一株具有降解偶氮染料功能的耐盐季也蒙毕赤酵母菌菌株、培养方法及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，本发明涉及一株具有降解偶氮染料功能的耐盐季也蒙毕赤酵母菌菌株、培养方法及其应用。


背景技术：

2.偶氮染料是应用最多的一类商用染料，占所有类型的70％以上，因此也成为了常见的环境污染物，具有分子大、性质稳定、难彻底分解等特点，广泛存在于染料合成、印染、化工、食品、皮革等诸多行业废水中，而这些废水通常也具有排放量大、有机物浓度及盐度高、可生化性差、色度高等特点，因而处理难度大。此外，在偶氮染料分解的过程中会产生性质更加稳定、毒性更强且具有“三致效应”的芳香胺类中间产物，对环境安全乃至人类健康产生了严重的威胁。
3.利用微生物的新陈代谢对环境污染物进行去除的方法统称生物法，其主体是通过人工驯化、筛选等方法构建的功能性微生物(群落)。过去人们常利用细菌或以细菌为主体的微生物群落(如传统活性污泥)对偶氮染料进行降解处理，但细菌合成的酶大多属特异性降解酶，该类酶的特征是只能催化有机物降解过程中的某一步或某几步反应，即便是在物种多样性丰富的常规水处理微生物群落中(如活性污泥)，其组成往往也是以细菌为主体，因而通常会由于缺乏某步关键降解酶而使生物降解过程中止，甚至会由此产生并积累毒性更高的中间产物，结果适得其反。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明提供一株具有降解偶氮染料功能的耐盐季也蒙毕赤酵母菌菌株(meyerozyma guilliermondii a3)、培养方法及其应用，季也蒙毕赤酵母菌菌株(meyerozyma guilliermondii a3)能够在高盐(3％-5％nacl) 条件下高效好氧降解脱色多种水溶性偶氮染料，具有潜在的偶氮染料污染修复应用价值。
5.本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
6.一株具有降解偶氮染料功能的耐盐季也蒙毕赤酵母菌菌株(meyerozymaguilliermondii a3)，该季也蒙毕赤酵母菌菌株被命名为meyerozyma guilliermondiia3。已于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号 cgmcc no.21315。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏时间：2020年12月07日。季也蒙毕赤酵母菌菌株的26s rdna序列登录于 genbank数据库，登录号为mt122798。
7.季也蒙毕赤酵母菌菌株(meyerozyma guilliermondii a3)其26s rdna序列如seq id no:1所示。
8.上述季也蒙毕赤酵母菌菌株(meyerozyma guilliermondii a3)的菌落表面湿润光滑扁平，边缘整齐，不透明，乳白色，菌株呈杆状，无鞭毛，长约2.92-3.36 μm，宽约0.53-0.97μm。
9.上述季也蒙毕赤酵母菌菌株(meyerozyma guilliermondii a3)分离自海泥样品，海泥取自大连市沙河口区黑石礁海滨公园一处近海排污口附近海滩。
10.上述季也蒙毕赤酵母菌菌株(meyerozyma guilliermondii a3)降解偶氮染料、季也蒙毕赤酵母菌菌株(meyerozyma guilliermondii a3)培养方法具体如下：
11.在好氧条件下，将季也蒙毕赤酵母菌菌株(对数期末期菌悬液)以体积百分比6％的接种量接种于含有偶氮染料的高盐共代谢培养基中进行富集培养及驯化，培养基初始ph值7.0，在30-35℃恒温摇床150-160rpm转速条件下培养。
12.所述偶氮染料浓度为50mg/l；所述偶氮染料包括但不限于酸性红b、酸性大红3r、酸性橙ii、酸性大红gr、活性艳红k-2g及活性紫kn-4r中的任一种。
13.所述培养基为液体培养基时，培养基组分：2g/l蔗糖、0.06g/l蛋白胨、 0.2g/l硫酸铵、0.5g/l磷酸二氢钾、0.2g/l硫酸镁、30g/l氯化钠、50mg/l偶氮染料，培养基使用之前经过灭菌处理；培养基初始ph值7.0，在115℃下灭菌 15min。
14.所述培养基为固体培养基时，培养基组分：2g/l蔗糖、0.06g/l蛋白胨、 0.2g/l硫酸铵、0.5g/l磷酸二氢钾、0.2g/l硫酸镁、30g/l氯化钠、50mg/l偶氮染料、20g/l的琼脂粉，培养基使用之前经过灭菌处理；培养基初始ph值7.0，在115℃下灭菌15min。
15.所述高盐具体为含有3％-5％盐度的高盐条件。
16.本发明季也蒙毕赤酵母菌菌株(meyerozyma guilliermondii a3)在高盐偶氮染料废水无害化处理中的应用。
17.所述季也蒙毕赤酵母菌菌株(meyerozyma guilliermondii a3)在高盐偶氮染料废水无害化处理中的应用具体如下：
18.首先在液体培养基中对该菌进行富集培养，培养基组分：2g/l蔗糖、0.06 g/l蛋白胨、0.2g/l硫酸铵、0.5g/l磷酸二氢钾、0.2g/l硫酸镁、30g/l氯化钠、50mg/l偶氮染料，培养基使用之前经过灭菌处理；培养基初始ph值7.0，在115℃下灭菌15min；接种后在30-35℃恒温摇床150-160rpm转速条件下振荡培养12h得到对数期菌悬液，通过离心的方式收集菌细胞并用ph＝7.2的0.02 m磷酸缓冲溶液清洗3次，然后接种至摇瓶中对实际印染废水进行处理，接种量为2g/l(干重浓度)，在30℃恒温摇床中、160rpm的转速条件下振荡培养，印染废水主要污染指标包括：cod＝1443.10mg/l、nh
3-n＝3.55mg/l、tn＝180.50 mg/l、tds＝2345.56mg/l、ph＝4.03，模拟处理过程考察了对原浓度、1/2浓度及1/4浓度原水的处理效果，处理前将ph调节为7.0左右，处理时间12-24h。
19.本发明从自然高盐环境(海泥)样本中，经定向驯化、分离纯化筛选得到一株能够在高盐条件下高效降解偶氮染料的酵母菌，经系统鉴定其为季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3。实验结果表明，其能在高盐(含3％
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5％nacl)条件下好氧降解脱色多种常见水溶性偶氮染料，其中对含有双萘环结构的酸性红b降解效果最佳，可在8h内完全降解脱色50mg/l酸性红b。在降解过程中，季也蒙毕赤酵母菌菌株能够显著破坏染料分子中的芳环结构，生成更易降解的链状有机物，因而达到了对其深度降解的效果。该季也蒙毕赤酵母菌菌株可用于修复/处理受偶氮染料污染的土壤、水体/废水，尤其是在高盐条件下，利用耐盐季也蒙毕赤酵母菌菌株在高效降解偶氮染料的相关研究截至目前尚属首例。
20.本发明与现有技术相比的有益效果是：
21.本发明提供季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3具有广谱的偶氮染料降解能力，对不同类型水溶性偶氮染料具有较高脱色效率，同时能够耐受高盐度。该季也蒙毕赤酵母菌菌株培养方法简单，生长迅速，环境适应性强。该季也蒙毕赤酵母菌菌株用于含偶氮染料的高盐工业废水处理，能显著降低其急性毒性，展现出其在高盐染料废水处理方面的巨大应用潜力。可解决现有技术存在的问题，具有较好的工业化应用前景。
22.通过实验数据得到本发明提供的季也蒙毕赤酵母菌菌株生长细胞能够在12 h内对浓度为50mg/l的六种偶氮染料脱色率高达92.3％-99.6％，包括：酸性红b、酸性大红3r、酸性橙ii、酸性大红gr、活性艳红k-2g及活性紫kn-4r，对应的最高脱色率分别为99.6％、99.5％、94.4％、96.4％、92.3％和95.6％。对高浓度染料同样具有较高脱色效率，12h内对200mg/l酸性红b的脱色率高于 90％。
23.对代谢产物分析的结果表明，季也蒙毕赤酵母菌菌株能够有效破坏发色基团，并深度降解具有萘环、苯环结构的、性质更加稳定且毒性更强的中间产物，大大降低了出水的潜在危害性。
24.本发明所涉及季也蒙毕赤酵母菌菌株在含有3％-5％盐度(nacl)的高盐条件下具有较高降解效率，上述实验数据均为3％盐度条件下所得，而在5％盐度条件下对50mg/l酸性红b的12h脱色率同样在95％以上。
附图说明
25.图1为meyerozyma guilliermondii a3的系统发育树图；
26.图2为meyerozyma guilliermondii a3的生长曲线图；
27.图3为meyerozyma guilliermondii a3细胞的扫描电镜照片；
28.图4为meyerozyma guilliermondii a3生长细胞对不同浓度酸性红b的降解曲线图；
29.图5为meyerozyma guilliermondii a3对不同偶氮染料的降解曲线图；
30.图6为meyerozyma guilliermondii a3对实际印染废水处理前后颜色变化；其中：1为原废水；2为原浓度废水处理前；3为原浓度废水处理12h后；4为原浓度废水处理24h后；5为1/2浓度废水处理前；6为1/2浓度废水处理12h 后；7为1/2浓度废水处理24h后；8为1/4浓度废水处理前；9为1/4浓度废水处理12h后；10为1/4浓度废水处理24h后；
31.图7为meyerozyma guilliermondii a3对实际印染废水cod的去除效果(24 h)；
32.图8为meyerozyma guilliermondii a3对酸性红b降解前后的紫外-可见全波长扫描图谱对照图；
33.图9为meyerozyma guilliermondii a3对酸性红b的可能代谢产物液相色谱
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质谱联用分析质谱图a；其中：a为4-肼基萘-1-苯磺酸；b为4-氨基萘-1-苯磺酸；c为3,4-二羟基萘-1-磺酸/2,4-二羟基萘-1-磺酸；
34.图10为meyerozyma guilliermondii a3对酸性红b的可能代谢产物液相色谱
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质谱联用分析质谱图b；其中：d为3,7-二羟基-六苯化萘-2,6(1h,7h)-二醇；e 为(2z,4z)-六-2,4-二烯二酸/(2e,4z)-2-羟基-6-氧合六-2,4-双烯酸；f为1-苯乙烯醇；
35.图11为meyerozyma guilliermondii a3在不同盐度下对酸性红b的降解曲线图。
具体实施方式
36.下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
37.实施例1：本发明季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3的筛选
38.本发明所涉及的季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3分离自辽宁省大连市沙河口区黑石礁海滨公园海滩近排污口海泥样品。海泥样品取回后，首先经筛分去除沙粒等大颗粒杂质并经均质化预处理后，以20％(w/v) 接种量接种至选择性培养基中，培养基成分为：2g/l蔗糖、0.06g/l酵母浸粉、 0.2g/l硫酸铵、0.5g/l磷酸二氢钾、0.2g/l硫酸镁、30g/l氯化钠、50mg/l酸性红b，初始ph值7.0，在115℃下高温高压灭菌15min，接种后于30℃、160 rpm条件下振荡培养直至染料完全褪色。通过低温高速离心(4℃，10000rpm， 10min)的方式将固液分离，保留固体并与等体积新鲜培养基混合均匀后继续培养至染料完全褪色。重复上述过程约30d，驯化出稳定、高效的耐盐偶氮染料降解菌群。取混合样品，利用平板稀释涂布法，将混合菌群悬液均匀涂布在固体培养基平板上以进行菌种分离，并于30℃条件下静置培养72h后，从固体培养基表面挑取单菌落于液体培养基中进行培养以验证其是否具有染料脱色能力，择具有染料脱色能力的菌株继续进行平板涂布分离以对其进行纯化，最终筛选得到一株纯菌，命名其为a3。
39.季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3的26s rdna分子鉴定
40.委托生工生物工程(上海)股份有限公司对菌株(a3)进行分子鉴定，获得该菌株的26s rdna基因序列，将其与美国国立生物技术信息中心(ncbi)的 genbank数据库中已登录物种序列进行比对(blast相似性分析)，发现其与季也蒙毕赤酵母meyerozyma guilliermondii miba775(mn224038)基因序列相似性达100％，故鉴定其为季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3，其系统发育树见图1。meyerozyma guilliermondii a3的26s rdna序列(genebank 序列号为mt122798)如seq id no:1所示。
41.季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3的富集培养
42.利用实施例1中的培养基，经115℃高温高压灭菌15min后接种，并在30℃、 160rpm条件下振荡培养直至染料完全褪色，期间同时监测菌株的生长及染料的降解情况，利用分光光度法，分别以菌悬液在600nm下的吸光度及上清液在516 nm下的吸光度代表菌量(浓度)及残余染料浓度。结果表明，菌株在0-4h处于适应期，而后生长及代谢速度开始加快，进入对数期，并在12h左右达到最大生长量，而后逐渐进入稳定期(14-16h)，结果如图2所示。
43.季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3的细胞形态特征
44.取5ml处于对数期末期的菌液，于4℃、10000rpm条件下离心10min后，弃去上清液，用ph＝7.2、浓度为0.02mol/l的磷酸缓冲溶液清洗菌细胞3次，然后重悬于5ml浓度为5％(v/v)的戊二醛水溶液中，在4℃条件下静置过夜以固定细胞形态。细胞形态固定后，于4℃、12000rpm条件下离心15min后，弃去上清液，随后依次用30％、50％、75％、90％、95％(v/v)的乙醇水溶液进行脱水处理，每次首先将菌细胞与乙醇水溶液充分混匀，再通过离心的方式弃去上清液，离心条件同上，最后加入100％乙醇中，于4℃下保存备用。利用导电胶将样品粘附于样品台上，通过真空离子溅射喷镀金膜后，利用扫描电子显微镜进行形态观察，结果如图3所示。
45.应用例1：季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3对高浓度酸性
红b的降解脱色
46.在实施例1中培养基基础上，将酸性红b浓度分别提升为50mg/l、100 mg/l、150mg/l、200mg/l、250mg/l、300mg/l，在250ml锥形瓶中盛装100 ml培养基并灭菌、接种后，监测染料浓度随时间的变化：在不同时间点(0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h)取出5ml样品，于4℃、10000rpm条件下离心15min后取上清液，利用分光光度计测定酸性红b特征吸收波长(516nm) 下的吸光度，根据标准曲线即可计算染料浓度及脱色率。结果表明，季也蒙毕赤酵母菌菌株对更高浓度染料同样具有较强脱色能力，12h对200mg/l酸性红b 脱色率可达90％以上，结果如图4所示。
47.应用例2：季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3对酸性大红3r的降解脱色
48.在实施例1中培养基基础上，将酸性红b替换为等浓度的酸性大红3r，在 250ml锥形瓶中盛装100ml培养基并灭菌、接种后，监测目标染料浓度随时间的变化：在不同时间点(0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h)取出5ml样品，于4℃、10000rpm条件下离心15min后取上清液，利用分光光度计测定酸性大红3r特征吸收波长(507nm)下的吸光度，根据标准曲线即可计算染料浓度及脱色率。结果表明，12h内对酸性大红3r的脱色率高达99.5％，结果如图 5所示。
49.应用例3：季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3对酸性大红gr的降解脱色
50.在实施例1中培养基基础上，将酸性红b替换为等浓度的酸性大红gr，在 250ml锥形瓶中盛装100ml培养基并灭菌、接种后，监测目标染料浓度随时间的变化：在不同时间点(0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h)取出5ml样品，于4℃、10000rpm条件下离心15min后取上清液，利用分光光度计测定酸性大红gr特征吸收波长(511nm)下的吸光度，根据标准曲线即可计算染料浓度及脱色率。结果表明，12h内对酸性大红gr的脱色率高达96.4％。
51.应用例4：季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3对酸性橙 ii的降解脱色
52.在实施例1中培养基基础上，将酸性红b替换为等浓度的酸性橙ii，在250 ml锥形瓶中盛装100ml培养基并灭菌、接种后，监测目标染料浓度随时间的变化：在不同时间点(0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h)取出5ml样品，于4℃、10000rpm条件下离心15min后取上清液，利用分光光度计测定酸性橙 ii特征吸收波长(484nm)下的吸光度，根据标准曲线即可计算染料浓度及脱色率。结果表明，12h内对酸性橙ii的脱色率高达94.4％。
53.应用例5：季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3对活性艳红k-2g的降解脱色
54.在实施例1中培养基基础上，将酸性红b替换为等浓度的活性艳红k-2g，在250ml锥形瓶中盛装100ml培养基并灭菌、接种后，监测目标染料浓度随时间的变化：在不同时间点(0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h)取出5ml 样品，于4℃、10000rpm条件下离心15min后取上清液，利用分光光度计测定活性艳红k-2g特征吸收波长(509nm)下的吸光度，根据标准曲线即可计算染料浓度及脱色率。结果表明，12h内对活性艳红k-2g的脱色率高达92.3％。
55.应用例6：季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3对活性紫 kn-4r的降解脱色
56.在实施例1中培养基基础上，将酸性红b替换为等浓度的活性紫kn-4r，在250ml锥形瓶中盛装100ml培养基并灭菌、接种后，监测目标染料浓度随时间的变化：在不同时间点(0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h)取出5ml 样品，于4℃、10000rpm条件下离心15min后取上清液，利用分光光度计测定活性紫kn-4r特征吸收波长(545nm)下的吸光度，根据标准曲线即可计算染料浓度及脱色率。结果表明，12h内对活性紫kn-4r的脱色率高达95.6％。
57.应用例7：季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3对实际印染废水的处理
58.在液体培养基中对该菌进行富集培养，培养基组分：2g/l蔗糖、0.06g/l蛋白胨、0.2g/l硫酸铵、0.5g/l磷酸二氢钾、0.2g/l硫酸镁、30g/l氯化钠、50 mg/l偶氮染料，培养基使用之前经过灭菌处理；培养基初始ph值7.0，在115℃下灭菌15min；接种后在30-35℃恒温摇床150-160rpm转速条件下振荡培养12 h得到对数期菌悬液，通过离心的方式收集菌细胞并用ph＝7.2的0.02m磷酸缓冲溶液清洗3次，然后接种至摇瓶中对实际印染废水进行处理，接种量为2g/l (干重浓度)，在30℃恒温摇床中、160rpm的转速条件下振荡培养，印染废水主要污染指标包括：cod＝1443.10mg/l、nh
3-n＝3.55mg/l、tn＝180.50mg/l、 tds＝2345.56mg/l、ph＝4.03，模拟处理过程考察了对原浓度、1/2浓度及1/4浓度原水的处理效果，处理前将ph值调节为7.0左右，处理时间为12-24h。结果表明，在无外加碳源的条件下，该菌对不同浓度稀释倍数的原水色度有一定程度去除，如图6所示，同时，对cod具有显著的去除效果，处理24h后对原浓度、1/2浓度及1/4浓度原水的cod去除率分别为73.2％、88.0％和96％，如图 7所示。
59.实验研究：季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3对酸性红 b的代谢产物分析
60.配制实施例1中培养基并灭菌、接种后，分别在培养0h、4h、8h、12h取样、离心(条件同上)，取上清液利用分光光度计进行全波长扫描，将四次全波长扫描结果在同一坐标系内进行比较。同时，取降解8h和12h上清液，利用 0.22μm水系聚醚砜滤膜过滤进一步去除杂质，取过滤液利用高效液相色谱-质谱联用仪分析可能的代谢产物。结果表明，目标染料的主要官能团吸收峰显著下降，说明其被分解，而在代谢产物分析过程中检测到链状化合物，说明有明显的开环过程，进一步说明染料分子被深度降解，结果如图8、9、10所示。
61.实验研究：盐度对季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3降解脱色酸性红b的影响
62.在实施例1中培养基基础上，将nacl浓度分别设置为0g/l、10g/l、30 g/l、50g/l、70g/l、100g/l，在250ml锥形瓶中盛装100ml培养基并灭菌、接种后，监测目标染料浓度随时间的变化：在不同时间点(0h、4h、8h、12h) 取出5ml样品，10000rpm离心15min后取上清液，利用分光光度计测定染料在其特征吸收波长下的吸光度，根据标准曲线即可计算染料浓度及脱色率。结果表明，季也蒙毕赤酵母菌菌株meyerozyma guilliermondii a3能够在不高于5％的盐度条件下维持较高(8h内高于95％)的脱色率，在7％和10％盐度条件下仍可在12h内达到80％以上脱色率，说明其具有较高耐盐性，结果如图11所示。
63.以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。