一种用于检测大口黑鲈虹彩病毒的实时荧光RAA引物、探针及试剂盒

一种用于检测大口黑鲈虹彩病毒的实时荧光raa引物、探针及试剂盒
技术领域
1.本发明属于病毒核酸检测技术领域，具体涉及一种通过实时荧光重组酶聚合酶恒温扩增技术(raa)来快速检测大口黑鲈虹彩病毒的引物、探针以及试剂盒。


背景技术：

2.大口黑鲈(micropterus salmoides)俗称加州鲈，隶属硬骨鱼纲(osteichthyes)、辐鳍鱼亚纲(actinopterygii)鲈形目(perciformes)、太阳鱼科(cehtrachidae)黑鲈属(micro pterus)，是一种优质淡水鱼类，具有适应性强、生长快、易捕捞、养殖周期短等优点，加之肉质鲜美细嫩，无肌间刺，外形美观，深受养殖者和消费者欢迎
1.。大口黑鲈属中高档淡水养殖品种，单位经济效益显著。近十多年来，我国的大口黑鲈养殖产业获得了飞速发展，其养殖产量以年均9％以上的速度增长，根据中国渔业统计年鉴2020的数据，全国加州鲈产量约为47.8万吨，产值过百亿。随着养殖规模的扩大，养殖密度的增加，水体环境的恶化，大口黑鲈的病害问题也越来越突出，造成巨大经济损失，也严重制约了该产业的持续发展。大口黑鲈的病毒性疾病死亡率高，且难以防治，给世界范围内的大口黑鲈养殖业造成了严重的威胁，其中以虹彩病毒蛙病毒属的大口黑鲈虹彩病毒(largemouth bass ranavirus，lmbv)感染引起的大口黑鲈虹彩病毒病(largemouth bass ranavirus disease，lmbvd)危害和影响最大，国内报道的大口黑鲈病毒性溃疡病也是由这种蛙病毒感染所致。近年来，lmbv在我国大口黑鲈主养区域的流行和危害呈明显上升趋势，对我国大口黑鲈养殖业造成了巨大的威胁和严重的经济损失。
3.目前，lmbv的检测和鉴定主要采用各种核酸扩增方法，为了提高病毒检测的灵敏性和精确计算各感染组织中病毒拷贝数，研究人员开发出了针对lmbv的各种荧光定量pcr技术。pallister等人建了可用于检测和区分lmbv欧洲和澳大利亚株型的实时荧光定量pcr方法。goldberg等人和getchell等人分别描述了一种使用不同引物检测lmbv的taqman实时pcr方法。与传统的细胞培养方法相比，该方法在检测感染细胞和患病鱼组织器官中lmbv的灵敏度要高出100倍。pallister等人建了可用于检测和区分lmbv欧洲和澳大利亚株型的实时荧光定量pcr方法。马冬梅等人根据lbusv的dna甲基转移酶基因序列设计引物和探针，通过lbusv的taq man mgb探针荧光定量pcr检测方法。李江宇等人基于mcp基因和taqman探针建立了蛙病毒属三重荧光pcr检测方法。虽然这些常规pcr和定量pcr方法具有灵敏度高的优点，但缺乏直接测定pcr产物的简便方法，限制了其在现场检测中的应用。lamp检测方法不需要昂贵的设备和复杂的程序，可能是现场诊断lmbv的最佳检测系统，其灵敏度是常规pcr方法的十倍以上，整个检测过程可在35分钟内完成，有望成为监测和早期诊断大口黑鲈传染性皮肤溃疡综合征的有力工具。zhu等基于lmbv的mcp基因保守区域设计了4条引物，建立了灵敏度高、特异性好的lamp检测方法，对lmbv的dna检测最低灵敏度可达到85拷贝/μl，不需要特殊的仪器设备，可用于养殖场中lmbv感染情况的早期检测。但lamp检测需要4～6条引物，且与传统pcr相比，设计难度大，还非常容易出现假阳性结果。因此，急需一种准确
度高、操作简单、便于携带和使用的其它方法进行lmbv的现场检测。
4.重组酶介导恒温扩增技术(recombinase aided amplification，raa)具有引物设计特异简单，操作方便，扩增迅速，反应温度恒定的优点。raa包含三种核心酶，单链dna结合蛋白(ssb)、重组酶和dna聚合酶，这些酶协调引物配对的目标dna及指导dna合成。raa产品可以通过凝胶电泳检测，使用外切酶iii兼容(exo)或甲酰胺嘧啶dna糖基化酶(fpg)探针实时监测，还可以通过横向流动试纸(lfd)和内切酶iv兼容(nfo)探针可视化。值得注意的是，raa反应的最佳条件是在37-42℃的恒温条件下反应10-30分钟，最快在反应5分钟时，目的基因的扩增产物即可达到检测水平。扩增产物可与多种检测方法结合进行可视化分析，比如实时荧光raa。因此，实时荧光raa是一种可用于现场便携式诊断的方法。目前还没有用于lmbv核酸检测的raa及相关的检测方法和试剂盒。
5.当前，lmbvd是大口黑鲈养殖过程中最常见，危害最大的一种疾病，苗种检疫、早期诊断和排除及隔离携带病毒的鱼是当前防控该病唯一有效的措施。由于最需要进行lmbv检测的基层单位和养殖场的条件简陋、设备落后以及专业技术人员缺乏，对于场所的限制需要突破，检测用时需要缩短，同时检测设备的便携式和便捷化程度需要提升，以推动lmbvd诊断前移下移，实现患病鱼的快速诊断和疑似lmbv携带鱼的现场快速筛查，并针对不同需求提供有效的精准快速检测方案。因此，提供一种简便、快速、有效、可用于现场诊断和大规模筛选的lmbv核酸重组酶恒温扩增检测试剂盒，意义重大。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供大口黑鲈虹彩病毒的实时荧光raa引物、探针，所述的引物为：b7f：cctcaacgatcctcacccttcagggtctac和b7r：cgtatttctgagggtttttgtagccagagtt，所述的探针为：probe：ctgagcctcaacgatcctcacccttcaggg/i6famdt//idsp//ibhq1dt/accaatttcggtcgc。
7.本发明的另一个目的在于提供大口黑鲈虹彩病毒的实时荧光raa引物、探针在制备大口黑鲈虹彩病毒检测试剂盒中的应用。
8.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
9.大口黑鲈虹彩病毒的实时荧光raa引物、探针，所述的引物为：
10.b7f：cctcaacgatcctcacccttcagggtctac和b7r：cgtatttctgagggtttttgtagccagagtt，所述的探针为：probe：ctgagcctcaacgatcctcacccttcaggg/i6famdt//idsp//ibhq1dt/accaatttcggtcgc。
11.上述引物和探针组合在制备检测大口黑鲈虹彩病毒试剂盒中的应用。
12.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
13.本发明提供了一种实时荧光raa方法检测大口黑鲈虹彩病毒的引物、探针、试剂盒，检测快速、灵敏、操作简便。本发明采用raa技术，只需在37～42℃(较佳为39℃)下反应5～20min便可分析结果，不需要复杂的反应程序；且可用于便携式基因扩增设备，适用于野外、现场检测和大规模筛选。本发明提供的扩增引物和探针特异性强，灵敏度高，能准确地检测到大口黑鲈虹彩病毒，且检测结果稳定，重复性好；可实现单管现场快速检测大口黑鲈虹彩病毒，全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性。
14.重组酶恒温扩增技术作为在恒定温度条件下反应的新型核酸体外扩增技术，其具有灵敏度高、特异性强、反应时间快、操作简单等优点。这种重组酶恒温扩增技术填补了传统培养和依赖温变设备技术外的空缺，能在养殖场现场和非实验室环境实现即时检测。raa技术能在恒定或较宽温度范围内，通过30min左右自动循环的动态环境，可实现微量核酸在体外高效快速扩增，再由端点检测法对扩增产物进行检测，即可得到理想检测结果。
附图说明
15.图1为raa引物的筛选结果；
16.其中a为raa扩增产物凝胶电泳分析结果，其中泳道m为dl2000的dna分子量标准，1～8分别为b1f/r-b8f/r 8对引物对扩增结果；
17.b为荧光法raa扩增曲线，f1/r1～f8/r8分别为b1f/r-b8f/r 8对引物对扩增曲线，nc为未加模板的阴性对照。
18.图2为不同引物浓度荧光raa反应试验结果；
19.其中：nc为未加模板，引物浓度为400nmol/μl在39℃条件下的扩增曲线。
20.图3为不同探针浓度荧光raa反应试验结果；
21.其中：nc为未加模板，探针浓度为120nmol/μl在39℃条件下的扩增曲线。
22.图4为不同温度下荧光raa反应试验结果；
23.其中：nc为未加模板在39℃条件下的扩增曲线。
24.图5为荧光raa方法的特异性试验结果。
25.图6为荧光raa(a)和荧光定量pcr(b)方法的敏感性试验结果；
26.其中1～6分别为模板浓度为5.83
×
105拷贝/μl～5.83
×
100拷贝/μl。
27.图7为荧光raa方法重复性试验结果。
具体实施方式
28.为了克服现有技术检测大口黑鲈虹彩病毒的缺陷，突破现有技术对人员、场所的限制，缩短检测用时，同时提升检测设备的便携式和便捷化程度，实现对患病鱼的快速诊断和疑似lmbv携带鱼的现场快速筛查，本发明提供了一种大口黑鲈虹彩病毒的重组酶聚合酶恒温扩增快速检测试剂盒。
29.为能清楚说明本方案的技术特点，下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中的所用技术手段是本领域技术人员所熟知的常规技术手段。
30.1.1主要仪器及耗材
31.恒温荧光检测仪购自广州双螺旋基因技术有限公司；实时荧光定量pcr仪abi7500购自美国applied biosystems公司；超微量紫外分光光度计购自美国thermofisher scientific公司；电泳仪和凝胶成相分析系统购自美国bio-rad公司；台式高速冷冻型微量离心机、台式冷冻高速离心机和移液器购自eppendorf公司；各种规格的移液枪头、无菌0.2ml、0.5ml、1ml以及1.5ml离心管购自美国axygen公司。
32.1.2主要试剂
33.raa核酸扩增试剂(荧光型)试剂盒购自杭州众测生物科技有限公司，总rna提取试剂(omega)盒购自广州飞扬生物工程有限公司；细菌/病毒基因组dna提取试剂盒购自中国北京天根生物技术公司；primescript
tm
1st strand cdna synthesis kit和rnase inhibitor均购自takara公司；其它所需试剂由本实验室提供。
34.1.3主要菌毒株
35.嗜水气单胞菌(aeromonas hydrophila，ah)、维氏气单胞菌(aeromonas veronii，av)、鲤浮肿病毒(carp edema virus，cev)、传染性造血器官坏死病毒(infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus，ihnv)、传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus，isknv)、锦鲤疱疹病毒(koi hepesvirus disease，khv)、大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)、草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,gcrv)、鳜鱼弹状病毒(sinipercachuatsirhabdovirus，scrv)、鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus，svcv)、罗湖病毒(tilapia lake virus，tilv)的dna或cdna均由本技术人实验室制备并保存。
36.实施例1：
37.lmbv实时荧光raa引物探针设计及筛选：
38.根据genebank中登录的lmbv的mcp基因序列(fr682503.1)，参照raa指导说明，进行重组酶特有引物和探针设计。raa核酸扩增技术对于引物设计与常规pcr引物设计有一定的区别，有两条寡核苷酸组成一对引物，分别特异性识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列；长度在30～35核苷酸(nt)之间，序列中无回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区；引物tm值不作为设计时主要考虑因素；最佳引物对需通过试验优化筛选出。探针设计序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46～52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；共有四个修饰位点，距离5’端的≥35nt的中部位置标记一个四氢呋喃(thf)，作为核酸外切酶的识别位点；thf位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个淬灭基闭，两个基团的间距为2～4nt；thf距离3’末端≥l5nt，并且3
′
末端标记一个修饰基团。
39.参照raa引物探针的设计原则，设计并合成raa引物及raa-exo探针，将引物和探针进一步通过blast进行序列比对分析，比较设计的探针和引物序列与lmbv，isknv,sgiv，fv3、scrv等病毒的基因序列的匹配度。确定引物和探针的特异性，所有引物和探针由上海生物工程技术服务有限公司合成。
40.申请人针对lmbv的mcp基因序列(fr682503.1)的中的不同目的基因，设计了60多组raa引物(因篇幅有限，不在本说明中展示所有60多组的引物序列)，但大部分的引物无扩增条带，无法使用，仅有十五组可扩增出条带，最终从这十五组中选出一组扩增效率最高，灵敏度最高的引物组b7f/r。在表1中申请人展示了部分虽可扩增出条带，但依然待筛选的8组引物，最终筛得的引物是b7f/r。
41.表1 real-time raa引物和探针序列
42.[0043][0044]
实时荧光raa反应体系及条件
[0045]
以lmbv的dna为模板，进行raa反应。总反应体系为50μl，首先在预添加exo rt酶的反应管中加入buffer
ꢀⅰꢀ
32μl，dd h2o 8.5μl，浓度为400nmol/μl的上游引物(f)1μl和下游引物(r)1μl，浓度为120nmol/μl的探针(p)1μl，酶混合液1μl，dna模板3μl，将buffer
ꢀⅱꢀ
2.5μl加到管盖上，充分混匀后，将反应ep管放入便携式荧光检测仪中，设定反应温度、时间，在特定温度进行恒温扩增反应。所述的酶混合液为重组酶、dna聚合酶和单链dna结合蛋白，所述buffer
ꢀⅰ
为20％peg 2000，buffer
ꢀⅱ
为250mm mgcl2。
[0046]
便携式荧光检测仪每20s测定并记录一次fam所发出的荧光信号强度，记录为一个荧光值，在扩增30min后，如样品所发出的荧光值为阈值时间内检测到的样品荧光值的三个标准偏差，则判定该样品为阳性。本实验中所使用的阈值时间为扩增反应开始的0～1min。
[0047]
根据试剂盒说明中推荐的反应条件，用此组引物进行本试验所要建立的lmbv raa检测方法反应条件的优化，每个反应重复三次。首先在反应温度为40℃、探针浓度为120nmol/μl、引物浓度分别为200nmol/μl、400nmol/μl、600nmol/μl、800nmol/μl条件下进行raa反应，筛选出最佳引物浓度。结果显示，引物浓度分别在200nmol/μl、400nmol/μl、600nmol/μl和800nmol/μl的荧光检测值均达到阈值时间荧光强度的三个标准偏差，在400nmol/μl浓度条件下用时最短，检测效率最高，参见图2。
[0048]
然后固定引物浓度为400nmol/μl，探针引物浓度分别为90nmol/μl、120nmol/μl、150nmol/μl和180nmol/μl条件下进行raa反应，筛选出最佳探针浓度。结果显示，探针浓度
分别在90nmol/μl、120nmol/μl、150nmol/μl和180nmol/μl的荧光检测值均达到阈值时间荧光强度的三个标准偏差，在120nmol/μl浓度条件下用时最短，检测效率最高,参见图3。
[0049]
最后用最佳的引物浓度400nmol/μl、探针浓度120nmol/μl、温度分别为37、38、39、40、41、42℃条件下进行raa反应，筛选最佳反应温度。结果显示，随着温度的升高，反应在37、38、39、40、41、42℃条件下的荧光强度均可达到阈值时间荧光强度的三个标准偏差，但相比之下，在39℃条件下检测效率最高，用时最短，参见图4。
[0050]
因此，选取引物浓度400nmol/μl、探针浓度120nmol/μl、反应温度39℃、反应时间20min为本试验所建立的lmbv real-time raa检测方法的最佳反应条件。
[0051]
特异性试验
[0052]
为了确定该方法的特异性，应用筛选的最优反应体系，选取ah、av、cev、gcrv、isknv、ihnv、khv、scrv、svcv和tilv共10种鱼类常见病原的dna或者的cdna为模板进行扩增反应，dna和cdna浓度均为20ng/μl，用量为2μl，利用最佳反应条件进行实时荧光raa检测，评价该方法的特异性，同时设立灭菌的ddh2o为阴性对照，试验结果见图5。通过图5可见，随着反应时间推移，反应10min后，lmbv阳性dna荧光强度明显升高，相比之下，其他病毒阳性dna或cdna测得的荧光强度无明显升高变化，说明本方法可以特异性扩增lmbv核酸，可用于lmbv的特异性检测。
[0053]
敏感性试验
[0054]
为了确定实时荧光恒温扩增方法的最小检出量，应用筛选的最优反应体系，以lmbv病毒的mcp基因dna构建质粒为模板，分别按照10倍倍比稀释至6个浓度，即5.83
×
105拷贝/μl～5.83
×
100拷贝/μl共六个浓度梯度的模板，利用最佳反应条件进行检测，并与荧光定量pcr方法进行敏感度比较。
[0055]
该结果显示，实时荧光raa方法可在7min内检测到浓度为5.83
×
105拷贝/μl的样品，对应的荧光定量pcr ct值为14.28
±
0.04，在20min内，可检测最低浓度为58.3拷贝/μl的样品，而荧光定量pcr可检测最低浓度为5.83拷贝/μl的样品(见图6)，实时荧光raa敏感度比荧光定量pcr低一个数量级，但检测所需要的时间从荧光定量pcr的1h缩短至20min，远远快于荧光定量pcr方法。荧光定量的引物是：qpcr-f：5'-ggccaccacctctactcttac-3'；qpcr-r：5'-ggcagacagagacacgttga-3'；qpcr-probe:fam-ctt cag ggt cta cca att tcg gtc-tamra。
[0056]
重复性试验
[0057]
为验证荧光定量raa检测结果的可重复性，选取5.83
×
105拷贝/μl倍稀释的质粒样本，以50μl体系连续扩增3次，试验结果见图7。该结果显示，试验扩增曲线重复性好，有良好的稳定性。
[0058]
实施例2：
[0059]
3种方法对临床样品的检测比较
[0060]
本实验于2020和2021年在广东、广西和江西鲈鱼养殖场收集了52份发病和未发病的大口黑鲈临床组织样品。采用实时荧光raa、qpcr和病毒分离方法对这52份样品同时进行鉴定，比较三种方法的检测效果。由表2可以看出，52份临床样品中，实时荧光raa检出lbmv阳性的样品为15份，阳性率为28.8％，这15份临床样品的检测结果与荧光定量pcr和病毒分离两种方法结果一致；而荧光定量pcr和病毒分离两种方法的lbmv阳性样品为16份，阳性率
为30.8％，其中有一份编号为s15的临床样品实时荧光raa方法漏检了，通过荧光定量pcr结果表明，该份样品的病毒拷贝数为6拷贝/μl，低于实时荧光raa的最低检出限。实时荧光raa与荧光定量pcr和病毒分离相比，诊断敏感性分别为93.8％，诊断特异性均为100％。由此可见，本发明的实时荧光raa方法检测结果可靠、用时最短，操作最简单。
[0061]
表2 3种方法对临床样品检测结果
[0062]
[0063]
[0064][0065]
注：“+”表示结果为阳性，
“‑”
表示结果为阴性，“√”表示接种细胞之后会出现cpe，
“×”
表示接种细胞之后不会出现cpe。
[0066]
实施例3：
[0067]
检测大口黑鲈虹彩病毒的实时荧光raa引物、探针在制备试剂盒中的应用：
[0068]
该试剂盒的制作和操作流程是基于raa检测技术。试剂盒含有特异性扩增引物和探针，相关引物及探针信息见本说明书中的表1部分中的bf7/r7和probe。引物的终浓度分别为400nmol/μl，探针的终浓度为120nmol/μl，试剂盒还有相应的荧光raa反应试剂和缓冲液，还包括buffer
ꢀⅰ
，buffer
ꢀⅱ
和酶混合液，所述buffer
ꢀⅰ
为20％peg 2000，buffer
ꢀⅱ
为250mm mgcl2，酶混合液为重组酶、dna聚合酶和单链dna结合蛋白。另外还可以有阳性对照品和阴性对照，阳性对照品应当在扩增过程中能够完全扩增出引物对应的靶向基因片段；阴性对照品为dd h2o。通过最精简和特异的引物及探针检测，采用重组酶扩增技术对大口黑鲈虹彩病毒特异性核酸进行快速准确的扩增和识别，不仅稳定，检测方便、精确，大大提高病毒诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入生产实践，可以简化操作步骤，缩短检测时间，减少检测人员的操作时间，提高检测效率，适用于大规模的筛选。