嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原的制备方法及含有该重组蛋白抗原的试剂盒

1.本技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原的制备方法及含有该重组蛋白抗原的试剂盒。


背景技术：

2.嗜吞噬细胞无形体(anaplasma phagocytophilum)属立克次体目无形体科的专性细胞内寄生菌，可引起人粒细胞无形体病(hga)。该病最初发现于1994年美国的一名不明原因发热症患者。我国于2008年在安徽省首次证实hga的存在。嗜吞噬细胞无形体在机体中指向性地感染中性粒细胞，且具有在细胞质中形成类似于桑葚(morula)的寄生性空胞(包涵体)进行复制增殖等特点。嗜吞噬细胞无形体表面有一种关联抗原变异的p44主要外膜蛋白群，是该菌的主要抗原蛋白。无形体基因组中存在113个p44主要外膜蛋白的相同性基因(p44多基因家族)的重复序列。这些相同性基因在基因组的某个主要表达领域易发生交换，从而使机体出现不同的p44外膜蛋白产生抗原变异。
3.目前临床中较为直接的检测方法为血涂片染色法，间接荧光抗体试验(indirect fluorescence antibody，ifa)和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)等免疫学方法，此外聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction，pcr)也常用于嗜吞噬细胞无形体的检测，是一种用于检测嗜吞噬细胞无形体病最为敏感和特异性较高的检测方法。但是上述的免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(elisa)、聚合酶链反应(pcr)技术等方法耗时长、检测条件要求高、需要特定的仪器。
4.2013年的一项研究表明，作为抗原的受感thp-1组织培养细胞的反应性优于受感hl60细胞，即受感thp-1和hl60细胞间存在抗原差异[emerg infect dis，2013，19(2)：289～292]，且利用作为抗原的受感thp-1中分离出的rp44-47e蛋白在检测hga疾病时具有良好的敏感性，若能制成含有rp44-47e蛋白的试剂盒，用以改善上述免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(elisa)、聚合酶链反应(pcr)技术等方法的不足。


技术实现要素：

[0005]
本技术提供一种嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原的制备方法及含有该重组蛋白抗原的试剂盒，用以解决上述现有对人粒细胞无形体病检测方法灵敏度低、检测方法耗时长的问题，本技术用于快速检测嗜吞噬细胞无形体感染者血清中的特异抗体，为hga的快速、简便检测提供可靠的依据。
[0006]
第一方面，本技术提供一种嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原的制备方法，包括：
[0007]
s101、含有p44基因的基因片段的反转录及pcr扩增：利用rna提取试剂盒提取被嗜吞噬细胞无形体感染的受感thp-1培养细胞的rna，并以所提取出的rna为模板，反转录得到基因p44的cdna，然后对得到的cdna进行pcr扩增，第一轮扩增正向引物为：
[0008]
p3726f 5
′‑
gctaaggagttagcttatga-3
′
；
[0009]
反向引物为：
[0010]
p4183r 5
′‑
caatagt(c/t)ttagctagtaacc-3
′
；
[0011]
第二轮扩增正向引物为：
[0012]
p3761f 5
′‑
ctgctct(t/g)gccaa(a/g)acctc-3
′
；
[0013]
反向引物为：
[0014]
p4257r 5
′‑
agaagatcataacaagcattg-3
′
；
[0015]
s102、扩增产物的回收和克隆：利用琼脂糖凝胶电泳对上述s101的扩增产物进行分离、纯化、回收，得到回收产物；将得到的回收产物连接到pcr2.1表达载体上，得到重组pcr2.1表达载体，将重组pcr2.1表达载体转入受感细胞dh5α内，并在含有异丙基-β-d-硫代半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳糖苷的培养基上以蓝白斑法进行筛选分离，挑选白色菌落进行第一克隆增殖。
[0016]
s103、目标基因的提取及再确认：收集上述s102中第一克隆增殖后的受感细胞dh5α，提取出第一克隆增殖后的重组pcr2.1表达载体，并采用限制性内切酶ecorⅰ对第一克隆增殖后的重组pcr2.1表达载体进行切割，对插入的目标基因片段确认；将切割得到的目标基因进行第一测序，并收集经过第一测序后的目标基因。
[0017]
s104、重组蛋白抗原rp44-47e合成：利用in-fusion试剂盒将经过上述s103得到的第一测序后的目标基因连接到质粒ptd1，得到重组质粒p44-ptd1，再将重组质粒p44-ptd1转化到感受态细胞dh5α中，进行第二克隆增殖后提取重组质粒p44-ptd1进行pcr及酶切鉴定，将载有目标基因的阳性重组质粒p44-ptd1进行第二测序；经第二测序确认目标基因的核酸序列后，利用经第二测序确认的目标基因大量制备mrna，将所制得的mrna利用蛋白质合成试剂盒合成目标蛋白，并利用亲和色谱法对目标蛋白进行纯化，即可得到嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原rp44-47e。
[0018]
重组蛋白抗原rp44-47e的氨基酸序列为：序列表seq id no.1所示。
[0019]
可选地，s101中反转录条件为：37℃保持15分钟，85℃变性5秒。
[0020]
可选地，s101中第一轮扩增和第二轮扩增条件相同，均为94℃变性30秒，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，每轮扩增为45个循环。
[0021]
可选地，琼脂糖凝胶电泳的条件为：电压保持在3～5伏特/厘米，电泳时长为1～3小时；电泳所使用的染色剂为溴化乙啶。
[0022]
可选地，蓝白斑法筛选培养的条件为：培养温度为37℃，培养基为含有浓度为40～60μg/ml的氨苄青霉素的lb固体培养基，培养方式为倒置培养。
[0023]
第一克隆增殖和第二克隆增殖的培养基相同，均包括：10g胰化蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，1000ml去离子水，0.8～1.2g硫酸软骨素，1.2～1.8g l-精氨酸。
[0024]
第一克隆增殖和第二克隆增殖的培养条件相同，均为，37℃，220rpm恒温振荡培养8～10小时。
[0025]
可选地，第一测序采用循环阵列合成测序法进行测序，第二测序采用直接测序法测序。
[0026]
第二方面，本技术提供一种含有嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原的试剂盒，包括：上述第一方面的方法所制得的嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原rp44-47e。
[0027]
可选地，试剂盒包括检测卡，检测卡包括基片、样品垫、免疫金标垫、硝酸纤维素
膜、吸水垫；硝酸纤维素膜设置于基片上表面；硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线；硝酸纤维素膜顶部靠近质控线的一侧设置有吸水垫，靠近检测线的一侧设置有免疫金标垫；免疫金标垫的顶部设置有样品垫。
[0028]
可选地，免疫金标垫上浸润有嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原rp44-47e胶体金复合物，和兔igg胶体金复合物。
[0029]
检测线含有山羊抗人igm纯化蛋白或山羊抗人igg纯化蛋白或重组蛋白抗原rp44-47e。质控线含有羊抗兔igg纯化蛋白。
[0030]
可选地，质控线上羊抗兔igg纯化蛋白的浓度为0.8～1.2mg/ml。
[0031]
检测线上山羊抗人igm纯化蛋白或山羊抗人igg纯化蛋白或重组蛋白抗原rp44-47e的浓度为0.5～1.5mg/ml。
[0032]
本技术的嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原的制备方法，能单一、高效且大量制备嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原rp44-47e，所制备的嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原rp44-47e表达量和稳定性高，克服了p44全基因组抗原表达量低且不易制备的缺点。所制得的重组蛋白抗原rp44-47e作为抗原蛋白具有特异性高，能有效降低检测成本，易于标准化的特点。
[0033]
本技术的含有嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原的试剂盒，该试剂盒中的检测卡基于双抗原夹心胶体金免疫层析法制成，具有快速、便捷、成本低、特异性强、不易发生交叉反应等优点，克服了ifa、elisa、wb法等传统方法的检测时间长、需要昂贵检测仪器、不适于在基层使用的缺点，本技术的含有嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原的试剂盒，适于临床检测hga疾病，尤其是医疗条件有限的农村地区，本技术的试剂盒具有广阔的应用前景。
附图说明
[0034]
为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0035]
图1为本技术一实施例提供的一种嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原的制备方法的流程图；
[0036]
图2为本技术一实施例提供的抗原试剂盒中检测卡的示意图；
[0037]
图3为本技术一实施例探究硫酸软骨素和l-精氨酸对受感细胞dh5α增殖影响的生长曲线图。
具体实施方式
[0038]
为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，也属于本技术保护的范围。
[0039]
第一方面，如图1所示，本技术提供一种嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原的制备方法，包括：
[0040]
s101、含有p44基因的基因片段的反转录及pcr扩增：利用rna提取试剂盒提取被嗜吞噬细胞无形体感染的受感thp-1培养细胞的rna，并以所提取出的rna为模板，反转录得到含有p44基因的cdna，然后对得到的cdna进行pcr扩增，第一轮扩增正向引物为：
[0041]
p3726f 5
′‑
gctaaggagttagcttatga-3
′
；
[0042]
反向引物为：
[0043]
p4183r 5
′‑
caatagt(c/t)ttagctagtaacc-3
′
；
[0044]
第二轮扩增正向引物为：
[0045]
p3761f 5
′‑
ctgctct(t/g)gccaa(a/g)acctc-3
′
；
[0046]
反向引物为：
[0047]
p4257r 5
′‑
agaagatcataacaagcattg-3
′
。
[0048]
可选地，s101中反转录条件为：37℃保持15分钟，85℃变性5秒。
[0049]
可选地，s101中第一轮扩增和第二轮扩增条件相同，均为94℃变性30秒，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，每轮扩增为45个循环。
[0050]
本技术的方法中，首先用嗜吞噬细胞无形体感染受感thp-1细胞，对被感染的受感thp-1细胞进行培养增殖后，提取出嗜吞噬细胞无形体在表达蛋白时的总rna，此处提取总rna时可以用总rna提取试剂盒提取；并以该总rna中的mrna为模板，利用反转录酶反转录合成含有p44基因的cdna。此时合成的cdna在反转录过程中，先利用反转录酶在37℃条件下将mrna反转录成cdna，在85℃变性5秒，使反转录酶失活，终止反转录过程。
[0051]
将cdna利用pcr扩增技术进行两轮扩增，每轮扩增选择不同的引物，并对扩增得到的cdna的序列分析。在扩增过程中94℃变性30秒，使cdna的双链打开，打开的双链可成为扩增的模板。在55℃退火使系统温度降低，引物与dna模板结合，形成局部双链，72℃延伸，是在taq酶(在72℃左右，活性最佳)的作用下，以脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)为原料，从引物的3
′
端开始，以从5
′
到3
′
端的方向延伸，合成与模板互补的dna链。在扩增过程中使用引物，比如：
[0052]
第一轮扩增正向引物为：
[0053]
p3726f 5
′‑
gctaaggagttagcttatga-3
′
；
[0054]
反向引物为：
[0055]
p4183r 5
′‑
caatagt(c/t)ttagctagtaacc-3
′
；
[0056]
第二轮扩增正向引物为：
[0057]
p3761f 5
′‑
ctgctct(t/g)gccaa(a/g)acctc-3
′
；
[0058]
反向引物为：
[0059]
p4257r 5
′‑
agaagatcataacaagcattg-3
′
。使用引物可以特异性地将cdna进行扩增，降低错误率。
[0060]
s102、扩增产物的回收和克隆：利用琼脂糖凝胶电泳对上述s101的扩增产物进行分离、纯化、回收，得到回收产物；将得到的回收产物连接到pcr2.1表达载体上，得到重组pcr2.1表达载体，将重组pcr2.1表达载体转入受感细胞dh5α内，并在含有异丙基-β-d-硫代半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳糖苷的培养基上以蓝白斑法进行筛选分离，挑选白色菌落进行第一克隆增殖。
[0061]
可选地，琼脂糖凝胶电泳的条件为：电压保持在3～5伏特/厘米，电泳时长为1～3
小时；电泳所使用的染色剂为溴化乙啶。
[0062]
在扩增过程中会发生碱基的错误配对，也即扩增得到的基因不属于p44基因家族，因此需要将s101中经过pcr扩增得到的基因初选，分离出p44基因。琼脂糖凝胶电泳可以对基因进行初步分离，所用的显色剂一般是溴化乙啶，在琼脂糖凝胶电泳的条带上分离出属于p44基因的显色条带，将该条带溶解提取出p44基因，并回收得到回收产物。将回收产物和pcr2.1表达载体利用同种限制性内切酶分别切割，可以使用的限制性内切酶有bam h i、hindⅲ、hpaⅱ、mbo i等中的一种。为降低载体的自连概率，提高重组率可采用双酶切的方法，即同时采用上述限制性内切酶中的两种，对回收产物和pcr2.1表达载体同时切割。接着将切割后的回收产物和pcr2.1表达载体利用连接酶连接，一般选用t4连接酶。连接完成后即可得到重组pcr2.1表达载体。
[0063]
将重组pcr2.1表达载体转入受感细胞dh5α内，重组pcr2.1表达载体会随着受感细胞dh5α的增殖而被克隆增殖，也即第一次克隆增殖。因为在用t4连接酶连接回收产物和pcr2.1表达载体时会出现回收产物或pcr2.1表达载体的自连，因此在将重组pcr2.1表达载体导入受感细胞dh5α内后需要再次筛选出含有p44基因的受感细胞dh5α，蓝白斑法是常用的筛选方法。
[0064]
在蓝白斑法中iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)为安慰性诱导物，x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳糖苷)为生色底物，二者共同用于蓝白斑法筛选。iptg可诱导载体lac操纵子dna区段合成β-半乳糖苷酶氨基端片段，该片段可与宿主细胞编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补(α互补)。实现α互补的细菌铺在含有x-gal生色底物的培养基上，可形成蓝色菌落。外源dna插入质粒的多克隆位点后可破坏α互补作用，将产生白色菌落。也即，白色菌落中的受感细胞dh5α含有的表达载体为重组pcr2.1表达载体，因此挑选白色菌落中的受感细胞dh5α进行第一克隆增殖。
[0065]
在本技术的方法的蓝白斑法筛选中，固体培养基内一般含有40～60ug/ml的氨苄青霉素，涂布在该培养基表面上的x-gal的浓度一般为15～25mg/ml，iptg的浓度一般为0.5～1mm/ml。
[0066]
s103、目标基因的提取及再确认：收集上述s102中第一克隆增殖后的受感细胞dh5α，提取出第一克隆增殖后的重组pcr2.1表达载体，并采用限制性内切酶ecorⅰ对第一克隆增殖后的重组pcr2.1表达载体进行切割，对插入的目标基因片段确认；将切割得到的目标基因进行第一测序，并收集经过第一测序后的目标基因。
[0067]
本技术的方法中，经s102蓝白斑法筛选得到的受感细胞dh5α在第一克隆增殖后会大量扩增，此时将第一克隆增殖后的受感细胞dh5α经过裂解、离心、有机试剂萃取后纯化，得到克隆增殖后的重组pcr2.1表达载体，将克隆增殖后的重组pcr2.1用限制性内切酶ecorⅰ切割，对切割得到的基因片段进行测序，初步确认目的基因p44的序列。一般采用第二代测序方法中的循环阵列合成测序法对基因片段进行测序确认，可以采用blast search和dnastar等软件对基因p44的序列进行分析进行初步确认。
[0068]
s104、重组蛋白抗原rp44-47e合成：利用in-fusion试剂盒将经过上述s103得到的第一测序后的目标基因连接到质粒ptd1，得到重组质粒p44-ptd1，再将重组质粒p44-ptd1转化到感受态细胞dh5α中，进行第二克隆增后提取重组质粒p44-ptd1进行pcr及酶切鉴定，将载有目标基因的阳性重组质粒p44-ptd1进行第二测序；经第二测序确认目标基因的核酸
序列后，利用经第二测序确认的目标基因大量制备mrna，将所制得的mrna利用蛋白质合成试剂盒合成目标蛋白，并利用亲和色谱法对目标蛋白进行纯化，即可得到嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原rp44-47e。
[0069]
重组蛋白抗原rp44-47e的氨基酸序列为：序列表seq id no.1所示。
[0070]
本技术的方法中，将重组质粒p44-ptd1转化到感受态细胞dh5α中进行第二克隆增殖，第二克隆增殖后提取重组质粒rp44-ptd1进行pcr扩增后，再次利用限制性内切酶对重组质粒rp44-ptd1切割，得到大量的含有目标基因p44-47e的基因片段。对此基因片段进行第二测序确定，第二测序采用第三代测序法，可最终得到目标p44-47e基因。
[0071]
以目标p44-47e基因为模板，利用蛋白质合成试剂盒合成目标蛋白，并利用亲和色谱法纯化，最终得到嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原rp44-47e。
[0072]
可选地，蓝白斑法筛选培养的条件为：培养温度为37℃，培养基为含有浓度为40～60μg/ml的氨苄青霉素的lb固体培养基，培养方式为倒置培养。
[0073]
第一克隆增殖和第二克隆增殖的培养基相同，均包括：10g胰化蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，1000ml去离子水，0.8～1.2g硫酸软骨素，1.2～1.8g l-精氨酸。
[0074]
第一克隆增殖和第二克隆增殖的培养条件相同，均为37℃，220rpm恒温振荡培养8～10小时。
[0075]
本技术的方法，倒置培养能避免正置培养时，由于培养过程中体系温度导致水汽冷凝在培养皿盖上，冷凝水滴落在培养基上影响培养效果。使用硫酸软骨素，能促进细胞的信使核糖核酸(mrna)和脱氧核糖核酸(dna)的生物合成，促进细胞代谢及细胞生长的作用，l-精氨酸可促进细胞增殖。
[0076]
可选地，第一测序采用循环阵列合成测序法进行测序，第二测序采用直接测序法测序。
[0077]
第二方面，本技术提供一种含有嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原的试剂盒，包括：由上述第一方面的方法所制得的嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原rp44-47e。
[0078]
可选地，试剂盒包括基片1、样品垫2、免疫金标垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫5；硝酸纤维素膜4设置于基片1上表面；硝酸纤维素膜4上设置有检测线401和质控线402；硝酸纤维素膜4顶部靠近质控线402的一侧设置有吸水垫5，靠近检测线401的一侧设置有免疫金标垫3；免疫金标垫3的顶部设置有样品垫2。
[0079]
可选地，免疫金标垫3上浸润有嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原rp44-47e胶体金复合物，和兔igg胶体金复合物。
[0080]
检测线401含有山羊抗人igm纯化蛋白或山羊抗人igg纯化蛋白或重组蛋白抗原rp44-47e。质控线402含有羊抗兔igg纯化蛋白。
[0081]
可选地，质控线402上羊抗兔igg纯化蛋白的浓度为0.8～1.2mg/ml。检测线401上山羊抗人igm纯化蛋白或山羊抗人igg纯化蛋白或重组蛋白抗原rp44-47e的浓度为0.5～1.5mg/ml。
[0082]
如图2所示本技术的试剂盒，基于双抗原夹心胶体金免疫层析法制成，将胶体金和重组蛋白抗原rp44-47e制成金标，以山羊抗人igm纯化蛋白或山羊抗人igg纯化蛋白或重组蛋白抗原rp44-47e为检测线的主要成分，在实际使用中，若待测样本感染嗜吞噬细胞无形体，即嗜吞噬细胞无形体感染阳性，其体内会产生嗜吞噬细胞无形体的抗体，则在检测时，
会在检测卡的检测线处形成山羊抗人igm纯化蛋白或山羊抗人igg纯化蛋白或重组蛋白抗原rp44-47e—抗体—金标的夹心状结合物，而使金标富集、沉积下来出现颜色条带。以羊抗兔igg纯化蛋白制成的金标，可以指示金标是否损坏，为检测结果的有效性和准确性提供指示。
[0083]
本发明中未详细说明的体系、操作和步骤等，参照《分子克隆实验指南》第三版，如试剂盒使用等均按照相应试剂盒的说明书操作；如无特殊说明，下述实施例中所用的仪器设备、试剂材料等，均为本领域技术人员使用的常规仪器设备和常规试剂材料，在此不再赘述。
[0084]
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
[0085]
实施例1
[0086]
本实施例提供一种合成嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原rp44-47e的方法：
[0087]
1)利用rna提取试剂盒(invitrogen)提取被嗜吞噬细胞无形体感染的受感thp-1培养细胞的rna，利用生物信息学技术，根据目标p44-47e基因的序列，设计反转录引物，并以所提取出的mrna为模板，使用反转录试剂盒(invitrogen)反转录得到基因p44的cdna，对得到的cdna进行2轮pcr扩增，第一轮扩增正向引物为：p3726f5
′‑
gctaaggagttagcttatga-3
′
；反向引物为：p4183r 5
′‑
caatagt(c/t)ttagctagtaacc-3
′
；第二轮扩增正向引物为：p3761f5
′‑
ctgctct(t/g)gccaa(a/g)acctc-3
′
；反向引物为：p4257r5
′‑
agaagatcataacaagcattg-3
′
；两轮扩增的条件相同，均为：94℃变性30秒，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，每轮扩增为45个循环。
[0088]
2)利用琼脂糖凝胶电泳对经过上述pcr扩增后的基因进行初步分离，在电泳过程中电压保持在5伏特/厘米，电泳时长为1小时，电泳结束后，将琼脂糖凝胶利用溴化乙啶染色，在365nm或254nm的紫外光下找到目标基因的染色条带，并回收其中的基因片段，将回收的基因和pcr2.1表达载体同时用bam h和mbo i限制性内切酶同时双酶切，然后再使用t4连接酶连接，得到重组pcr2.1表达载体，将重组pcr2.1表达载体转入受感细胞dh5α内，并使用含有50μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基培养受感细胞dh5α，培养基上涂布有50mg/ml的x-gal和0.5mm/ml的iptg，在37℃的条件下培养15小时，挑选出白色菌落进行第一克隆增殖。
[0089]
3)将第一克隆增殖后的受感细胞dh5α加入裂解液、并经过超声波破碎，离心后，提取出其中的重组pcr2.1表达载体，再利用限制性内切酶ecorⅰ切割，收集切割后的基因片段，采用blast search和dnastar等软件对基因p44的序列进行分析进行第一测序和确认，得到第一测序后的目标基因。
[0090]
4)将3)中得到的目标基因再次连接到质粒ptd1上，制成p44-ptd1重组质粒，再将重组质粒p44-ptd1转化到感受态细胞dh5α中进行第二次克隆增殖，在第二次克隆增殖之后，提取和收集p44-ptd1重组质粒，然后利用限制性内切酶ecor i对p44-ptd1重组质粒切割，将切割得到的基因片段采用pacbio smrt测序仪测序并分析，得到p44-47e基因，利用得到的p44-47e基因大量制备mrna，将所制得的mrna利用蛋白质合成试剂盒合成目标蛋白，并利用亲和色谱法对目标蛋白进行纯化，得到嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原rp44-47e。
[0091]
在步骤3)的第一克隆增殖和4)中的第二克隆增殖所使用的培养基均为为lb液体培养基，该培养基包括：10g胰化蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，1000ml去离子水，1.2g硫酸软骨素，1.8g l-精氨酸。培养条件为，37℃，220rpm恒温振荡培养8～10小时。
[0092]
实施例2
[0093]
本实施例提供一种含有嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原rp44-47e的试剂盒。该试剂盒中的检测卡基于双抗原夹心胶体金免疫层析法制成，其制备方法如下：
[0094]
1)取10g/l氯金酸1ml加入99ml去离子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.1g/l，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌下快速加入10g/l的柠檬酸三钠水溶液1.6ml，继续加热直至溶液呈葡萄酒色。冷却后补回至原体积置于棕色瓶中，2～8℃冰箱中保存备用。
[0095]
2)先将实施例1制得的待标记的重组蛋白抗原rp44-47e用5％脱脂牛奶封闭，亲和色谱提纯后再用双蒸水将封闭后的待标记重组蛋白抗原rp44-47e2稀释至1∶32，每个稀释度各取50μl加入250μl胶体金溶液中，5min后，加入100g/l的氯化钠溶液250μl，观察15min，以颜色由红变蓝的前一个浓度为最适标记蛋白浓度，标记时增加20％的蛋白用量。兔igg纯化蛋白胶体金复合物也用相同的方法制备。
[0096]
3)取胶体金溶液100ml，快速搅拌下将重组蛋白抗原rp44-47e400μl(25mg/ml)加入胶体金溶液中并继续搅拌30min。加入100g/l牛血清白蛋白至终浓度为10g/l，搅拌30min。以8000r/min离心30min。小心吸去上清液，沉淀物即为初步纯化的金标结合物，将沉淀以0.02mol/l tbs(ph8.4)溶解，重复离心2～3次，4℃保存备用。
[0097]
4)将标记好的胶体金复合物和兔igg纯化蛋白胶体金复合物用x-only单向喷点仪喷射在300mm
×
200mm的玻璃棉上，制成金标垫，自然干燥后，加入干燥剂于室温密封保存；选用millipore 180nc膜，在nc膜上用三维喷点仪分别喷上羊抗兔igg纯化蛋白的作为对照线(c带)、山羊抗人igm纯化蛋白作为检测线(t带)，于室温自然干燥72h后，密闭保存备用；
[0098]
5)分别将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按图2所示的方式依次贴到基片上。然后切割层析条，宽度3mm/条，室温干燥避光保存，即得试剂盒用胶体金免疫层析检测卡。
[0099]
实施例3
[0100]
本实施例提供一种含有嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原rp44-47e的试剂盒的检测卡的使用方法：
[0101]
检测时，首先将实施例2制得的检测卡平放于桌面上，在检测卡的样品垫上滴加150μl待检样品(血清或血液)，或者，将检测卡的样品垫浸入待检测样品中3～5s，然后在室温下静置15～20min，判定结果：
[0102]
阳性：检测线和质控线均出现红色线。
[0103]
阴性：只有对照线出现红色。
[0104]
无效：对照线不出现红色，无论检测线是否出现红色，该检测结果均以无效处理。
[0105]
实施例4
[0106]
试剂盒敏感性的检测
[0107]
将标准嗜吞噬细胞无形体血清按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400的倍比稀释，将稀释后的嗜吞噬细胞无形体血清用实施例3中的方法制得的试剂盒中的检测卡检测，结果如表1所示。
[0108]
表1
[0109]
样本未稀释1∶501∶1001∶2001∶4001∶8001∶16001∶32001∶6400
结果阳阳阳阳阳阳阳阳阴
[0110]
本实施例中，直到标准嗜吞噬细胞无形体血清被稀释到6400倍时检测卡才显示为阴性，也即稀释到3200倍时，本技术的试剂盒中的检测卡依旧有效，标准嗜吞噬细胞无形体血清的效价为7.3u/ml，因此本技术试剂盒中的检测卡检测到的最低血清效价为0.002u/ml。
[0111]
实施例5
[0112]
特异性检测
[0113]
采用按照实施例3中方法制备得到的试剂盒的检测卡为样品，对100份嗜吞噬细胞无形体感染阳性犬血清；100份嗜吞噬细胞无形体感染阳性人血清，100份阴性人血清，进行检测，统计结果，结果如表2所示：
[0114]
表2
[0115]
组别阳性犬血清阳性人血清阴性人血清阴性0198阳性100992
[0116]
由表2的数据可见，该试剂盒在检测阳性犬血清时未出现阴性结果，且在检测阳性人血清时只出现了1例假阴性结果，检测阴性人血清时只出现了2例假阳性结果，说明该试剂盒对检测人体内的嗜吞噬细胞无形体感染的特异性高，发生交叉免疫反应的概率低。
[0117]
实施例6
[0118]
为研究硫酸软骨素和l-精氨酸对感受态细胞dh5α的生长的影响，使用如下培养基和培养条件探究：
[0119]
a)10g胰化蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，1000ml去离子水，1.0g硫酸软骨素、1.5g l-精氨酸；37℃，220rpm恒温振荡培养18小时。
[0120]
b)与a)不同的是b)中不添加l-精氨酸，其余与a)保持一致。
[0121]
c)与a)不同的是c)中不添加硫酸软骨素，其余与a)保持一致。
[0122]
d)与a)不同的是d)中不添加硫酸软骨素和l-精氨酸，其余与a)保持一致。
[0123]
在上述a)、b)、c)、d)的培养条件下以相同起始的细胞个数培养细胞，每1小时取一次菌悬液1ml，利用血细胞计数板，按白细胞计数方法进行计数，计算出菌浓度(个/ml)。结果如图3所示。
[0124]
由图3可见，在培养基中加入硫酸软骨素和l-精氨酸能促进感受态细胞dh5α的生长加速，且提高感受态细胞dh5α的最高菌浓(图3中，菌浓为约5
×
109个/ml)，并且可缩短感受态细胞dh5α达到最高菌浓的时间。
[0125]
本技术的试剂盒，检测对象不限于血清或血液，还包括：唾液、尿液、组织提取物、脑脊液等样本。
[0126]
本技术的嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原的制备方法，能单一、高效且大量制备重组蛋白抗原rp44-47e，所制备的重组蛋白抗原rp44-47e表达量和稳定性高，克服了p44全基因组抗原表达量低且不易制备的缺点。所制得的重组蛋白抗原rp44-47e作为抗原蛋白具有特异性高，能有效降低检测成本，易于标准化的特点。
[0127]
本技术的含有嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原的试剂盒，该试剂盒中的检测卡基于双抗原夹心胶体金免疫层析法制成，具有快速、便捷、成本低、特异性强、不易发生交叉反
应等优点，克服了ifa、elisa、wb法等传统方法的检测时间长、需要昂贵检测仪器、不适于在基层使用的缺点，本技术的含有嗜吞噬细胞无形体重组蛋白抗原的试剂盒，适于临床检测hga疾病，尤其是医疗条件有效的农村地区，本技术的试剂盒具有广阔的应用前景。
[0128]
最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本技术的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本技术进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本技术各实施例技术方案的范围。