一种调控玉米茎秆穿刺强度基因ZmNR2及其分子标记的应用

et al.,2012)。
5.尽管玉米抗倒伏相关性状qtl定位研究已经取得了一定的进展，但是由于玉米倒伏性受多个性状影响，遗传基础复杂，且不同遗传背景下存在较大差异。因此，深入研究玉米遗传多样性以及挖掘其新基因具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种调控玉米茎秆穿刺强度基因zmnr2及其分子标记的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明以株型和茎杆质量存在广泛变异的自然群体为材料，利用高密度snp标记对抗倒伏相关性状进行全基因组关联分析，旨在定位控制玉米抗倒伏的关键qtl，剖析不同性状间的遗传关系，为育种实践提供理论依据。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明提供一种玉米zmnr2基因在调控玉米茎秆穿刺强度中的应用，所述玉米zmnr2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.进一步地，所述玉米zmnr2基因位于s5_210786313上游1.6kb处。
10.本发明还提供用于选择玉米茎秆穿刺强度性状的snp分子标记，位于玉米zmnr2基因的623bp处，该处碱基为c或a。
11.本发明还提供一种上述的snp分子标记在选择玉米茎秆穿刺强度性状中的应用。
12.进一步地，携带a等位碱基的品系的茎秆穿刺强度高于携带c等位基因的品系。
13.本发明还提供一种筛选或鉴定玉米茎秆穿刺强度的方法，根据上述的snp分子标记，分析玉米zmnr2基因623bp处位点的基因型，根据基因型判断待测玉米的茎秆穿刺强度的高低；进一步地，携带a等位碱基的品系的茎秆穿刺强度高于携带c等位基因的品系。
14.本发明还提供一种玉米zmnr2基因或上述的snp分子标记在玉米育种中的应用，所述玉米zmnr2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；进一步地，用于增强玉米抗倒伏能力。
15.本发明公开了以下技术效果：
16.本发明通过3个田间试验，分析了3个与茎秆强度相关的性状(茎秆穿刺强度rpr；秸秆压碎强度scs和秸秆弯曲强度sbs)和4个与株型相关的性状(株高ph；穗位高eh；茎粗sd和茎长sl)，检测到这些性状有很大的表型变异。采用一般线性模型和混合线性模型，利用372331个单核苷酸多态性(snps)进行全基因组关联分析(gwas)。共检测到94个数量性状基因座(qtl)，包含241个snps。此外，结合gwas的数据和基因表达谱，在50kb的显著snps范围内鉴定出60个候选基因，包括一些编码黄酮醇合成酶(grmzm2g069298，zmfls2)、硝酸还原酶(grmzm5g878558，zmnr2)、葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶(grmzm2g027955)和漆酶(grmzm2g447271)的基因。对grmzm5g878558在所有供试材料中进行重测序发现了2个与rpr显著相关的变异。然后通过比较zmnr2 ems突变体和野生型植株在高氮和低氮条件下的rpr，验证了grmzm5g878558的功能。这些发现可能有助于阐明茎秆强度的遗传基础。此外，已鉴定的候选基因和变异可能与玉米抗倒性的遗传改良有关。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施
例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为5号染色体上rpr的相关位点和候选基因；其中，(a)5号染色体上rpr的曼哈顿图；(b)峰值信号周围的基因(
±
50kb)；(c)grmzm5g878558(zmnr2)的基因关联定位；(d)rpr在grmzm5g878558(zmnr2)不同等位基因间的表型差异；
19.图2为snp623碱基突变情况(以a151,a017,a105,a106为例)；
20.图3为zmnr2 ems突变体与野生型(b73)在高氮(hn)和低氮(ln)条件下的表型差异；其中，(a)zmnr2的基因结构和突变位点；(b)包含突变位点的zmnr2野生型和ems突变体的测序图谱；(c)zmnr2 ems突变体与野生型(b73)在hn和ln条件下rpr的表型差异。
具体实施方式
21.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
22.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
23.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
24.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
25.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
26.玉米zmnr2基因的序列如seq id no.1所示。
27.seq id no.1：
28.》z.mays refgen_v4|zm00001d018206|5:216589276..216592402 reverse
29.gctcgtgccgacaatggcggcctccgttgagcggcacctggccccccacccgtggccggccaatgcgcctcccaagagcttcgacatgttccgctccggcggcccaggaggcaagcgccgcaccggccccgactccgactccgaggacgaggacagcattcccccggactggcggtcgctgtacagcccgcgcctggaggtggagccgcccgcccacgacccacgcgacgaggccacctccgacgcgtgggtgcggcgccacccggcgctcgtccggctcacgggcaagcaccccttcaactcggagccgccggtgccgcggctgatggcgcacggcttcatcaccccggcgccgctccactacgtgcgcaaccacggggcggtcccccgggcggactggtccacctggacagtggaggtggcggggctcgtgaggcggcccgccaggctcaccatggagcagctggtgacggagttcgaggccgtggagctccccgtcacgctggtgtgcgcgggcaaccggcgcaaggagcagaacatggtgcgccagaccgtcggcttcaactggggccccggcgccatctccacgtccgtgtggcgcggcgcgc
gcctccgcgacgtgctgcgccgctgcggcgtcatgggcgccgcggacggcgccgccaacgtctgcttcgagggcgccgaggacctccccggcggcggcggcggcggcaagtacggcaccagcctgcgccgcggggtggccatggaccccgcgcgcgacgtcatcctcgcctacatgcagaacggggagccgctcgcgcccgaccacggcttcccggtgcgcgtcatcgtgcccgggttcatcggcggccgcatggtcaagtggctcaagcggatcatcgtcgcgtccagcgagtccgagagctactaccactaccgcgacaaccgggtgctgccgtcccacgtcgacgccgacctcgccaatgccgaaggtttgtacatcggtctagttttgtttcctctgctcgccaacgtgtgcgagggcgacgacgctaataaatgttctctctgttgtacagcgtggtggtacaagccggagtgcatgataaacgagctgaacatcaactcggtgatcaccacaccaggacacgacgaggtgctgcccatcaacgccctcacgacgcagcggccgtatacgatcaaaggatacgcatactccggtgagtgagtccaacaacgcagcatttcatcatcccatcttgcattgcatcacccacgccccctggatctgagtcggagtcaaggaagagcgatccgaattttgtttgagctcgggctttctccatgttaaagcccagtaaagaaacaacgtttgaggcttctattgggctttccaagcctattttcctagtttccttgtgggctaaaaccgaaactcacggtggtggtgcctctgttgccaggtggcggccggaaagtaacccgggtggaggtgacgctggacggcggcgagacgtggcatgtgtgctcgctcgaccacccggagcgtccaaccaagtacggcaagtactggtgctggtgcttctggtccgtcgacgtcgaggtgctcgacgtgctcggggccaaggaaatcgccgtccgcgcctgggacgaggccatgaacacccagccggagaagcttgtctggaacctcatggtgagttgccgctccatcgtgtttcccttcccgtggaaccatgcatgtcctcctctccacgactgtgttagcttaaatacacgcacgtgcgtctgttcctctacgcgcagggcatgatgaacaactgctggttccgggtgaagatcaacgcgtgccggccgcacaagggcgagatcggcatggtgttcgagcacccggcgcagccgggcaaccagccgggcggctggatggcgcggcagaagcacctcgagacatcggagagcgcgcagagcacgctgaagaagagcacgtccacgcccttcatgaacacggccaccgcgcagtacaccatgtccgaggtgcgccgccacacgtccccggactccgcctggatcatcgtgcacggccacatctacgattgcacgggcttcctcaaggaccacccgggcggtgccgacagcatcctcatcaacgccggcaccgactgcaccgaggagttcgacgccatccactccgacaaggcccgcggcctcctcgagatgtaccgcgtgggcgagctcgttgtcaccggcagcgactactccccgcagaacagccacgccgacctcaaggccatcgtcgaggcccccgctgcagccgcgccgttatcggtgacgtcgaccgtcgcgctctccaatccgcgagagaaggtcaggtgccggctcgtcgataagaagagcctgtcctacaacgtgcgcctcttccggttcgcgctgccatcgccggaccagaagctcggccttcccgtcggcaggcacgtgtacgtgtgcgcgtcgataggcggcaagctctgcatgcgcgcgtacacgcccacgagccccgtcgacgaggtcggccacgtcgatctcctcatcaagatatacttcaaggacgaggaccccaagtaccccaacggcgggctcatgtcgcagtacctggactccctgccgctgggcgcgactattgacatcaagggtcccatagggcacatcgagtacgccggccgcggcggcttcgtggtgaacggcgagcgccggctcgcgcgcaggctcgccatgatcgccggcgggacgggcatcacgccggtgtaccaggtgatccaggccgtgctgagggaccagcccgacgacgacacggagatgcacctcgtgtacgcgaaccgaacggaggacgacatgctcctgcgggaggagatcgaccgcttggctgccgcgcacccggcgcgcctcaaggtgtggtacgtggtcagcaaggtggcgcgaccggaggacgggtgggagtacggcgtggggagagtggacgagcatgtcatgagggagcacctgcctctgggagacagcgagaccattgcgctcgtgtgcgggccgccggcgatgatcgagtgcacagtgcgcccgggcctggagaagatggggtacgacctcgacaaggcttgtctcgtgttctga
30.实施例1
31.1.材料与方法
32.1.1植物材料和表型
33.关联群体包括来自于中国不同地区等345份玉米自交系，对这345份自交系材料进行编号(a001-a478)。这些自交系于2015年至2017年在三亚进行了三次田间试验。每个田间试验均采用完全随机区组设计，单行区组，两次重复。每排包括13株植物，长3.5米，宽0.5
米。在开花期，从每个重复中随机选择每株系9株进行表型鉴定。计算了sd、sl、ph、eh、sbs、scs和rpr 7个性状的平均值。除ph和eh外，其余性状均在开花后2周通过分析第三节间平边中部进行测定。具体地说，使用yyd-1仪器(浙江托普云农业科技有限公司，中国浙江)的不同压力传感器测量sbs、scs和rpr。数据以n/mm2(rpr)和n(scs和sbs)记录。各表型分析按线性模型进行：y
ijk
＝μ+gi+ej+ge
ij
+bk(ej)+e
ilk
，其中μ代表群体平均值，gi代表基因型效应，ej代表环境效应，ge
ij
代表基因型与环境互作，bk(ej)代表区组效应，e
ilk
代表随机误差。使用r包lme4中的mlm计算每个性状的blup值。lme4软件包用于估计基因型基因型与环境互作和误差方差。使用以下公式计算广义遗传力：方差。使用以下公式计算广义遗传力：其中e和r分别表示环境数和每个环境中的区组数。
34.1.2基因型分析和全基因组关联分析
35.利用基因分型-测序策略对345个自交系进行了基因分型。在质量控制(缺失率≤为20％；maf≥为0.05％)之后，为gwas保留了372,331个snp。利用tassel进行主成分分析(pca)，并利用前5个主成分建立种群结构矩阵来控制种群结构。根据tassel中心ibs法计算亲缘关系矩阵，估计个体间的遗传亲缘关系。在tassel中使用glm(有pc)和mlm(有pc和亲缘关系)进行gwas。p值阈值为2.69
×
10-6
(1/n，n是snp的数量)。使用poplddecay软件测定了连锁不平衡(ld)衰变，所有染色体的平均ld在大约50kb内衰减到r2＝0.20。如果相邻两个snp之间的物理距离小于50kb，则将有意义的snp归为一个区域。此外，qtl中p值最小的snps被认为是显著的snps。
36.1.3候选基因分析和基于基因的关联作图
37.我们确定了检测位点50kb以内的所有潜在候选基因。基因注释信息从maizegdb数据库(http://www.maizegdb.org)获得。利用玉米b73 refgen_v3基因组(版本5b.60)确定了这些基因和snp的物理位置。利用已发表的基因表达数据，对不同时期的高rpr和低rpr品系进行了比较转录组分析，结果显示有8327个基因在一个或多个时期存在差异表达。
38.在基因关联作图方面，从345个自交系的新鲜幼叶中提取基因组dna。由华大基因生命科技有限公司使用nimblegen平台的靶序列捕获技术对来自测试自交系的候选基因进行测序。使用mafft软件(v7.313)进行多序列比对分析。用tassel(maf≥0.05)鉴定基于基因的多态性。根据雄穗mlm模型(mlm+pca+亲缘关系)，分析了玉米snps与目标性状的关联意义。控制全基因组1型错误率的p值阈值是1/n(其中n是候选基因的标记数)。
39.通过对b73自交系的玉米胞质雄性不育突变数据库(http://www.elabcaas.cn/memd/)的筛选，我们确定zmnr2(ems3-062433)是含有提前终止突变位点的zmnr2的胞质雄性不育突变体。用特异性引物对pcr产物进行测序，验证突变位点。2021年，在高氮和低氮条件下，在镇江种植了三个重复的b73(野生型)和zmnr2植株。播种前，施用135kg/ha的kcl和750kg/ha的cah4o8p2。在低氮和高氮条件下，分别施0kg ha-1
和180kg ha-1
的尿素。在开花后2周，如上所述评估rpr。
40.2.结果与分析
41.2.1表现变异分析
42.为探讨玉米茎秆抗倒伏的遗传基础，对345份玉米自交系在3种环境下进行了成熟期田间试验。对7个性状进行了评价，其中包括3个与茎秆强度相关的性状(茎秆穿刺强度
(rind penetrometer resistance，rpr)、秸秆压碎强度(stalk crushing strength，scs)和秸秆弯曲强度(stalk bending strength，sbs))和4个与株型相关的性状(株高(plant height，ph)、穗位高(ear height，eh)、茎粗(stem diameter，sd)和径长(stem length，sl))。性状分布分析显示略偏左的连续分布。此外，所有被检查的性状都有相当大的差异。三种环境的变异系数在8.02％(sd)～22.81％(sbs)之间。各性状间差异均在
43.1.5倍以上，品系间差异在1.59～3.07之间。双因素方差分析表明，基因型、环境和基因型与环境互作对大多数性状的影响显著(表1)。
44.表1秸秆强度性状的描述性统计
[0045][0046]
表型相关分析表明，与茎秆强度相关的3个性状之间呈极显著正相关(r＝0.422～0.764)。与植物构型相关的性状也呈高度正相关(r＝0.326-0.570)，但sd和sl之间的关系除外。研究了茎秆强度相关性状与植株构型相关性状的相关性，结果表明，4个植株构型相关性状均与相对生长率呈极显著正相关(r＝0.134～0.368)。在这四个性状中，ph、eh和sd与scs和sbs显著正相关。
[0047]
2.2全基因组关联分析(gwas)
[0048]
根据一般线性模型(glm)和混合线性模型(mlm)对372331个snp标记进行了关联分析。glm法和mlm法分别鉴定出907个和3个标记和性状关联(p《1/372331)。其中，glm出现了许多假阳性；相比之下，mlm法过于严格。放宽mlm显著阈值(p《1/10000)后，7个性状共检测到241个标记和其关联。一个特定基因组区域的多个snp与曼哈顿小区的性状密切相关。对7个性状进行聚类分析，共检测到94个qtl，每个性状检测到11～20个qtl。在第1染色体上，q14含有33个与sd相关的显著snp，其中与snp关联最显著的是s1_288149975，解释了6.9％的表型变异。在第5染色体上，q57含有8个与rpr相关的显著snp(图1a)，其中与s5_210786313关联最显著的snp解释了5.4％的表型变异。共检测到5个涉及4个性状的多效性qtl。更具体地说，q15与scs和rpr相关，q35、q37和q49与scs和sbs相关，q66与scs和sd相关(表2)。
[0049]
表2全基因组关联分析结果(部分)
[0050][0051][0052]
2.3候选基因的鉴定
[0053]
根据gwas的结果和从注释的b73玉米参考基因组(版本5b.60)筛选出的预测基因集，在94个主要snps的50kb范围内共鉴定出265个潜在候选基因(图1b)。为了检验候选基因表达谱，分析了高rpr和低rpr品系在不同发育阶段差异表达的基因。在检测到的差异表达基因中，有60个在gwas识别的位点内(图1c)。
[0054]
2.4候选基因zmnr2的验证
[0055]
zmnr2进行重测序，以研究等位基因和表型变异之间的关联。与rpr相关的snp s5_210786313位于编码硝酸还原酶的grmzm5g878558下游1.6kb处。对grmzm5g878558基因组5906bp(包括上游1879bp，编码区2682bp，下游525bp)的分析发现，有218个序列变异(maf≥0.05)，其中121个为snps，97个为indels。基于mlm的标记-性状关联分析检测到两个与rpr显著相关的变异，最显著的snp(snp623)位于第一个外显子(图2)。携带a等位基因的品系的rpr高于携带c等位基因的品系。在该snp前后设计引物如下表(表3)：
[0056]
表3 snp623检测引物
[0057][0058]
为了验证候选基因zmnr2的功能，从玉米ems突变体库(http://www.elabcaas.cn/memd/)中获得了一个zmnr2第一外显子终止突变的b73ems突变体(mut_sample：ems4-0a0498)(图3a，b)。比较了zmnr2和野生型植株在高氮(hn)和低氮(ln)条件下的rpr。我们观察到，在这两种情况下，zmnr2突变体的rpr都明显低于野生型对照(图3c)。
[0059]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。