一种反应性UCST共聚物及其制备方法

一种反应性ucst共聚物及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及温敏聚合物技术领域，特别是涉及一种反应性ucst共聚物及其制备方法。


背景技术：

2.温敏聚合物是一类重要的刺激响应性聚合物，它们可以根据温度改变而显示出溶解或不溶的可逆相转变，由于它们可以被用于催化剂、生物医药、传感器、分离技术等领域，在过去二十年间引起了极大的研究兴趣。温敏聚合物可以被分为两大类：具有最低临界溶解温度(lcst)和最高临界溶解温度(ucst)的聚合物。lcst聚合物在温度大于lcst时从溶解态转变为不溶态，而ucst的相转变性质相反。这两类聚合物中，lcst聚合物的种类和应用更加成熟丰富，而ucst聚合物由于其制备困难，研究和应用相对较少，目前仅有少量结构的ucst聚合物被开发。此外，在聚合物主链中引入反应性官能团可以增强聚合物的物理化学性质，并为进一步的后修饰和功能化提供机会。
3.目前被开发的反应性温敏聚合物仍然集中于lcst类型，而ucst类型的反应性聚合物更加匮乏。直接将几种单体(包括反应性单体在内)共聚是获得反应性ucst聚合物最简单明了的方式，但共聚单体的选择是个挑战，过强的疏水性或极性有可能导致聚合物发生不可逆的聚集，从而失去温敏性，而较弱的疏水性或极性可能使聚合物始终保持溶解状态，不能产生ucst性质。因此，开发反应性ucst聚合物能够扩展温敏聚合物的应用范围，同时也为其新的应用创造了机会，具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明针对反应性ucst共聚物制备困难，种类和数量有限的问题，提供一种反应性ucst共聚物及其制备方法。该方法选择适合的单体组合，通过将单体直接共聚的方式，能够简单方便的获得反应性ucst共聚物，其在纳米递送、生物传感器及分子纯化和富集等领域具有潜在应用价值。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明目的之一是提供一种反应性ucst共聚物，侧链结构包括：丙烯酰胺类单体和反应性单体，反应性单体具备一定的极性或疏水性，两种单体均为必要组分，其中丙烯酰胺类单体与反应性单体的摩尔比为1.7:1～20:1。
7.进一步地，所述丙烯酰胺类单体为丙烯酰胺(aam)或n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)；
8.所述反应性单体为含有琥珀酰亚胺(nhsm)或二硫吡啶基团(pdsm)的烯基单体，可以为n-丙烯氧基琥珀酰亚胺(nas)、n-甲基丙烯氧基琥珀酰亚胺(mas)、二硫吡啶基乙基丙烯酰胺(pdsam)、二硫吡啶基乙基甲基丙烯酰胺(pdsmam)、二硫吡啶基乙基丙烯酸酯(pdsa)和二硫吡啶基乙基甲基丙烯酸酯(pdsma)中的一种或多种，反应性单体的通用结构及结构举例包括但不局限于下述结构：
[0009][0010]
进一步地，所述反应性ucst共聚物的构筑结构为线性、支化或交联结构。
[0011]
进一步地，所述反应性ucst共聚物为线性或支化结构时，共聚物的分子量分布指数为1.1～3.0，重均分子量为1～20万，在纯水中能发生低温不溶-高温溶解的可逆相转变，相转变温度为15～90℃；
[0012]
所述反应性ucst共聚物为交联结构时，结构中还包括交联单体，交联度《10％，吸水倍数》60％，在纯水中能发生低温失水收缩-高温溶胀的可逆转变，转变温度为15～90℃。
[0013]
进一步的，所述交联单体为任意多烯基单体，如n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(bis)、n,n'-双(丙烯酰)胱胺(bac)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(pegdma)、双(2-甲基丙烯酰基)氧乙基二硫化物(dsdma)等；多烯基交联剂，其通用结构及结构举例包括但不局限于下述结构：
[0014][0015]
本发明目的之二是提供一种所述的反应性ucst共聚物的制备方法，以丙烯酰胺类单体和反应性单体为原料，通过自由基聚合法、可逆加成-断裂链转移聚合法(raft)或原子转移自由基聚合法(atrp)制备。
[0016]
采用普通自由基聚合、raft、atrp等方法均可，不影响共聚物的ucst性质及反应性，使用raft方法时，体系中还应包括一定比例的链转移剂；使用atrp方法时，体系中还应包括一定比例的催化剂。
[0017]
进一步地，当反应性ucst共聚物为线性共聚物时，采用自由基聚合法制备，步骤包括：将引发剂和单体溶于溶剂中，排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到反应性ucst共聚物；
[0018]
当反应性ucst共聚物为线性共聚物时，采用可逆加成-断裂链转移聚合法制备，步骤包括：将单体、链转移剂与引发剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环3次排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到反应性ucst共聚物；
[0019]
当反应性ucst共聚物为线性共聚物时，采用原子转移自由基聚合法制备，步骤包括：将单体、引发剂与铜催化剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环3次排除氧气后，聚合，除去铜催化剂和未反应单体，干燥得到反应性ucst共聚物；
[0020]
当反应性ucst共聚物为支化共聚物时，采用可逆加成-断裂链转移聚合法制备，步骤包括：将单体、支化结构的链转移剂与引发剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环3次排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到反应性ucst共聚物；
[0021]
当反应性ucst共聚物为支化共聚物时，采用原子转移自由基聚合法制备，步骤包括：将单体、支化结构的引发剂与铜催化剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环3次排除氧气后，聚合，除去铜催化剂和未反应单体，干燥得到反应性ucst共聚物；
[0022]
当反应性ucst共聚物为交联共聚物时，采用自由基聚合法制备，步骤包括：将引发剂和单体及交联剂单体溶于溶剂中，排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到交联反应性ucst共聚物。
[0023]
进一步地，所述溶剂为二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氧六环和水中的一种或多种。
[0024]
进一步地，所述单体在溶剂中的浓度为0.01～0.5g/ml，丙烯酰胺类单体和反应性单体的摩尔比为1.7:1～20:1；所述除去未反应单体具体为将反应液沉淀至沉淀剂中、将反应液过柱分离、将反应液用蒸馏水透析等方法的一种或几种组合；所述干燥为真空干燥或冷冻干燥。
[0025]
进一步地，所述引发剂的加入量为单体摩尔数的0.01～0.5％；
[0026]
所述自由基聚合法，聚合温度60～70℃，聚合时间5～24h；
[0027]
所述可逆加成-断裂链转移聚合法，聚合温度50～70℃，聚合时间10～72h；
[0028]
所述原子转移自由基聚合法，聚合温度60～90℃，聚合时间10～72h。
[0029]
本发明目的之三是提供一种组装体，通过所述的反应性ucst共聚物与含氨基或巯基的高分子发生共价反应，得到功能化的组装体。
[0030]
进一步地，含有氨基或巯基的高分子包括但不限于天然生物高分子，如蛋白质、dna等，当其为蛋白质时，共聚物与蛋白质可以发生共组装形成生物杂化纳米粒子，并且蛋白质能够在共组装后保持其二级结构和生物活性。
[0031]
本发明公开了以下技术效果：
[0032]
本发明提供了一种反应性ucst共聚物及其制备方法，以解决反应性ucst聚合物制备困难，种类和数量有限等问题。该反应性ucst共聚物由两类单体组成：丙烯酰胺类单体和反应性单体，直接共聚两种单体，并控制单体比例在一定范围内，可以直接获得反应性ucst共聚物，该共聚物的ucst性质体现为：可以在水中发生低温不溶，高温溶解的可逆相转变，相转变温度又称浊点温度(t
cp
)为15～90℃；该共聚物的反应性体现为：可以与含氨基或巯
偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐(v-50)(引发剂)、n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)、n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(nas)、溶解于无水dmso中，单体总浓度为0.1g/ml，使cmdt:v-50:naga:nas的摩尔比例为1:0.1:117:67，反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h，然后将反应液沉淀于10倍体积无水乙醇中，洗涤3次，干燥得到线性共聚物一，反应方程式为：
[0048][0049]
将该共聚物进行凝胶渗透色谱表征得到聚合物重均分子量为20200，分子量分布为1.25。图1a为该聚合物的1h nmr谱图，化学位移为6.8～8.9ppm的峰为naga的酰胺氮上的氢(a和c)；化学位移3.3～4.2ppm的峰为naga的侧链亚甲基上的氢(b)；化学位移2.9ppm的峰是nas的琥珀酰亚胺次甲基氢(d)，表明聚合物为naga和nas的共聚物，共聚物中naga和nas的摩尔比例为1.7:1。
[0050]
实施例2
[0051]
采用raft聚合法，首先将2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(ddmat)(链转移剂)、偶氮二异丁腈(aibn)(引发剂)、丙烯酰胺(aam)与n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(nas)溶解于无水dmso中，单体总浓度为0.3g/ml，使ddmat:aibn:aam:nas的摩尔比例为1:0.2:400:80，反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应20h。然后将反应液沉淀于10倍体积无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物二。反应方程式为：
[0052][0053]
将该共聚物进行凝胶渗透色谱表征得到聚合物重均分子量为35400，分子量分布为1.19。图1b化学位移为6.6～7.7ppm的峰是aam的酰胺氮上的氢(a)；化学位移2.9ppm是nas的琥珀酰亚胺次甲基氢(b)；化学位移10.6ppm处为nas部分发生水解后的丙烯酸(aac)的羧基氢。共聚物中aam:nas:aac的摩尔比例为77:5:18。
[0054]
实施例3
[0055]
采用自由基聚合法，首先将偶氮二异丁腈(aibn)(引发剂)、n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)、n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(nas)溶解于无水dmso中，单体总浓度为0.5g/ml，使aibn:naga:nas的摩尔比例为1:120:70。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应6h。然后将反应液沉淀于10倍体积的无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物三。反应方程式为：
[0056][0057]
实施例4
[0058]
采用自由基聚合法，首先将偶氮二异丁腈(aibn)(引发剂)、丙烯酰胺(aam)、n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(nas)溶解于无水dmso中，单体总浓度为0.3g/ml，使aibn:aam:nas的摩尔比例为1:400:80，反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应6h。然后将反应液沉淀于10倍体积的无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物四。反应方程式为：
[0059][0060]
实施例5
[0061]
使用atrp聚合法，将2-溴-2-甲基丙酸乙酯(ebrib)(引发剂)、氯化亚铜(cucl)、n,n,n
′
,n
″
,n
″‑
五甲基二乙烯三胺(pmdeta)(cucl与pmdeta络合后成为催化剂体系)、n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)与n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(nas)溶解于无水dmso中，使ebrib:cucl:pmdeta:naga:nas的比例为1:1:2:120:70，单体总浓度为0.2g/ml。反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h。将聚合物过硅胶柱进行纯化，随后沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物五。反应方程式为：
[0062][0063]
实施例6
[0064]
使用atrp聚合法，将2-溴-2-甲基丙酸乙酯(ebrib)(引发剂)、氯化亚铜(cucl)、n,n,n
′
,n
″
,n
″‑
五甲基二乙烯三胺(pmdeta)(cucl与pmdeta络合后成为催化剂体系)、丙烯酰胺(aam)与n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(nas)溶解于无水dmso中，使ebrib:cucl:pmdeta:aam:nas的比例为1:1:2:378:79，单体总浓度为0.5g/ml。反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h。将聚合物过硅胶柱进行纯化，随后沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物六。反应方程式为：
[0065][0066]
实施例7
[0067]
使用atrp聚合法，将溴代环糊精(cd-br，每个环糊精有17个br，即为17个atrp引发位点)(引发剂)、氯化亚铜(cucl)、n,n,n
′
,n
″
,n
″‑
五甲基二乙烯三胺(pmdeta)(cucl与pmdeta络合后成为催化剂体系)、n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)与n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(nas)溶解于无水dmso中，使br:cucl:pmdeta:naga:nas的比例为1:1:2:120:70，单体总浓度为0.1g/ml。反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应48h。将聚合物过硅胶柱进行纯化，随后沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到支化共聚物七。反应方程式为：
[0068][0069]
实施例8
[0070]
使用atrp聚合法，将溴代环糊精(cd-br，每个环糊精有17个br，即为17个atrp引发位点)(引发剂)、氯化亚铜(cucl)、n,n,n
′
,n
″
,n
″‑
五甲基二乙烯三胺(pmdeta)(cucl与pmdeta络合后成为催化剂体系)、丙烯酰胺(aam)与n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(nas)溶解于无水dmso中，使br:cucl:pmdeta:aam:nas的比例为1:1:2:378:79，单体总浓度为0.1g/ml。反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应48h。将聚合物过硅胶柱进行纯化，随后沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到支化共聚物八。反应方程式为：
[0071][0072]
实施例9
[0073]
采用raft聚合法，首先将氰甲基十二烷基三硫代碳酸酯(cmdt)(链转移剂)、2,2'-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐(v-50)(引发剂)、n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)、二甲基二硫吡啶基丙烯酰胺(pdsam)溶解于无水dmso中，单体总浓度为0.2g/ml，使cmdt:v-50:naga:pdsam的摩尔比例为1:0.2:350:88，反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应48h，然后将反应液沉淀于10倍体积无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物九。反应方程式为：
[0074][0075]
实施例10
[0076]
采用raft聚合法，首先将2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(ddmat)(链转移剂)、偶氮二异丁腈(aibn)(引发剂)、丙烯酰胺(aam)、二甲基二硫吡啶基丙烯酰胺(pdsam)溶解于无水dmso中，单体总浓度为0.3g/ml，使ddmat:aibn:aam:pdsam的摩尔比例为1:0.1:400:60，反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应72h，然后将反应液沉淀于10倍体积无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物十。反应方程式为：
[0077][0078]
实施例11
[0079]
采用自由基聚合法，首先将偶氮二异丁腈(aibn)(引发剂)、n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)、二甲基二硫吡啶基丙烯酰胺(pdsam)溶解于无水dmso中，单体总浓度为0.5g/ml，使aibn:naga:pdsam的摩尔比例为1:120:30。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h。然后将反应液沉淀于10倍体积的无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物十一。反应方程式为：
[0080][0081]
实施例12
[0082]
采用自由基聚合法，首先将偶氮二异丁腈(aibn)(引发剂)、丙烯酰胺(aam)、二甲基二硫吡啶基丙烯酰胺(pdsam)溶解于无水dmso中，单体总浓度为0.3g/ml，使aibn:aam:pdsam的摩尔比例为1:400:60，反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h。然后将反应液沉淀于10倍体积的无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物十二，反应方程式如下：
[0083][0084]
图1c核磁表征结果显示，化学位移在6.6～8.5ppm之间出现了aam的酰胺氢以及二硫吡啶环上的氢，2.9ppm和3.4ppm为pdsam侧链亚甲基氢，表明聚合物为aam和pdsam的共聚物，共聚物中aam和pdsam的摩尔比为7.1:1。
[0085]
实施例13
[0086]
使用自由基聚合法，将偶氮二异丁腈(aibn)(引发剂)、n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)与n-甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(mas)溶解于无水dmso中，使aibn:naga:mas的比例为1:400:40，单体总浓度为0.3g/ml。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应6h。然后将反应物沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物十三。反应方程式为：
[0087][0088]
实施例14
[0089]
使用自由基聚合法，将偶氮二异丁腈(aibn)(引发剂)、丙烯酰胺(aam)与n-甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(mas)溶解于无水dmso中，使aibn:aam:mas的比例为1:400:30，单体总浓度为0.5g/ml。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应6h。然后将反应物沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物十四。反应方程式为：
[0090][0091]
实施例15
[0092]
使用自由基聚合法，将偶氮二异丁腈(aibn)(引发剂)、n-丙烯酰甘氨酰胺(naga)、n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(nas)与n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(bis)(交联剂)溶解于无水dmso中，使aibn:naga:nas:bis的比例为1:200:30:5，单体总浓度为0.03g/ml。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应6h。得到交联共聚物，将上述交联共聚物置于新鲜dmso中浸泡以除去未反应的单体，然后转移至无水乙醇中置换dmso溶剂，真空干燥后得到交联共聚物十五。反应方程式为：
[0093][0094]
实施例16
[0095]
使用自由基聚合法，将偶氮二异丁腈(aibn)(引发剂)、丙烯酰胺(aam)、n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(nas)与n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(bis)(交联剂)溶解于无水dmso中，使aibn:aam:nas:bis的比例为1:378:79:9，单体总浓度为0.03g/ml。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应6h。得到交联共聚物，将上述交联共聚物置于新鲜dmso中浸泡以除去未反应的单体，然后转移至无水乙醇中置换dmso溶剂，真空干燥后得到交联共聚物十六。反应方程式为：
[0096][0097]
反应性ucst共聚物的ucst测定
[0098]
实施例17
[0099]
采用紫外可见分光光度计(uv-vis)检测溶液透射率：将浓度为2mg/ml的共聚物一和二溶于热水中，使用uv-vis检测聚合物溶液的透射率(t％)随温度的变化，变温速率0.5-2℃/min，将所得曲线的一阶导数对应的峰值定义为浊点温度(t
cp
)。
[0100]
分别称取上述共聚物一和共聚物二2mg至1ml去离子水中，加热使其完全溶解，使用紫外分光光度计在600nm波长下检测溶液的透射率(t％)随温度(t)的变化，得到如附图2所示的曲线，表明聚合物具有ucst性质，对上述两条曲线进行一阶导数分析，将峰值定义为t
cp
，测得共聚物一的t
cp
为57℃，共聚物二的t
cp
为83℃。
[0101]
实施例18
[0102]
采用粒度分析仪检测共聚物的ucst性质：将共聚物十二配置成浓度为0.5mg/ml的水溶液，然后用粒径分析仪检测共聚物十二的粒径随温度的变化，每个温度下平衡5min，每隔5℃检测一次。然后绘制粒径随温度变化曲线，如附图3所示，将粒径变化50％时对应的温度定义为浊点温度(t
cp
)，测得共聚物十二的t
cp
为51℃。
[0103]
反应性ucst共聚物的反应性——蛋白捕获与共组装
[0104]
实施例19
[0105]
将2mg/ml的共聚物二与10mg/ml的牛血清白蛋白(bsa)等体积混合，并于室温孵育5h。然后采用超滤管(截留分子量10万)离心分离(4000rpm，2min)，除去未结合的bsa，收集浓缩液得到生物杂化纳米粒子一。
[0106]
使用原子力显微镜观察得到的纳米粒子形貌，附图4a显示该粒子呈球形结构，粒径约为30-60nm。
[0107]
实施例20
[0108]
将2mg/ml的共聚物二的水溶液与10mg/ml的卵清蛋白(ova)水溶液等体积混合，并于室温孵育5h。然后采用超滤管(截留分子量10万)离心分离(4000rpm，2min)，除去未结合的ova，收集浓缩液得到生物杂化纳米粒子二。
[0109]
使用原子力显微镜观察得到的纳米粒子形貌。附图4b显示该粒子呈球形结构，粒径约为30-60nm。
[0110]
实施例21
[0111]
将2mg/ml的共聚物一的水溶液与2mg/ml的牛血清白蛋白(bsa)水溶液等体积混合，并于室温孵育5h。然后采用超滤管(截留分子量10万)离心分离(4000rpm，2min)，除去未结合的bsa，收集浓缩液得到生物杂化纳米粒子三。
[0112]
实施例22
[0113]
将2mg/ml的共聚物十二的水溶液与12mg/ml的卵清蛋白(ova)水溶液等体积混合，并于室温孵育5h。然后采用超滤管(截留分子量10万)离心分离(4000rpm，2min)，除去未结合的ova，收集浓缩液得到生物杂化纳米粒子四。
[0114]
实施例23
[0115]
将2mg/ml的共聚物十一的水溶液与12mg/ml的卵清蛋白(ova)水溶液等体积混合，并于室温孵育5h。然后采用超滤管(截留分子量10万)离心分离(4000rpm，2min)，除去未结合的ova，收集浓缩液得到生物杂化纳米粒子五。
[0116]
实施例24
[0117]
生物杂化纳米粒子中的蛋白质的二级结构检测：使用圆二色谱仪检测生物杂化纳米粒子一中的蛋白质活性，并与游离bsa进行对比，如附图5所示，两个样品的圆二色性几乎一致，表明bsa与共聚物发生反应后仍然维持了原有的二级结构。
[0118]
实施例25
[0119]
生物杂化纳米粒子中的蛋白质的生物活性的测定：乙酸对硝基苯酯可在bsa的催化下，在水溶液中水解为对硝基苯酚，利用紫外分光光度计检测产物对硝基苯酚在400nm处的吸光度，可以测定bsa的生物活性。具体的，配置bsa浓度为1mg/ml的生物杂化纳米粒子一，同时以1mg/ml的游离bsa为对照组，配置4mg/ml的乙酸对硝基苯酯的乙腈溶液，将10μl的乙酸对硝基苯酯的乙腈溶液加入至1ml生物杂化纳米粒子一或游离bsa溶液中，37℃孵育4h，然后以紫外分光光度计检测上述样品在400nm处的吸光度，将游离bsa的生物活性作为100％，进而折算生物杂化纳米粒子一相对于游离bsa的活性，结果如附图6所示，bsa在杂化纳米粒子中仍然能够保持95％以上的活性，表明共聚物与bsa的反应和共组装过程，几乎没有影响bsa原有的生物活性。
[0120]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出
的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。