一种莫海威芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种能够解磷及防治作物病害的 莫海威芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.磷是植物生长必需的营养元素之一，植物的光合作用和体内的生化过程 都必需有磷参与，但其在土壤中主要以难溶性矿物态存在，难溶性矿物态磷 无法被作物直接吸收利用。为提高作物产量，超过90kg/hm2磷肥被施用于土 壤中，部分磷肥被作物吸收利用，大部分被转化成难溶性磷返施于土壤。大 量化学磷肥的施用，伴随土壤板结、土壤酸化、土壤贫瘠化日益严重。因此， 提高土壤中磷的利用效率对降低化学磷肥的施用量具有十分重要的意义。土 壤中存在大量的微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用形 态，具有这种能力的微生物称为解磷菌或溶磷菌。溶磷微生物作为微生物肥 料的开发和利用已经成为人们关注的焦点。土壤中存在的溶磷微生物能够通 过自身生长代谢，转化难溶性磷为可溶性磷，促使作物吸收利用。但是，微 生物仅能够溶解难溶性磷，还不能被认为就是溶磷菌，溶磷菌还须考虑作物 促生效应。因此，合理利用溶磷微生物对提高作物产量、减少化学肥料使用 降低环境土壤污染具有巨大前景。
3.在农作物生长过程中，由于受生长环境等诸多因素的影响，易发生多种 病害，这些病害给农业生产造成了巨大的损失，以往人们普遍采用化学防治 的方法，化学农药虽具有效率高、见效快、施用简便、可大规模应用等优点， 但由于长时间大量使用化学农药，已造成植物病虫害耐药性种群增加、人类 健康受到威胁、自然农业生态系统的平衡遭受破坏等一系列严重后果。20 世纪90年代以来，由于人们环保意识的增强及对食品安全问题的重视，植 物病害的生物学防治得到了广泛的关注，并已在水稻、小麦、玉米、棉花、 果树、蔬菜等农作物的病害防治中取得了良好的效果。芽孢杆菌是生防微生 物的重要类群，也是自然界分布最广的微生物之一，其繁殖快、定殖能力强、 营养要求简单，具有抑制多种植物病害和促进植物生长的作用。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种莫海威芽孢杆菌，该菌同时具有 具有较强的解有机磷能力和解无机磷能力，且对小麦赤霉病菌、玉米大斑病 菌、水稻纹枯病菌等7种常见作物病原菌具有明显抑制作用，可应用于防治 相关病害。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.一种莫海威芽孢杆菌(bacillus mojavensis)ftb-p3，于2021年09月 02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 cgmcc no.23349；该莫海威芽孢杆菌的16s rdna核苷酸序列如seq idno:1所示。
7.莫海威芽孢杆菌(bacillus mojavensis)ftb-p3的生理、形态特征为： 革兰氏阴性菌，好氧型；菌体呈杆状，大小为(0.5-0.8)μm
×
(2.0-4.0) μm；芽孢呈椭圆形，长0.5-1.0
μm；菌落规则，边缘光滑湿润，不透明， 微黄色。
8.本发明的另一目的在于提供一种微生物菌剂，添加有上述莫海威芽孢杆 菌(bacillus mojavensis)ftb-p3。
9.优选的是，所述微生物菌剂中莫海威芽孢杆菌有效菌数为4.0-8.0
×ꢀ
109cfu/g。
10.优选的是，所述莫海威芽孢杆菌固定于多孔载体材料上；所述多孔载体 材料包括沸石、活性炭、硅藻土、多孔陶粒中的一种或多种。
11.优选的是，所述莫海威芽孢杆菌培养过程包括：将所述莫海威芽孢杆菌 活化后，接种于发酵培养基中，28-32℃培养12h-24h。
12.更优选的是，所述发酵培养基包括如下重量份组分：蛋白胨8-12份， 牛肉膏粉4-6份，氯化钠4-6份，琼脂9-15份，蒸馏水800-1200份，ph＝7.2-7.4。
13.本发明还提供了所述莫海威芽孢杆菌或所述微生物菌剂在土壤解磷和/ 或防治植物病害中的应用；所述植物病害病原菌包括：小麦赤霉病菌 fusarium graminearum schw、玉米大斑病菌exserohilum turcicum、水稻纹枯 病菌rhizoclonia solani、棉花枯萎病菌fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum、 油菜菌核病菌sclerotinia sclerotiorum、西瓜枯萎病菌fusarium oxysporum f. sp.niveum、番茄灰霉病菌botrytis cinerea pers。
14.本发明的有益效果：
15.本发明提供一种莫海威芽孢杆菌及其应用，该菌具有解磷和抑制作物病 原菌的作用。以菌剂的形式将本发明莫海威芽孢杆菌ftb-p3应用于农田， 可明显提升作物对磷素的利用率；对小麦赤霉病菌fusarium graminearumschw、玉米大斑病菌exserohilum turcicum、水稻纹枯病菌rhizoclonia solani、 棉花枯萎病菌fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum、油菜菌核病菌 sclerotinia sclerotiorum、西瓜枯萎病菌fusarium oxysporum f.sp.niveum、番 茄灰霉病菌botrytis cinerea pers的生长具有明显抑制效果，可用于相关病害 的防治，且防治效果优于常规化学制剂。
附图说明
16.图1为ftb-p3的菌落形态图；
17.图2为显微镜下ftb-p3菌体图。
具体实施方式
18.本发明提供了一种莫海威芽孢杆菌，菌株号为ftb-p3，于2021年09 月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址 为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.23349。
19.本发明莫海威芽孢杆菌ftb-p3是从河北省唐山市玉田县玉田镇纪家庄 村农田土壤中筛选获得的。对筛选获得的ftb-p3菌株经形态鉴定和16s rdna测序分析，确定为莫海威芽孢杆菌(bacillus mojavensis)。在营养琼 脂培养基上30℃有氧培养18h，菌体可以大量生长，菌落形态结果如图1所 示，菌落规则，边缘光滑湿润，不透明，微黄色。显微镜观察发现菌体呈杆 状，大小一般为(0.5-0.8)μm
×
(2.0-4.0)μm，芽孢呈椭圆形，长0.5-1.0 μm，如图2所示。采用细菌16s rdna通用引物序列如seq id no.2和seq id no.3所示：
20.27f(5
’‑
agtttgatcmtggctcag-3’)
21.1492r(5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’)，其中m代表简并碱基， m＝a/c，即表明m为a或c，对菌株ftb-n1进行扩增和正向测序，得到 的序列长度为1060bp，具体序列如seq id no.1所示。
22.将测序结果在ncbi数据库中进行比对，最终鉴定筛选获得的样品为莫 海威芽孢杆菌(bacillus mojavensis)ftb-p3。
23.本发明的另一目的在于提供一种添加有上述莫海威芽孢杆菌的微生物 菌剂，优选所述微生物菌剂中溶杆菌有效菌数为4.0-8.0
×
109cfu/g，该微生 物菌剂同样具备上述莫海威芽孢杆菌(bacillus mojavensis)ftb-p3生物活 性功能；进一步优选有效菌数为6.0-8.0
×
109cfu/g。优选上述莫海威芽孢杆 菌培养过程包括：将所述莫海威芽孢杆菌(bacillus mojavensis)ftb-p3活 化后，接种于发酵培养基中，28-32℃培养12h-24h；进一步优选接种于发酵 培养基中，30℃培养18h。
24.优选上述发酵培养基包括如下重量份组分：蛋白胨8-12份，牛肉膏粉 4-6份，氯化钠4-6份，琼脂9-15份，蒸馏水800-1200份，ph＝7.2-7.4；进 一步优选蛋白胨10份，牛肉膏粉5份，氯化钠5份，琼脂12份，蒸馏水1000 份，ph＝7.2-7.4。本发明对上述培养基原料没有特殊限定，采用本领域常规 市售产品即可。
25.本发明优选将培养好的莫海威芽孢杆菌(bacillus mojavensis)ftb-p3 固定于多孔载体材料上，更优选所述多孔载体材料包括沸石、活性炭、硅藻 土、多孔陶粒中的一种或多种。
26.本发明还提供了上述莫海威芽孢杆菌(bacillus mojavensis)ftb-p3或 由该菌制备的微生物菌剂在土壤解磷和/或防治作物病害中的应用。进一步优 选微生物菌剂的施用量为土壤质量的3-10
‰
，更优选施用量为土壤质量的 5
‰
。本发明中植物病害病原菌包括：小麦赤霉病菌fusarium graminearumschw、玉米大斑病菌exserohilum turcicum、水稻纹枯病菌rhizoclonia solani、 棉花枯萎病菌fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum、油菜菌核病菌 sclerotinia sclerotiorum、西瓜枯萎病菌fusarium oxysporum f.sp.niveum、番 茄灰霉病菌botrytis cinerea pers。
27.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把 它们理解为对本发明保护范围的限定。
28.实施例1
29.将莫海威芽孢杆菌ftb-p3接种于蛋白胨10份，牛肉膏粉5份，氯化钠5 份，琼脂12份，蒸馏水1000份，调节ph＝7.3，30℃下培养18h，获得莫海威 芽孢杆菌ftb-p3发酵液。将制备的发酵液与多孔载体材料沸石混合，得到莫 海威芽孢杆菌ftb-p3有效活菌数为6.0
×
109cfu/g的微生物菌剂。
30.实施例2
31.将莫海威芽孢杆菌ftb-p3接种于蛋白胨8份，牛肉膏粉4份，氯化钠4份， 琼脂9份，蒸馏水800份，调节ph＝7.2，28℃下培养24h，获得莫海威芽孢杆 菌ftb-p3发酵液。将制备的发酵液与多孔载体材料(活性炭与硅藻土等质量 混合)混合，得到莫海威芽孢杆菌ftb-p3有效活菌数为4.0
×
109cfu/g的微生 物菌剂。
32.实施例3
33.将莫海威芽孢杆菌ftb-p3接种于蛋白胨12份，牛肉膏粉6份，氯化钠6 份，琼脂15份，蒸馏水1200份，调节ph＝7.4，32℃下培养12h。获得莫海威 芽孢杆菌ftb-p3发酵液。将制备的发酵液与多孔载体材料(沸石与多孔陶粒 等质量混合)混合，得到莫海威芽孢杆菌ftb-p3有效活菌数为8.0
×
109cfu/g 的微生物菌剂。
34.实施例4
35.利用钼蓝比色法测定培养液中的有效率含量，进行溶磷能力测定。
36.将莫海威芽孢杆菌ftb-p3活化，接种于10g蛋白胨，5g牛肉膏粉，5g氯 化钠，12g琼脂，1000ml蒸馏水，调节ph＝7.3，30℃下培养18h，将菌株制备 成菌悬液。用打孔器在卵磷脂平板和磷石灰平板上打孔，每板3个，每孔接 种菌悬液30μl，重复3个平板，30℃培养。72h后测量卵磷脂平板浑浊圈直 径和磷石灰平板透明圈直径。
37.试验结果：莫海威芽孢杆菌ftb-p3在卵磷脂平板上形成的浑浊圈直径平 均为2.566cm，在磷石灰平板上形成的透明圈直径为2.473cm，表明莫海威芽 孢杆菌ftb-p3同时具有较强的解有机磷能力和解无机磷能力。
38.实施例5
39.将莫海威芽孢杆菌ftb-p3接种于pda培养基，30℃下培养18h活化。将 植物病原菌小麦赤霉病菌、玉米大斑病菌、水稻纹枯病菌、棉花枯萎病菌、 油菜菌核病菌、西瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌用8mm打孔器打出菌柄置于 pda培养基中央，在距平皿边缘2cm处接种莫海威芽孢杆菌ftb-p3，重复3 次，培养皿置于30℃条件下培养5d，观察菌落周围是否产生抑菌圈并统计抑 菌率。
40.抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径
×
100％
41.表1莫海威芽孢杆菌ftb-p3对7种病原菌的抑菌率
[0042][0043]
根据表1可以看出，莫海威芽孢杆菌ftb-p3对7种常见作物病原菌均起到 了不同程度的抑制作用。
[0044]
实施例6
[0045]
将莫海威芽孢杆菌ftb-p3活化，接种于10g蛋白胨，5g牛肉膏粉，5g氯 化钠，12g琼脂，1000ml蒸馏水，调节ph＝7.3，30℃下培养18h，将活化的菌 株固定于沸石多孔材料上，制备微生物菌剂1-3(沸石接种莫海威芽孢杆菌 ftb-p3有效菌数4.0
×
109cfu/g、6.0
×
109cfu/g和8.0
×
109cfu/g)。
[0046]
棉花枯萎病病菌nj在psa培养基上培养7d，用打孔器打成直径6mm的菌 块。
[0047]
取玉田县后湖工业聚集区某耕地壤土，湿热灭菌2次，每次1h，装入盆 中，每盆5kg。按土壤质量5
‰
施用沸石、微生物菌剂1-3，另外，设置多菌 灵处理组，以50％多菌灵可湿性粉剂棉花种子浸种1h。
[0048]
用病菌菌块拌种法接种病原菌，每盆接入菌块50块。试验共设5个处理： 1.空白对照(枯萎病菌)；2.微生物菌剂1(微生物菌剂1+枯萎病菌)；3.微 生物菌剂2(微生物菌剂2+
枯萎病菌)；4.微生物菌剂3(微生物菌剂3+枯萎 病菌)及5.多菌灵(多菌灵+枯萎病菌)，重复3次。每盆播种20粒棉花种子， 播种后30d调查棉花枯萎病发病情况。
[0049]
表2不同处理对棉花枯萎病发病率的影响
[0050]
处理病株率％防治效果％空白对照71.67——微生物菌剂143.3339.54微生物菌剂235.0051.16微生物菌剂326.6762.79多菌灵53.3325.59
[0051]
根据表2可以看出，莫海威芽孢杆菌ftb-p3对棉花枯萎病具有良好的防 治效果，能够达到39.54-62.79％，且明显优于常见杀菌剂多菌灵浸种处理。
[0052]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。