自由联结的管式基因芯片及其在疾病检测中的应用的制作方法

1.本发明涉及一种基因芯片及其应用，特别是一种可以自由联结的管式基因芯片及其在鲤鱼病毒性疾病检测中的应用，本发明是以管道为膜载体以及分子杂交反应场所的模式。


背景技术：

2.基因芯片技术是20世纪80年代末出现并在20世纪90年代迅速发展起来的一项高新技术，仅十几年的时间就成为了对生命科学有着巨大影响的因子。随着基因技术的普遍应用，对于基因检测的准确度,速度，同量化的要求也越来越高。可以自由联结的管式基因芯片作为一种新型的基因检测技术，它同时具有操作简单，检测数量大，准确性高等优点，能过更好的满足现代科技发展的需求。
3.水产品是优质蛋白的重要来源，是餐桌上不可缺少的美味。随着生活水平的提高，人们对于水产品的消费需求也越来越大，传统渔业已经不够满足市场需求，因此现代水产养殖业迎来了高速发展的机遇。然而水产养殖业的高速发展也带来许多技术问题，其中就包括水产动物疾病的发生，水产动物苗种的疫病检测对于水产疾病的预防非常有效。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种可以自由联结的管式基因芯片，它可以减少反应面，节省试剂材料，同时还提高了芯片的灵敏度，实现高通量作业。可以使分子杂交反应过程的简便快捷。
5.本发明所要解决的另一个技术问题是提供前述管式基因芯片在鲤鱼病毒性疾病检测中的应用。
6.本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明一种可以自由联结的管式基因芯片及其在鲤鱼病毒性疾病检测中的应用，其特点是：它是以管道为膜载体以及杂交反应场所的模式，包括：（1）带有鲤鱼病毒性疾病序列探针的纤维膜；（2）竹节状的纤维膜载体管道；（3）96孔板状加液通道；（4）连接抽吸泵的废液收集盒。
7.本发明所述的可以自由联结的管式基因芯片，其进一步优选的技术方案是：所述的带有鲤鱼病毒性疾病序列探针的纤维膜，依据ncbi上提供的相应鲤鱼病毒性疾病病毒序列设计的正反引物以及探针引物；正反引物用于患病鲤鱼cdna模板的扩增，将探针引物做上显色标记固定在纤维膜上，扩增后的cdna模板与引物探针进行杂交，通过观察显色反应来判断检测结果；带有鲤鱼病毒性疾病序列探针的纤维膜的孔隙可以透过整个反应的所有试剂。
8.本发明所述的可以自由联结的管式基因芯片，其进一步优选的技术方案是：所述
的竹节状的纤维膜载体管道，管道上端内径为3.5mm，下端外径为3.5mm，管道高度为5mm，纤维膜固定在管道的上端，每一竹节状管道下端都可与另一管道的上端契合联结。
9.本发明所述的可以自由联结的管式基因芯片，其进一步优选的技术方案是：所述的96孔板状的加液通道，其尺寸与普通96孔板相同，不同点在于每个孔的下方有1cm的柱状通道用于暂存反应试剂，通道的下端外径为3.5mm，用以联结膜载体管道。
10.本发明所述的可以自由联结的管式基因芯片，其进一步优选的技术方案是：所述的连接抽吸泵的废液收集盒厚度为1cm，盒的上方与96孔板状的加液通道的样式和尺寸相同，因检测样本数的差异会使孔和通道不在工作状态，所以有1孔和8孔两种规格的孔塞将不工作的孔堵住；盒下方有通道连接抽吸泵，在杂交反应过程将废液吸出。
11.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1、本发明可以将需要在平面空间进行的杂交反应集中到管道中进行，相比于普通的平面基因芯片，本发明减少反应面，节省试剂材料，同时还提高了芯片的灵敏度，实现高通量作业。可以使分子杂交反应过程的简便快捷。
12.2、自由联结的管式基因芯片是一种以管道为反应场所的新型芯片载体模式，将带有探针的纤维素膜以横截面的形式固定在管道中，管道材料为透明塑料，粗细于笔芯近似，管道形状为竹节式，在进行多指标反应时可将管道首尾相连，反应物从首节管道进入，在金属浴中采用真空压缩或抽吸等方法使反应物逐节渗透，同时反应。结果表现方式可采用机器采集信号式或变色信号。
13.3、自由联结的管式基因芯片相较于平面芯片的优势在于灵敏度高，因为反应物进入管道后只会分布到点探针上而不会浸入非反应区域的膜载体上。管式基因芯片还具有高通量的特点，管道竖直摆放在机器中，所占位置小。
附图说明
14.图1为废液收集盒的一种结构示意图；图2为竹节状的纤维膜载体管道的一种结构示意图。
具体实施方式
15.以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
16.实施例1，一种自由联结的管式基因芯片，它是以管道为膜载体以及杂交反应场所的模式，且包括：（1）带有鲤鱼病毒性疾病序列探针的纤维膜1；（2）竹节状的纤维膜载体管道（参照图2），每节管道上固定一张带有一种探针的纤维膜1；（3）96孔板状加液通道；（4）连接抽吸泵的废液收集盒（见图1）。
17.所述的带有鲤鱼病毒性疾病序列探针的纤维膜，依据ncbi上提供的相应鲤鱼病毒性疾病病毒序列设计的正反引物以及探针引物；正反引物用于患病鲤鱼cdna模板的扩增，将探针引物做上显色标记固定在纤维膜上，扩增后的cdna模板与引物探针进行杂交，通过
观察显色反应来判断检测结果；带有鲤鱼病毒性疾病序列探针的纤维膜的孔隙可以透过整个反应的所有试剂。
18.所述的竹节状的纤维膜载体管道，管道上端内径为3.5mm，下端外径为3.5mm，管道高度为5mm，纤维膜固定在管道的上端，每一竹节状管道下端都可与另一管道的上端契合联结，根据检测要求选取带有特定目的病毒基因探针的竹节管道组装联结。
19.所述的96孔板状的加液通道，其尺寸与普通96孔板相同，不同点在于每个孔的下方有1cm的柱状通道用于暂存反应试剂，通道的下端外径为3.5mm，用以联结膜载体管道。
20.所述的连接抽吸泵的废液收集盒厚度为1cm，盒的上方与96孔板状的加液通道的样式和尺寸相同，因检测样本数的差异会使孔和通道不在工作状态，所以有1孔和8孔两种规格的孔塞将不工作的孔堵住；盒下方有通道连接抽吸泵，在杂交反应过程将废液吸出。
21.所述的自由联结的管式基因芯片在鲤鱼病毒性疾病检测中的应用。
22.实施例2，自由联结的管式基因芯片应用实验：实施时，可以分为四个步骤：（1）采用试剂盒方法提取患病鲤鱼样本dna及rna，将pcr扩增得到的产物保存以备用；（2）选取相应的管道探针组装，将不用的孔堵住；（3）加入反应试剂及dna样本，放入机器进行反应；（4）反应结束后将管道拆开，查看芯片显色结果。下面进行具体的说明，以使本领域技术人员进一步理解本发明。
23.发明人于2021年在江苏海洋大学海洋科学与水产学院病害实验室进行实验，检测对象为鲤鱼和草鱼，所设计的检测项目包括鲤浮肿病（carp edema virus,cev）、鲤春病毒血症（spring viraemia of carp ，svc）、鲤疱疹病毒二型（cyhv-2/ghfnv）、鲤疱疹病毒三型（cyhv-3/khv）、草鱼呼肠孤病毒一型（gcrv-1）、草鱼呼肠孤病毒二型（gcrv-2）、草鱼呼肠孤病毒三型（gcrv-3）,利用合成的质粒样本以及病鱼样本进行能力验证。能力验证主要包括两部分，一是引物探针的特异性和灵敏度检测，二是芯片的实际应用。
24.竹节管道上带有编号以表示不同类别的探针，将探针固定在纤维膜上，并将纤维膜装在对应的竹节管道里。实验过程中在96孔板处依次加入所需试剂及样本dna，按程序设定将装置放进特定尺寸的混匀震荡仪中进行反应，待实验结束之后将竹节管道拆开读取实验结果。
25.实验一：第一部分的实验是芯片特异性验证，实验的具体内容为将质粒稀释成1000pg和10pg两种浓度进行扩增反应；7种探针分别与7种引物质粒的扩增产交叉组合得到49个组合项进行杂交反应，每个组合项做三个平行即每个空对应三节相同的探针管道，此操作同时还能检测纤维膜的透性以及同孔不同位置管道反应的结果差别，两种浓度质粒的扩增产物进行分别进行此项实验。
26.具实验结果显示引物探针的特异性和灵敏度都达到预期效果，纤维膜的通透性也达到要求。
27.实验二2021年6月至10月在连云港的11个养殖池塘取样35条病鱼样本用于验证芯片在实
际中的运用，经水生动物防疫标准汇编中的方法检测35个样本的患病情况，共测出cev、svc和gcrv-2三种疾病。取病鱼样本的腮、肌肉以及肝脏进行dna提取用于杂交反应，结果均为阳性。