水稻OsNAC2基因在调控水稻叶片夹角中的应用

水稻osnac2基因在调控水稻叶片夹角中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及一种水稻osnac2基因在调控水稻叶片夹角中的应用。


背景技术：

2.在耕地面积有限的年代里，如何更加有效利用有限的耕地来提高作物的单位产量成为育种学家们的研究热点。除了提高作物的单株产量外，通过改良作物株型来提高作物的种植密度也是一个重点的作物改良方向。水稻的株型由株高、分蘖、叶片长度、叶夹角和穗型这几方面来决定。其中叶夹角与作物的种植密度有关，叶夹角小的作物，叶片直立株型紧凑，可以有效的提高种植密度进而提高水稻的单位产量。
3.叶夹角是指叶片与叶鞘之间的倾斜度，主要由叶片与叶鞘连接处叶枕的细胞形态来决定。叶枕近轴侧的细胞分裂增多或者细胞伸长都会导致叶夹角变大。此外，叶枕作为叶片向上生长的主要承重器官，其细胞的正常生长也对叶片的倾斜度至关重要。当叶枕细胞的次生细胞壁不能正常形成时，叶枕的机械强度变低，无法支撑叶片的直立生长从而导致叶片下垂，叶夹角增大。
4.近年来，许多调控叶夹角的基因被克隆鉴定，例如osdwarf4、brassinosteroid insensitive 1(osbri1)、rice leaf inclination3(lc3)和auxin response factors19(arf19)等。这些基因的突变体主要通过调控植物激素的含量和信号转导来参与水稻叶夹角的调节。osdwarf4是油菜素内酯(br)合成的关键基因，其功能缺失突变体dwarf4-1的叶夹角变小，叶片更直立。osbri1的突变体d61体内br信号传导受阻导致叶夹角变小。lc3可以与lc3-interacting protein 1(lip1)蛋白互作来抑制osiaa12和生长素代谢相关基因osgh3.2的表达，进而影响了生长素的信号转导和下调了生长素的含量来抑制叶枕近轴侧的细胞生长导致叶夹角变小。许多研究都表明，油菜素内酯可以促进叶枕近轴侧细胞的伸长来正向调控水稻的叶夹角。而生长素可以调节叶枕处的细胞生长分裂来负调控叶夹角大小，此外生长素还参与了叶枕处的次生细胞壁形成来调节叶枕的机械强度。但植物激素调节叶夹角是个复杂的过程，其中涉及了许多个基因和多种激素的参与。
5.osnac2转录因子属于nac转录因子家族。水稻基因组包含了151个nac基因，是水稻中最大的转录因子家族之一，nac转录因子家族广泛地参与了水稻生长发育的各个进程，包括植物激素信号转导、叶片衰老以及一些非生物胁迫应答等。但是大多数osnac转录因子的功能尚不清楚，还有待研究。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种水稻osnac2基因在调控水稻叶片夹角中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明首次将osnac2应用到水稻的叶夹角调节，通过crispr/cas9技术敲除osnac2后能使植株的叶夹角显著变小，有助于了解叶夹角的调控机理，为水稻理想株型的开发和改良奠定基础。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明提供一种osnac2蛋白或其相关生物材料在调控水稻叶片夹角中的应用，
9.所述osnac2蛋白为氨基酸序列为seq id no.2的蛋白质；
10.所述相关生物材料为能够表达所述osnac2蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
11.进一步地，所述osnac2蛋白或其编码基因在所述水稻中的表达量和/或活性越高，所述水稻的叶片夹角越大；所述osnac2蛋白或其编码基因在所述水稻中的表达量和/或活性越低，所述水稻的叶片夹角越小。
12.进一步地，所述osnac2蛋白的编码基因为seq id no.1所示的dna分子。
13.本发明还提供一种培育叶片夹角更小的水稻的方法，包括使受体水稻中osnac2蛋白的表达量和/或活性降低的步骤；所述osnac2蛋白为氨基酸序列为seq id no.2的蛋白质。
14.进一步地，包括如下步骤：对受体水稻中osnac2蛋白的编码基因进行抑制表达，得到转基因水稻；所述转基因水稻与所述受体水稻相比叶片夹角更小。
15.本发明还提供一种培育叶片夹角更大的水稻的方法，包括使受体水稻中osnac2蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；所述osnac2蛋白为氨基酸序列为seq id no.2的蛋白质。
16.进一步地，包括如下步骤：向受体水稻中导入能够表达osnac2蛋白的核酸分子，得到转基因水稻；所述转基因水稻与所述受体水稻相比叶片夹角更大。
17.进一步地，所述能够表达osfd2蛋白的核酸分子为osnac2蛋白的编码基因，是seq id no.1所示的dna分子。
18.本发明还提供一种osnac2基因或其表达的蛋白在水稻育种中的应用，所述osnac2基因用于对水稻叶片夹角性状进行改良，改良水稻株型，调节水稻种植密度；所述osnac2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，其表达的蛋白的序列如seq id no.2所示。
19.进一步地，将osnac2基因过表达载体转化水稻植株，获得水稻叶片夹角变大的转基因水稻；或者将osnac2基因敲除载体转化水稻植株，获得水稻叶片夹角变小的转基因水稻。
20.本发明公开了以下技术效果：
21.本发明通过构建osnac2过表达载体来实现osnac2在转化水稻中过表达，得到的植株叶片下垂，叶夹角增大；通过构建osnac2的crispr/cas9基因敲除载体转化到水稻中花11号中，得到植株叶夹角变小，叶片直立，可以提高水稻的种植密度，具有提高水稻的群体光合效率，提高产量的潜在价值。
22.本发明首次将osnac2应用到水稻的叶夹角调节，通过crispr/cas9技术敲除osnac2后能使植株的叶夹角显著变小，有助于了解叶夹角的调控机理，为水稻理想株型的开发和改良奠定基础。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施
例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1野生型中花11号和osnac2过表达突变体抽穗期剑叶的叶夹角表型图；
25.图2野生型中花11号和osnac2过表达突变体抽穗期的剑叶夹角；
26.图3野生型中花11号和osnac2过表达突变体叶枕处的实时荧光定量pcr结果；
27.图4基因敲除osnac2突变体中突变位点；
28.图5野生型中花11号和osnac2基因敲除突变体灌浆期剑叶的叶夹角表型图；
29.图6野生型中花11号和osnac2突变体灌浆期剑叶夹角。
具体实施方式
30.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
31.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
32.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
33.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
34.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
35.本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
36.供试的水稻品种为水稻粳稻品种中花11，即水稻(oryza sativa l.)cv.中花11。
37.通过调控水稻转录因子osnac2在水稻中的表达水平来调控水稻叶夹角大小的方法。通过组成型启动子驱动水稻osnac2的编码基因，并通过农杆菌侵染水稻愈伤转化到水稻中上调osnac2的表达，获得叶夹角增大的水稻植株。通过构建水稻osnac2的crispr/cas9基因敲除载体，转化入水稻后获得osnac2功能缺失突变体，从而获得叶片直立株型紧凑的水稻。具体方法如下：
38.1、从国家水稻数据中心(https://www.ricedata.cn/)中得到osnac2基因(loc_os04g38720)，其osnac2基因的序列如seq id no.1所示，编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，设计相应引物扩增水稻cdna以获得osnac2基因的cdna。
39.引物序列为：
40.osnac2-f:atgccgcaagcctcctcctcct
41.osnac2-r:ttagccgtgcccaaattgttgg
42.seq id no.1(水稻(oryza sativa)osnac2 cdna全长)：
[0043][0044]
seq id no.2(水稻(oryza sativa)osnac2蛋白质序列)：
[0045]
meqhqgqagmdlppgfrfhptdeelithylakkvadarfaalavaeadlnkcepwdlpslakmgekewyffclkdrkyptglrtnratesgywkatgkdkdifrrkalvgmkktlvfytgrapkgeksgwvmheyrlhgklhaaalgflhgkpassknewvlcrvfkkslvevgaaggkkaavvtmemarggstsssvadeiamssvvlpplmdmsgagagavdpattahvtcfsnalegqffnptavhghgggdsspfmasftqygqlhhgvslvqllescngygglvdmaasgsqlqpaacggererlsasqdtgltsdvnpeissssgqkfdheaalwgy.
[0046]
2、水稻osnac2过表达载体构建
[0047]
在水稻的cdna文库中克隆扩增后，用genstar公司的dna回收试剂盒回收并纯化得到osnac2基因。将纯化的dna片段连接至载体pox载体中(本实验室保存)，转化e.coli dh5a感受态细胞，挑选阳性单菌落克隆提质粒，通过测序鉴定后获得osnac2的过表达载体。
[0048]
用农杆菌侵染水稻中花11号植株愈伤组织，诱导分化成苗，获得已转化osnac2过表达载体的转基因植株。通过trizol抽提法提取已经转化nac2过表达载体的zh11和野生型
wt的rna。取2μg的rna进行反转录获得cdna。
[0049]
设计osnac2特异性引物：
[0050]
q-nac2-f：gggccagttctttaacccga
[0051]
q-nac2-r：ctctccaggagttgcaccag
[0052]
以ubq作为内参基因，反转录得到的cdna为模板，用osnac2特异性引物进行实时荧光定量pcr。获得两株osnac2表达量显著上调的的转基因植株，记为oe1和oe2。
[0053]
3、水稻osnac2的crispr/cas9基因敲除载体构建
[0054]
根据crispr/cas9基因编辑技术原理，通过数据库和工具网站分析，分别在osnac2基因的基因组核苷酸序列的第二外显子内选取ngg，在目标基因靠前的位置选取osnac2基因的特异性grna的靶标序列aggacaaggacatcttcaga，为了使转基因株系在靠前的位置进行打靶突变。
[0055]
grna靶标序列的接头引物为：
[0056]
f：aggacaaggacatcttcaga
[0057]
r：cgtcgtcctccctccgctga
[0058]
通过第一轮pcr将靶点序列引入到u3/u6启动子下游和sgrna序列的上游，用第二轮通用引物进行pcr扩增将启动子、靶点和sgrna构建成完整的表达盒。最后通过边切边连的方将sgrna表达盒组装到crispr/grna载体中(刘耀光院士提供，本实验室保存)，转化e.coli dh5a感受态细胞，挑选阳性单菌落克隆提质粒，通过测序鉴定后获得osnac2的敲除载体。
[0059]
将敲除载体通过农杆菌介导的方法导入水稻中花11号植株。以中花11号植株愈伤组织为转化受体，转化后经过组织培养获得完整再生植株，得到osnac2基因功能缺失的转基因植株，即osnac2位点发生突变的纯合植株。
[0060]
提取含有潮霉素抗性的转基因植株基因组dna，用含有靶位点osnac2的引物对其进行pcr扩增，pcr产物测序验证。
[0061]
nac2-ct f：gggccagttctttaacccga
[0062]
nac2-ct r：ctctccaggagttgcaccag
[0063]
对比测序结果发现，得到两株纯合突变体的转化植株。一个突变体cr-nac2 1在seq id no.1所示的osnac2基因的第305个碱基开始缺失插入替换7个的核苷酸序列(得到的序列如seq id no.3所示)；另一个突变体cr-nac2 3在seq id no.1所示的osnac2基因的第276个碱基开始缺失35个核苷酸序列(得到的序列如seq id no.4所示)。
[0064]
针对突变体cr-nac2 1，osnac2基因因经历了上述移码突变，在osnac2基因的第334-336位的核苷酸序列可转录成终止密码子。针对突变体cr-nac2 3，osnac2基因因经历了上述移码突变，在osnac2基因的第694-696位的核苷酸序列可转录成终止密码子。
[0065]
seq id no.3：
[0066][0067]
seq id no.4：
[0068][0069][0070]
4、将水稻osnac2过表达突变体和功能缺失突变体以及野生型的水稻中花11号植株种植在大田中，观察整个生长周期内水稻osnac2突变体系植株和中花11号的表型差异。观测结果如图所示，与中花11号植株(zh11)相比，nac2过表达株系oe1和oe2植株均出现叶片夹角增大的表型(图1和图2)，而osnac2敲除突变株系cr-nac2 1和cr-nac2 3(图3)植株的均出现叶片夹角变小的表型(图4和图5)。从而证明osnac2基因参与调控水稻的叶夹角。
[0071]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。