一种高效解钾解磷菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种高效解钾解磷菌及其应用。


背景技术：

2.磷是植物生长发育过程中必不可少的元素之一，磷是构成磷脂和核蛋白的主要成分，是构建植物细胞的重要原料，植物许多生命活动如光合作用、呼吸作用、植物根对水分养分的吸收，以及糖、淀粉、油脂、蛋白质等多种物质的合成、转化等都必须有磷的参与。土壤中植物能够吸收利用的有效态磷只占全磷量的2％-3％，而大部分的磷不能直接被植物吸收，需要通过一系列的物理、化学和生物反应才能最终转化成能被植物利用的物质。土壤中磷是不可再生矿质资源，我国有1.3亿公顷的农田，74％的耕地中磷含量很高，但是有效磷的含量不到5％，而剩下的耕地则严重缺磷。
3.钾虽然不是构建植物体的必需元素，但钾是植物生命活动中一种极其重要的物质。钾主要集中在植物生命活动最活跃的器官或组织，如根尖、茎尖、幼叶、形成层等。钾可以促进碳水化合物的合成和运输，促进蛋白质的合成。植物体内含钾一般占干物质重的0.2％-4.1％，仅次于氮。然而，我国大部分耕地的土壤全氮含量都在0.2％以下，为缺氮土壤，土壤中可直接利用钾的含量只占全钾的2％-10％，其余90％以上的钾是以矿物钾的形式存在，如存在于长石和云母等硅酸盐矿物中，这些矿物化学性质稳定，只有从矿物中释放出来才能被植物吸收利用。
4.鉴于以上现实，本领域大多采用施用富含磷、钾化肥的方式以满足作物对营养元素的需求，但是大量施用化肥会造成环境污染、土壤板结、地力衰退、农产品品质降低、土壤微生物数量减少、生态恶化、耕地土壤生态系统失衡等环境问题。因此，如何提高耕作田土壤中营养元素钾、磷的利用率，是本领域亟需解决的技术问题。从已有的文献报道来看，虽然已有相关解磷菌种和解钾菌种的报道，但是菌种的功效却差强人意，而且同时具备解钾、解磷功能的菌种较少，在土壤中的存活率也不高，不能应用于实际农业生产中。所以，筛选具有高效解钾解磷功能且可应用于实际农业生产中的野生菌株，对于我国农业的发展具有重大意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够降解土壤难溶无机磷、钾，为植物提供可以直接吸收的优质磷、钾素的一种高效解磷解钾菌，可应用于实际农业生产中。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明提供了一种高效解钾解磷菌，所述高效解钾解磷菌的分类学命名为枯草芽孢杆菌，菌株号为ftb-k1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23346。
8.本发明还提供了一种上述高效解钾解磷菌在制备解钾和/或解磷微生物肥料中的应用。
9.本发明还提供了一种上述高效解钾解磷菌在土壤解钾和/或解磷中的应用。
10.优选的，使用所述高效解钾解磷菌的发酵液用于土壤解钾和/或解磷。
11.优选的，所述发酵液的施用量为0.4-0.8l/m2。
12.优选的，所述发酵液的制备方法包括如下步骤：将所述高效解钾解磷菌活化后，接种于发酵培养基中，29-33℃，培养23-30h。
13.优选的，所述活化的时间为24-28h。
14.优选的，所述活化用的活化培养基包括按照重量份数计的如下组分：蛋白胨10-14份，牛肉膏粉5-9份，氯化钠5-9份，琼脂12-16份，水1000-1400份，ph 7.2-7.4。
15.优选的，所述发酵培养基包括按照重量份数计的如下组分：豆饼粉12-18份、鱼粉4-10份、葡萄糖3-8份、复合无机盐2-4份、水1000-2000份，ph值6.8-7.3。
16.优选的，所述复合无机盐中(nh4)2so4：k2hpo4：mnso4·
h2o：mgso4·
7h2o的重量比为8-12：1-4：1-3：1-3。
17.本发明的有益效果：
18.本发明从牛粪中分离出的枯草芽孢杆菌ftb-k1，具有较高的解钾能力，同时也具有很好的解磷能力，可以增加土壤中有效钾、磷的含量，提高土壤中难溶性钾、磷的利用效率；能够分解钾长石等不溶性的硅铝酸盐无机矿物质，促进难溶性的钾、硅、镁等养分元素转化成可溶性养分，能作为微生物肥料，增加土壤中速效养分的含量，促进作物生长发育，提高产量。
19.本发明枯草芽孢杆菌ftb-k1在土壤中具有较高的存活率，能应用于实际农业生产中，使用后有益微生物能够迅速定殖，分解活化难溶矿质元素，能将土壤中难溶性无机磷、钾转化为可供植物直接吸收利用的优质磷、钾素化合物，能大幅度提高土壤中难溶性磷、钾的生物有效性和磷、钾肥料养分利用率。
20.保藏说明
21.本发明枯草芽孢杆菌ftb-k1(bacillus subtilis ftb-k1)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年9月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.23346。
附图说明
22.图1为ftb-k1的菌落形态图；
23.图2为显微镜下ftb-k1菌体图。
具体实施方式
24.本发明提供了一种高效解钾解磷菌，所述高效解钾解磷菌的分类学命名为枯草芽孢杆菌，菌株号为ftb-k1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23346。
25.本发明枯草芽孢杆菌ftb-k1是从河北省唐山市玉田县恒天然牧场牛粪中筛选获得的。对筛选获得的ftb-k1菌株经形态鉴定和16s rrna测序分析，确定为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)ftb-k1。在琼脂营养培养基上30℃有氧培养18h，菌体可以大量生长，菌落形态结果如图1所示，菌落颜色为微黄色，表面粗糙不透明，边缘锯齿状，不规则。显微
镜观察发现菌体椭圆，单个细胞0.7-0.8μm
×
2-3μm，无荚膜，周生鞭毛，能运动，芽孢0.6-0.9μm
×
1.0-1.5μm，位于菌体中央或稍偏，如图2所示。采用细菌16s rdna通用引物如seq id no.2和seq id no.3所示：
26.27f(5
’‑
agtttgatcmtggctcag-3’)
27.1492r(5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’)，其中m代表简并碱基，m＝a/c，即表明m为a或c，对菌株ftb-k1进行扩增和正向测序，得到的序列长度为1390bp，具体序列如seq id no.1所示。
28.将测序结果在ncbi数据库中进行比对，最终鉴定筛选获得的样品为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)ftb-k1。
29.本发明还提供了一种上述高效解钾解磷菌在制备解钾和/或解磷微生物肥料中的应用。
30.本发明还提供了一种上述高效解钾解磷菌在土壤解钾和/或解磷中的应用。
31.使用本发明高效解钾解磷菌进行土壤解钾和/或解磷时，优选的是使用本发明枯草芽孢杆菌ftb-k1的发酵液，所述发酵液的施用量优选为0.4-0.8l/m2，更优选为0.5-0.7l/m2。
32.在本发明中，枯草芽孢杆菌ftb-k1发酵液的制备方法优选的包括如下步骤：将本发明高效解钾解磷菌活化后，接种于发酵培养基中，29-33℃，培养23-30h。
33.在本发明中，对枯草芽孢杆菌ftb-k1进行活化的时间优选为24-28h，更优选为25-27h。枯草芽孢杆菌ftb-k1菌种活化所用的活化培养基优选的包括按照重量份数计的如下组分：蛋白胨10-14份，牛肉膏粉5-9份，氯化钠5-9份，琼脂12-16份，水1000-1400份，ph 7.2-7.4，更优选的包括按照重量份数计的如下组分：蛋白胨12-13份，牛肉膏粉7-8份，氯化钠7-8份，琼脂13-15份，水1100-1300份，ph 7.3。本发明对于上述各组分的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。
34.在本发明中，所述发酵培养基优选的包括按照重量份数计的如下组分：豆饼粉12-18份、鱼粉4-10份、葡萄糖3-8份、复合无机盐2-4份、水1000-2000份，ph值6.8-7.3，更优选的包括按照重量份数计的如下组分：豆饼粉14-16份、鱼粉6-8份、葡萄糖5-6份、复合无机盐3份、水1400-1600份，ph值7.1-7.2。本发明所述复合无机盐优选的由(nh4)2so4、k2hpo4、mnso4·
h2o和mgso4·
7h2o组成，且四者的重量比优选为8-12：1-4：1-3：1-3，更优选为9-11：2-3：2：2。本发明对于上述各组分的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。
35.在本发明中，所述发酵培养的温度优选为30-32℃，所述发酵培养的时间优选为25-28h，更优选为26-27h。本发明所述发酵培养优选的采用摇床培养，所述摇床的转速优选为90-130r/min，更优选为100-120r/min。
36.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
37.实施例1
38.枯草芽孢杆菌ftb-k1的解钾能力测定
39.将枯草芽孢杆菌ftb-k1接种于蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，氯化钠5g，琼脂12g，水1000g，ph 7.2的活化培养基中，活化24h，然后接种于豆饼粉12g、鱼粉4g、葡萄糖3g、复合无机盐((nh4)2so4：k2hpo4：mnso4·
h2o：mgso4·
7h2o)的重量比为8：1：1：1)2g、水1000g，ph值
6.8的发酵培养基中，29℃，90r/min培养25h，得菌悬液。
40.配制解钾培养基(无水溶性钾离子)：葡萄糖5g、硫酸铵0.5g、酵母粉0.5g、硫酸镁0.3g、磷酸氢二钠2g、硫酸亚铁0.03g、硫酸锰0.03g、钾长石2g(含钾量11％-13％)、蒸馏水1l，搅拌均匀，调ph值至7.2，121℃高温灭菌15min。
41.500ml三角瓶，每瓶分装100ml解钾培养基，加入5ml菌悬液，以未接种菌悬液的为对照，每个处理重复5次。29℃、90r/min摇床培养10d后结束培养，培养液经4500r/min离心20min，收集上清液，加2ml 6％h2o2消煮1h，再离心，取上清液。用电感耦合等离子体光谱法测定上清液中水溶性钾含量，与对照处理进行比较，计算解钾菌的解钾量。
42.解钾量(mg/l)＝菌悬液中k
+
含量-对照液中k
+
含量。
43.得出实验组水溶性钾离子含量为150-170mg/l，对照组水溶性钾离子含量趋近于0，解钾率达68％以上，具有较强的解钾能力。
44.实施例2
45.枯草芽孢杆菌ftb-k1的解磷能力测定
46.枯草芽孢杆菌ftb-k1菌悬液的制备过程同实施例1。在250ml三角瓶中分别加入100ml无机磷液体培养基，培养基成分为葡萄糖10g、硫酸镁0.5g、硫酸氨0.5g、碳酸钙0.1g、氯化亚铁0.005g、磷酸三钙5g、水1000ml。再接种2ml菌悬液作为实验组，对照组不接种菌悬液，接种2ml水，所有处理均进行3次重复。在32℃，140rpm分别振荡5d，将培养液在12000r/min下离心10min，通过钼锑抗比色法测定解磷量(水溶性磷含量)。结果如表1所示。
47.表1枯草芽孢杆菌ftb-k1解磷量
[0048][0049]
由表1可以看出，枯草芽孢杆菌ftb-k1能够用于解磷且解磷效果好。
[0050]
实施例3
[0051]
将枯草芽孢杆菌ftb-k1接种于蛋白胨14g，牛肉膏粉9g，氯化钠9g，琼脂16g，水1400g，ph 7.4的活化培养基中，活化28h，然后接种于豆饼粉18g、鱼粉10g、葡萄糖8g、复合无机盐((nh4)2so4：k2hpo4：mnso4·
h2o：mgso4·
7h2o)的重量比为12：4：3：3)4g、水2000g，ph值7.3的发酵培养基中，33℃，130r/min培养28h，得实验组发酵液。
[0052]
对照组发酵液的制备过程与实验组发酵液相同，区别仅在于对照组中未添加枯草芽孢杆菌ftb-k1。
[0053]
在唐山市玉田县选取100m2小麦种植田，平均分成四块试验田，其中2块设定为实验组(按照0.4l/m2的施用量施用实验组发酵液)，2块设定为对照组(按照0.4l/m2的施用量施用对照组发酵液)，实验组和对照组均在小麦分蘖期进行施肥，实验组与对照组除了施用的发酵液不同外，其余田间管理等条件均相同。在小麦成熟期检测小麦产量等各指标，结果如表2所示。
[0054]
表2枯草芽孢杆菌ftb-k1对小麦产量的影响
[0055][0056]
由表2可以看出，本发明发酵液可以提高农作物产量。
[0057]
实施例4
[0058]
将枯草芽孢杆菌ftb-k1接种于蛋白胨13g，牛肉膏粉8g，氯化钠8g，琼脂15g，水1300g，ph 7.3的活化培养基中，活化25h，然后接种于豆饼粉16g、鱼粉8g、葡萄糖6g、复合无机盐((nh4)2so4：k2hpo4：mnso4·
h2o：mgso4·
7h2o)的重量比为9：2：2：2)3g、水1600g，ph值7.2的发酵培养基中，32℃，120r/min培养26h，得实验组发酵液。
[0059]
对照组发酵液的制备过程与实验组发酵液相同，区别仅在于对照组中未添加枯草芽孢杆菌ftb-k1。
[0060]
在唐山市玉田县选取50m2甜瓜种植田，平均分成5块试验田，其中3块设定为实验组(按照0.7l/m2的施用量施用实验组发酵液)，2块设定为对照组(按照0.7l/m2的施用量施用对照组发酵液)，实验组和对照组均在甜瓜坐果3天后施肥，实验组与对照组除了施用的发酵液不同外，其余田间管理等条件均相同。在甜瓜成熟期检测甜瓜维生素c和硝酸盐含量，结果如表3所示。
[0061]
表3枯草芽孢杆菌ftb-k1对甜瓜产量和品质的影响
[0062]
处理维生素c含量(mg/100g)硝酸盐含量(mg/100g)产量(kg/亩)实验组9.2
±
0.413.2
±
0.34333.6
±
19对照组4.0
±
0.322.5
±
0.11800.1
±
22
[0063]
由表3可以看出，本发明发酵液在提高农作物产量的同时还能提高农作物的品质，与未使用本发明菌剂的对照组相比，本发明的枯草芽孢杆菌ftb-k1可使甜瓜的维生素c含量提高一倍多，可使硝酸盐含量降低41.3％。
[0064]
实施例5
[0065]
实验组发酵液的制备过程同实施例3，对照组发酵液的制备过程与实验组发酵液相同，区别仅在于对照组中未添加枯草芽孢杆菌ftb-k1。
[0066]
在唐山市玉田县选取100m2玉米种植田，平均分成5块试验田，试验设5个处理，其中处理1未施肥料即为空白对照，处理2按照0.9l/m2的施用量施用对照组发酵液，处理3施用本领域普通玉米专用肥0.05kg/m2，处理4施用本领域普通玉米专用肥0.05kg/m2和按照0.9l/m2的施用量施用实验组发酵液，处理5施用本领域玉米专用肥0.025kg/m2和按照0.9l/m2的施用量施用实验组发酵液。上述玉米专用肥由尿素70kg，磷酸二氢钾30kg，硝酸钾60kg，2,4-d 1kg，4-碘苯氧乙酸1kg、硼砂1kg，钼酸铵1kg，硫酸锌1kg，硫酸铜1kg，硫酸锰1kg，硫酸亚铁1kg组成。5个处理组均在春播时进行一次性施肥，除了施肥不同外，其余田间管理等条件均相同。在玉米成熟期检测玉米产量，结果如表4所示。
[0067]
表4枯草芽孢杆菌ftb-k1对玉米产量的影响
[0068]
组别产量(kg/亩)处理1533.4处理2733.4处理31400.1处理42133.4处理51533.4
[0069]
由表4可知，本发明枯草芽孢杆菌ftb-k1菌剂与肥料混施，能够提高玉米的产量，当减施50％质量的普通玉米专用肥时，依然能够提高玉米的产量，说明本发明菌剂可以有效减少化肥的施用量。
[0070]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。