一种CRISPR/Cas9基因编辑载体、构建方法及其应用

pcambia1301-cas9-sgrna载体；
12.(3)利用t4连接酶16℃连接退火后的引物和纯化载体片段，连接 产物转化大肠杆菌，获得阳性菌落扩大培养提取质粒，得到基因编辑 pcambia1301-cas9-sgrna-mehxk2载体。
13.进一步地，按照引物和载体mol比例为3:1，将退火引物、酶切 片段、t4连接酶和t4连接酶buffer混合，于16℃连接。
14.进一步地，在步骤2中将合成的靶点上下游引物用ddh2o稀释成 10μm浓度，于98℃进行退火，自然放置至室温后于16℃放置10min。 9.根据权利要求3所述的木薯中crispr/cas9基因编辑载体，其特征 在于：所述靶点引物如下：
15.mehxk2-sgrna-f:5
’‑
gattgacaagtgtgggaccccctta-3’16.mehxk2-sgrna-r:5
’‑
aaactaagggggtcccacacttgtc-3’。
17.进一步地，所述靶点引物的退火反应体系包括 18.所述的木薯中crispr/cas9基因编辑载体在华南8号木薯脆性愈 伤组织中的应用。通过木薯中crispr/cas9基因编辑载体对农杆菌介 导的木薯遗传转化，包括以下步骤：
19.(1)木薯脆性愈伤的诱导：收集木薯sc8组培苗的侧芽，在cim培 养基上诱导体胚；挑取成熟的体胚到gd培养基上诱导脆性愈伤形成；
20.(2)农杆菌侵染木薯脆性愈伤；农杆菌与脆性愈伤共培养；
21.(3)洗去愈伤中的农杆菌，在含有潮霉素的gd培养基上筛选抗性 的愈伤；
22.(4)在含有潮霉素的msn培养基诱导形成抗性子叶；
23.(5)在cem培养基上诱导子叶分化形成芽，将芽转移到ms培养基上 形成小苗；
24.(6)将转基因的植株在含有潮霉素的ms培养基中再次筛选抗性的植 株。
25.本发明采用上述技术方案与现有技术相比，最大的特点在于：
26.(1)本发明通过对木薯己糖激酶mehk2基因进行定向编辑，获得 的转基因株系数量多，编辑效率高，纯合突变类型比率大，为发明木 薯淀粉合成途径，培育淀粉品质优良的木薯品种打下了良好的基础。
27.(2)本发明建立了一种高效的木薯基因编辑体系，且所用的遗传 转化材料是在我们大面积种植的栽培种华南8号，该体系可以更好地 将发明结果转化到生产应用中。
28.能有效增加转基因木薯植株体内crispr-cas9系统的编辑能力，提 高crispr-cas9的编辑效率。
附图说明
29.图1是本发明的crispr/cas9载体图谱。
30.图2是构建pcambia1301-cas9-sgrna-mehk2编辑载体的pcr电泳 检测图。
31.图中m：marker dl2000；1-10：大肠杆菌菌液pcr。
32.图3是基因编辑载体转农杆菌的菌斑pcr检测电泳图。
33.图中m：marker dl2000；1-11：农杆菌菌斑pcr。
34.图4木薯mehk2编辑载体转化华南8号木薯脆性愈伤过程图。
35.图中a：农杆菌浸染木薯脆性愈伤组织；b：子叶长出；c：子叶发芽； d：茎伸长；e：幼芽生根发育；f：naa处理幼芽生根发育。
36.图5是提取部分转基因植株基因组的电泳检测图。
37.图中m：dl15000marker；1-6：转基因木薯株系基因组dna；7：sc8 基因组dna。
38.图6是转基因株系的cas9基因pcr鉴定图。
39.图中m：marker dl2000；1：阳性对照；2：阴性对照；3-12：转基 因株系。
40.图7是转基因纯合突变株系的测序峰图。
41.图中a：sc8的峰值图；b：株系1的峰值图；c：株系15的峰值图。
42.图8是转基因杂合突变株系的测序峰值图及序列比对。
43.图中a：株系4的峰值图及序列比对；b：株系8的峰值图及序列比 对。
44.图9是转基因植株hi-tom第一轮pcr电泳检测
45.图中m：marker dl2000；1～9：阳性株pcr；10：阴性对照；11：阳 性对照(sc8)。
46.图10是转基因植株hi-tom第二轮pcr电泳检测。
47.图中m：marker dl2000；1～10：阳性株pcr；11：阳性对照(sc8)。
具体实施方式
48.下面结合实施例和对比例对本发明的技术方案做进一步的说明，但 不应理解为对本发明的限制：
49.本发明生物材料的来源
50.1、载体pcambiai 1301-cas9-sgrna的来源
51.pcambia1301-cas9-sgrna载体大小为14141bp，cas9蛋白序列的 大小为4152bp，bsai酶切位点位于u6启动子和sgrna中间 实施例1：
52.如图1为本发明的crispr/cas9载体图谱，本实施例用于说明木薯 crispr/cas9体系的构建过程。
53.(1)利用在线设计工具crispr-p2.0选择sgrna靶序列。在木薯 基因组数据库搜索mehxk2的序列，将该序列上传到crispr-p2.0， 得到其后紧邻5
’‑
ngg(pam)的所有潜在的sgrna靶序列。sgrna靶 序列的选取遵循原则：
54.①
本实验载体上的cas9蛋白来自化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)，选取靶位点序列为5
’‑
20nt(碱基)-ngg。
55.②
在编码区的上游端、靠近atg选取靶位点。
56.③
与基因组数据库序列比对选择特异性高的sgrna靶序列以减少 脱靶现象的发生。
57.④
本发明利用拟南芥atu6启动子启动sgrna表达，atu6启动子 的转录起始位点为g，故sgrna靶序列的第一个碱基最好是g，如果 不是，可以人工在5
′
端加上一个碱基g。
58.(2)根据靶位点序列及pcambia1301-cas9-sgrna载体序列设计靶 点引物mehxk2-sgrna-f和mehxk2-sgrna-r。靶点引物如下：
59.mehxk2-sgrna-f:5
’‑
gattgacaagtgtgggaccccctta-3’60.mehxk2-sgrna-r:5
’‑
aaactaagggggtcccacacttgtc-3’61.(3)用ddh2o将靶点引物稀释成10μm浓度，稀释后的上下游引物 按照如下体系进行混合，98℃加热3min，然后自然冷却后16℃放置 10min，备用。
62.表1靶点引物的退火反应体系
[0063][0064]
(4)利用bsai-hfv2内切酶对pcambia1301-cas9-sgrna质粒进 行37℃酶切4h，酶切体系如表2。
[0065]
表2编辑载体的酶切体系
[0066][0067][0068]
电泳检测酶切效果后，用生工纯化试剂盒回收酶切片段并测定其浓 度，图2为构建pcambia1301-cas9-sgrna-mehk2编辑载体的pcr电 泳检测图。
[0069]
(4)按照引物摩尔数：载体摩尔数比例为3:1，将退火后的产物、 酶切片段、t4连接酶和t4连接酶buffer混合，于16℃连接过夜。
[0070]
表3载体和靶点引物的连接体系
[0071][0072]
(5)将连接产物、酶切后的载体(阴性)、未酶切的载体(阳性)转 化到大肠杆菌dh5α感受态(上海唯地生物)，将转化后的菌液经 短暂恢复后涂布到含有100ng/ml的卡那青霉素的培养基上，37℃倒 置培养过夜。
[0073]
(6)挑取单克隆，利用cas9检测引物f(5
’‑
gctgggccgtgatcaccgac
ꢀ‑3’
)与靶位点下游引物mehxk2-sgrna-r进行菌液pcr鉴定，图3 为基因编辑载体转农杆菌的菌斑pcr检测电泳图，将阳性克隆送测 (上海生工)，测序正确后，提取阳性菌的质粒，将重组质粒命名为 pcambia1301-cas9-sgrna-mehxk2。
[0074]
(7)将重组质粒转化到农杆菌lba4404感受态，将转化后的菌液 经过短暂的培养恢复后，均匀的涂布到含有100ng/ml的卡那青霉素 和50ng/ml的利福平的yep培养基上，28℃倒置培养24h。挑选单 克隆，利用cas9基因的检测引物f/r(r:5
’ꢀ‑
cactctcaggatgtcgctcagc-3’)进行菌液pcr鉴定，将扩增出目的 条带的阳性菌液，加等体积的40％甘油混合均匀，-80℃保存。
[0075]
实施例2：
[0076]
本实施例用于说明木薯sc8脆性愈伤诱导过程，图4为木薯mehk2 编辑载体转化华南8号木薯脆性愈伤过程图。
[0077]
(1)挑选健康的木薯sc8的幼茎，采摘到实验室，将茎杆上的叶片 去掉，用流水清洗3-6h，用10％的次氯酸钠溶液浸泡10min，在超 净工作台中用无菌水洗涤3-5次，再将消毒后的茎杆按芽点切成小 段，接种到ms培养基上，光照培养1个月；
[0078]
(2)将无污染的sc8幼苗进行扩繁，尽可能多的得到无菌的组培苗， 待组培苗达到一定数量后开始用于诱导体胚；
[0079]
(3)挑选植株达到瓶口的组培苗，用无菌的针头挑茎段上的侧芽， 放到cim培养基上诱导体胚，28℃黑暗培养16天左右；
[0080]
(4)挑取侧芽上长出来的体胚换到新的cim培养基，不断扩大培养 体胚，黑暗培养，16天换一次cim培养基；
[0081]
(5)将成熟的体胚转移到gd培养基诱导脆性愈伤的形成，不断地 挑选活性高的愈伤扩大培养，培养条件也是黑暗培养，每半个月换一 次培养基；
[0082]
(6)获得大量纯化的且活性高的愈伤后即可进行木薯的遗传转化。
[0083]
实施例3：
[0084]
本实施例用于说明农杆菌介导的木薯sc8脆性愈伤转基因的过程。 图5为提取部
分转基因植株基因组的电泳检测图；
[0085]
(1)将农杆菌划线活化，挑取单菌落到2ml离心管小摇，pcr检 测，大概20h，将离心管的菌液都加到150mlyep液体培养基中大 摇，大约8h，将农杆菌摇菌至od600＝0.75-1.0，50ml离心管集菌， 可集多次，5000rpm16℃离心10min，20ml液体gd培养基(含 250μmol/l乙酰丁香酮)清洗2遍，离心收集菌体。液体gd培养基 (含250μmol/l乙酰丁香酮)重悬农杆菌至od600＝0.65。取生长 三个月的脆性愈伤(2ml体积，约15簇)加到20ml的共侵染液， 用5ml枪头晃散愈伤，1000rpm离心10分钟，40rpm摇菌40min；
[0086]
(2)脆性愈伤转移到盖有尼龙网(120目)的吸水纸上，吸去多余 的水分，然后尼龙网转移到脆性愈伤转移到gd培养基(含250μmol/l 乙酰丁香酮)，黑暗4天，22℃；
[0087]
(3)共培养后的脆性愈伤用液体gd培养基(500mg/l羧苄青霉素) 洗菌三次，转移到尼龙网，去除多余的培养基；
[0088]
(4)尼龙网(脆性愈伤)转移到含有250mg/l羧苄青霉素的gd 培养基，黑暗，28℃，7天；
[0089]
(5)尼龙网(脆性愈伤)转移到新的gd培养基筛选(250mg/l羧 苄青霉素,8mg/l潮霉素)，黑暗，7天。重复两次，提高筛选浓度 (15mg/l，20mg/l)潮霉素；
[0090]
(6)尼龙网(脆性愈伤)转移体胚形成筛选培养基msn(250mg/l 羧苄青霉素，15mg/l潮霉素)两周换一次新培养基。8周，光照；
[0091]
(7)挑取正在形成子叶的体胚到cem培养基(100mg/l羧苄青霉 素，0.1mg/l 6-ba)中，8天，光照。重复转移(提高6-ba的浓度 0.4mg/l)，8天换一次，直到出芽(2-4周)；
[0092]
(8)切下小芽，放到cbm培养基(50mg/l羧苄青霉素10mg/l潮 霉素)，3-4周，光照；
[0093]
(9)扩繁时切下茎段，生根筛选2-3周，cbm培养基(50mg/l羧 苄青霉素，10mg/l潮霉素)；
[0094]
(10)将生根的植株进行扩繁，并提取基因组，用于后续的分子检 测。
[0095]
表4木薯转基因体系中所用的所有培养基的配方
[0096][0097][0098]
实施例4：
[0099]
本实施例用于说明转基因植株的检测和编辑效果的统计
[0100]
(1)利用成都福记的plant dna isolation kit试剂盒提取dna， 取2μl dna溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳检测后，保存在-20℃冰箱。
[0101]
(2)以转基因木薯dna为模板，利用cas9基因检测引物进行pcr 扩增，扩增目的片段大小900bp，利用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测 扩增效果。
[0102]
表5转基因检测pcr反应体系
[0103][0104]
(3)靶基因的sanger测序：设计mehxk2基因靶序列引物对转基因 木薯dna进行pcr扩增，pcr产物送测，根据测序结果进一步将结果 出现多峰的pcr产物与t-vector pmd19按比例连接，solutioni5μ l，t-vector pmd19 0.5μl，pcr产物4.5μl，16℃连接过夜。连 接产物转化e.coli dh 5α，挑取8个单菌落送测。
[0105]
(4)高通量测序检测：图6是转基因株系的cas9基因pcr鉴定图； hi-tom技术原理是对靶位点附近的基因设计特异性引物，再上下引 物5’端分别添加特定的搭桥序列，以样本dna作为模板进行第一轮 pcr，获得第一轮pcr产物；以第一轮扩增产物作为模板，进行第二 轮pcr添加接头序列和barcode，获得第二轮pcr产物；最后将所有 第二轮产物混合测序，上机即可获得最终数据)。
[0106]
参照王克剑等发明的hi-tom基因编辑位点检测的方法设计第一轮 扩增靶序列引物，扩增片段大小范围为200-250bp。正向特异引物 加正向搭桥序列5
’‑
ggagtgagtacggtgtgcggaaaggtggcgttgggtgcg
ꢀ‑3’
，反向特异引物加反向搭桥序列5
’‑ꢀ
gagttggatgctggatgggcatctcaacggtcatagcatcagcc-3’。第二轮扩 增需要接头引物根据hi-tom测序技术合成相应引物。
[0107]
表5 hi-tom第二轮接头引物序列
[0108]
[0109][0110]
首先利用sc8号木薯dna为模板进行梯度pcr，寻找合适的退火温度， 能扩增出单一的目的片段。然后以转基因木薯dna为模板，利用靶序 列引物扩增mehxk2基因靶序列的片段。pcr反应结束取3μl进行 1.2％琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。最后以第一轮pcr产物为模板， 利用接头引物进行第二轮pcr，取2μl进行1.2％琼脂糖凝胶电泳 检测pcr产物，其中图7是转基因纯合突变株系的测序峰图； 图中a：sc8的峰值图；b：株系1的峰值图；c：株系15的峰值图。 图8是转基因杂合突变株系的测序峰值图及序列比对；图中a：株系 4的峰值图及序列比对；b：株系8的峰值图及序列比对；图9是转 基因植株hi-tom第一轮pcr电泳检
测。
[0111]
表6 hi-tom第二轮pcr反应体系
[0112][0113]
将第二轮pcr产物各取25μl混合，从混合pcr产物取200μl 进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，测定文库浓度。图10为转 基因植株hi-tom第二轮pcr电泳检测。文库浓度需大于0.8ng/μl， 总量大于30ng。将文库寄到天津诺禾致源生物信息科技有限公司进 行测序并对结果进行分析。
[0114]
潜在脱靶位点分析：
[0115]
利用在线软件工具crispr-p 2.0将mehxk2靶序列与木薯全基 因组进行比对，选取与靶序列同源性较高且碱基错配在4bp以内， 还具有pam序列ngg的位点作为潜在脱靶序列。根据选取的脱靶序列 设计两对脱靶引物，利用hi-tom技术对潜在脱靶位点进行高通量测 序。
[0116]
表7脱靶引物序列
[0117][0118]
本发明通过对木薯己糖激酶mehk2基因进行定向编辑，获得纯合 的突变株，提高crispr/cas9在木薯中的编辑效率和纯合性，获得 的转基因株系数量多，编辑效率高，纯合突变类型比率大，为发明木 薯淀粉合成途径，培育淀粉品质优良的木薯品种打下了良好的基础
[0119]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范
[0120]
围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露 的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或 改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。