未处理的细胞，经过10μm和100μm的地塞米松预处理后细胞荧光都有所下降，且100μm地塞米松预处理的一组已几乎观察不到荧光，因此可以证明地塞米松有下调细胞内mir-221的作用。
118.(3)不同类型细胞内microrna原位成像
119.验证lpcta纳米体系在细胞内检测目标核酸的可行后，采用lpcta纳米体系检测相关癌细胞和正常细胞内目标核酸的含量，分别选取癌细胞mcf-7、mda-mb-231和正常细胞mcf-10a细胞，将培养好的癌细胞和正常细胞铺板后，将lpcta纳米体系加入细胞，在37℃恒温孵育3h后，通过倒置共聚焦显微镜观察三组细胞内fam荧光强度，验证细胞内检测目标核酸的准确度并确定细胞内mir-221的含量。
120.检测结果如图14所示：人正常乳腺细胞mcf-10a在lpcta纳米体系的作用下，发出的荧光非常微弱，而乳腺癌细胞mcf-7、mda-mb-231和肺癌细胞a549在lpcta纳米体系处理后分别更强的荧光。这些数据证明mir-221在各种细胞内的表达不同，并且在正常细胞中表达较低，在乳腺癌和肺癌细胞内表达更高，这些结果与rt-qpcr的结果(如图15所示)保持一致。
121.以上实施例2-11中所使用的h1s1、h2s2、dna纳米线和lpcta纳米体系均采用实施例1中的方法进行制得。
122.上面结合附图对本技术实施例作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。