一种降低水体表面张力的解淀粉芽孢杆菌复合菌剂及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种降低水体表面张力的解淀粉芽孢杆菌复合菌剂及其应用。


背景技术：

2.在高密度水产养殖中，投入的大量饲料被养殖动物摄食消化后产生大量排泄物，排入水体后经微生物的分解、浮游生物新陈代谢等多因素影响，在水体表面形成油膜会阻隔空气与水的接触，增加水体的表面张力，影响了水中的溶解氧，最终影响水产动物的存活。在水产养殖中会用到化学合成的表面活性剂，来降低水体的表面张力，但是化学合成的表面活性剂属于难降解的物质，不同的化学合成表面活性剂在水体中有不同程度的残留，而且油膜即使被驱散却无法提高降解率，风向变动后未及时分解的油膜又会布满水面。
3.因此，目前有效降低表面张力、对油膜及时分解、又不对养殖水体造成二次污染的水体原位处理技术非常欠缺。


技术实现要素：

4.为了解决和克服现有技术中的问题和不足，本发明提供了一种降低水体表面张力的解淀粉芽孢杆菌复合菌剂及其应用。解淀粉芽孢杆菌hfj-7菌株具有显著的产表面活性剂能力，在水产养殖池塘使用后可驱散油膜，降低水体表面张力，提高水体溶氧。
5.为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：本发明提供了一种降低水体表面张力的解淀粉芽孢杆菌复合菌剂，所述解淀粉芽孢杆菌复合菌剂包括解淀粉芽孢杆菌菌粉、解淀粉芽孢杆菌代谢产物和复配载体。
6.进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌菌粉的活菌含量不低于1
×
10
11 cfu/g。
7.进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌菌粉是由保藏编号为cgmcc no. 10011的解淀粉芽孢杆菌hfj-7经培养发酵并干燥获得的。
8.进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌hfj-7经培养发酵后，得到的发酵液中加入体积质量比为10%~15%的轻质碳酸钙，搅匀后，喷雾干燥，喷雾干燥进风温度145℃~150℃、出风温度65℃~70℃，得到菌含量为2
×
10
11
cfu/g~2.2
×
10
11
cfu/g的解淀粉芽孢杆菌菌粉。
9.进一步的，所述复配载体为蒙脱石，其添加比例为100 kg/吨~200kg/吨解淀粉芽孢杆菌菌粉。
10.进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌代谢产物包括解淀粉芽孢杆菌hfj-7所产的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、表面活性剂，进而使解淀粉芽孢杆菌复合菌剂具有明显的排解油圈、乳化油脂的能力。
11.本发明还提供了所述的解淀粉芽孢杆菌复合菌剂在用于驱散水产养殖池塘油膜中的应用。
12.进一步的，在应用时，将所述解淀粉芽孢杆菌复合菌剂使用是其质量10倍~20倍的池水稀释后，均匀泼洒于水产养殖池塘下风口有机物、油膜较多的区域2-3天。
13.进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌复合菌剂的用量为375 g/亩
·
米~500g/亩
·
米。
14.进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌复合菌剂应用于水产养殖池塘时，能够有效驱散油膜，降低水体表面张力，提高水体溶氧。
15.与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明提供的具有产表面活性剂能力的解淀粉芽孢杆菌hfj-7，通过益生菌的繁殖产生表面活性剂在水产养殖池塘使用后可驱散油膜，起到降低水体表面张力的作用，并可以通过益生菌的繁殖产酶和乳化剂加速油膜的分解，相比化学类表面活性剂在使用中无残留并且可以起到降低表面张力和分解油膜的双重作用，从根本上解决养殖水体油膜过多问题，在水产养殖中有非常好的应用前景。
附图说明
16.图1为解淀粉芽孢杆菌hfj-7在营养琼脂培养基上的菌落、菌体与镜检图。
17.图2为不同芽孢杆菌排解油圈能力差异。
18.图3为不同芽孢杆菌乳化豆油能力差异。
19.图4为不同芽孢杆菌对豆油的乳化指数。
20.图5为不同芽孢杆菌产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力差异。
21.图6为解淀粉芽孢杆菌复合制剂排解油圈情况。
22.图7为实施例5实验1中hfj-7用量375g/亩
·
米对照组池塘油膜变化。
23.图8为实施例5实验1中hfj-7用量375g/亩
·
米试验组池塘油膜变化。
24.图9 为实施例5实验2中hfj-7用量500g/亩
·
米对照组池塘油膜变化。
25.图10 为实施例5实验2中hfj-7用量500g/亩
·
米试验组池塘油膜变化。
具体实施方式
26.结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
27.下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
28.实施例1、解淀粉芽孢杆菌hfj-7的分离筛选与鉴定保藏2012年1月至2012年3月，从山东省潍坊市寿光市上口镇10家辣椒蔬菜大棚取30个辣椒根际土样本。土样分别充分研磨，于75℃水浴内加热处理20min，然后用无菌生理盐水中1000倍稀释，于营养琼脂na平板上稀释涂布，挑取单菌落划线纯化，共筛选出68株纯菌，经镜检均为芽孢杆菌，其中包括菌株hfj-7。
29.分别采用生理生化法语分子遗传学方法，对解淀粉芽孢杆菌hfj-7进行鉴定。经细菌生理生化方法初步鉴定，菌株hfj-7为芽孢杆菌属，其生物学特性（图1）：革兰氏染色阳性，在营养琼脂平板上形成的菌落直径约3-3.5mm，边缘不整齐，中间褶皱，淡黄色；菌体形态呈杆状，芽孢椭圆形，端生，0.84
×
0.52μm。
30.接着采用分子遗传学方法，对菌株芽孢杆菌hfj-7进一步分类鉴定。首先提取菌株hfj-7的dna，以该dna为模板，16s rrna通用引物为引物，对16s rrna片段进行扩增，扩增片段进行序列测定。测序结果用blast软件与genbank中相关属种的16s rrna序列进行比对，结果显示该菌株16s rrna序列与genbank基因库中芽孢杆菌属中的bacillus pumilus的
16srrna序列同源度最高，同源率达到99%。通过dnaman6.0对genbank中已有的芽孢杆菌属的16s rrna序列进行遗传进化分析，结果显示，菌株hfj-7 16s rrna与bacillus amyloliquefaciens同源性最高，判定该菌株为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌。
31.将筛选到的解淀粉芽孢杆菌hfj-7进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2014年11月19日；解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens的保藏编号为cgmcc no.10011。
32.实施例2、排油圈法评估不同芽孢杆菌菌株产表面活性剂能力6种芽孢杆菌甘油菌于营养琼脂培养基上单菌落划线，置于37℃培养箱中培养12h，待平板长出单菌落后，挑取单菌落接种至lb液体培养基中，30℃培养54h，培养完成后取发酵液离心，8000rpm/min 离心5min，收集上清备用。取1g苏丹iii添加至100ml豆油中，充分搅拌使苏丹iii溶解于豆油中，吸取含有苏丹iii的豆油1ml，垂直加入含有20ml纯净水的一次性塑料平皿表面，确保豆油均匀的分布在水体表面。吸取20μl a（解淀粉芽孢杆菌）、b（枯草芽孢杆菌）、c（枯草芽孢杆菌）、d（短小芽孢杆菌）、e（地衣芽孢杆菌）、hfj-7六株芽孢杆菌发酵液上清滴加在油液面中间，观察其透明圈大小。
33.结果（图2）表明6株芽孢杆菌排解油圈能力差异较大，排解油圈能力由强到弱为hfj-7＞a＞b＞c＞e＞d，其中解淀粉芽孢杆菌hfj-7排解油圈能力最强，同时表明该菌株产表面活性剂能力最强。
34.实施例3、芽孢杆菌乳化油脂能力评估取实施例2中的6种芽孢杆菌发酵液上清与豆油按1:1等体积添加至试管中，每根试管于斡旋震荡仪震荡2min，震荡结束后静置于试管架，30℃过夜培养，通过测定上层有机相高度占总相的高度，计算该菌株的乳化指数。e（乳化指数）=（有机相高度/总相高度）
×
100%。
35.结果（图3和图4）表明，hfj-7乳化能力最强，乳化指数高达74%，相较于对照组提升29%，其余5株芽孢杆菌乳化指数为47%左右，与对照组差异不大，因此解淀粉芽孢杆菌hfj-7乳化能力最强，能够加快油脂的降解。
36.实施例4、产胞外酶能力评价用灭菌牙签挑取营养琼脂平板上的6株芽孢杆菌单菌落，分别点种在酪素培养基、淀粉培养基、脂肪培养基上，于37 ℃培养箱中培养24 h。在酪素培养基菌落周围滴加适量酸性汞试剂测定产蛋白酶能力，在淀粉培养基上滴加卢戈氏碘液测定产淀粉酶能力，脂肪培养基产脂肪酶能力直接测定。采用游标卡尺测量菌落及透明圈直径的大小。
37.结果表明（表1和图5），6株芽孢杆菌均具有产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的能力，但不同菌株产3 种酶能力有差异，其中解淀粉芽孢杆菌hfj-7产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力最强，其产酶强的特性能够加速池塘中有机质和油脂的降解。其余5株芽孢杆菌相较于hfj-7产酶能力较弱。
38.表1 不同芽孢杆菌产酶能力对比
实施例5、解淀粉芽孢杆菌复合制剂的制备种子培养基组分包括：糖蜜，24.5~25.0g/l；蛋白胨，13.5~13.7g/l，磷酸二氢钾，1.7~1.8g/l；柠檬酸钠，1.5~1.6g/l；硝酸铵1.5~1.6g/l；硫酸镁，0.5~0.52g/l；调节起始ph至7.2。将解淀粉芽孢杆菌hfj-7接种到装有灭菌种子培养基的种子罐中，37℃培养10h，形成种子培养液。
39.发酵培养基组成包括：豆粕粉2.8~2.9g/l；磷酸氢二钾，1.2~1.3g/l；氯化镁，0.55~0.58g/l；硫酸锰，0.15~0.16g/l；中性蛋白酶，2.0~2.1g/l；糖化酶，1.5~1.6g/l；消泡剂，1.3~1.4g/l；调节初始ph至7.4。将种子培养液转接至装有发酵培养基的生产罐进行发酵培养，37℃培养24h，当孢子率超过95%时，停罐，获得解淀粉芽孢杆菌hfj-7菌量为4.5
×
10
10
~5.0
×
10
10 cfu/ml的发酵液，发酵结束时芽孢成熟度≥95%。
40.将解淀粉芽孢杆菌hfj-7发酵液添加10%~15%的轻质碳酸钙搅拌均匀后进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度145~150℃、出风温度65~70℃，得到菌量为2
×
10
11
~2.2
×
10
11
cfu/g半成品菌粉后，加入载体蒙脱石，添加比例为100~200kg/吨，复配获得含1
×
10
11 cfu/g活菌及表面活性剂等代谢产物的解淀粉芽孢杆菌复合菌剂。其中，本发明选择的载体蒙脱石含量≥95%，吸蓝量≥40g/100g。
41.对解淀粉芽孢杆菌复合菌剂排油圈能力进行评估。取2.0g复合制剂加入100ml纯净水中搅拌充分混匀备用。取1g苏丹iii染液添加至100ml豆油中，充分搅拌使苏丹iii溶解于豆油中，在盛有20ml纯净水的培养皿中垂直滴加1ml苏丹iii-豆油液体，静置2min，使得油层均匀布满平皿表面。取20μl溶解的复合制剂滴加在平皿中含苏丹iii-豆油的水溶液表面，发现平皿中被染色的豆油会迅速被排开，说明该复合制剂有很强的降低水体表面张力的能力，达到排除油膜的能力（图6）。
42.实施例6、解淀粉芽孢杆菌复合菌剂在水产养殖池塘去油膜评估试验1：解淀粉芽孢杆菌hfj-7菌制剂300g/亩
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米去除油膜池塘验证广西北海市党江上百曲某南美白对虾池塘，池塘中藻类以绿藻为主，少量裸甲藻和蓝藻，水面有较多油膜和泡沫，水体透明度为20公分左右，虾吃料正常。对照组池塘不做任何处理，试验组使用375g/亩
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米解淀粉芽孢杆菌hfj-7菌制剂，将菌制剂加10～20倍池
水稀释后，均匀泼洒于池塘下风口有机物、油膜较多的区域，观察水体表面油膜去除情况。
43.结果如图7和图8所示，表明使用解淀粉芽孢杆菌菌制剂3d后，油膜已经完全去除，水色透明度增加5公分左右，水面清爽，而对照组塘口水体表面油膜并未减少，此结果表明解淀粉芽孢杆菌菌制剂用量为375g/亩
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米能够有效去除池塘油膜问题。
44.试验2：解淀粉芽孢杆菌hfj-7菌制剂500g/亩
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米去除油膜池塘验证广西省北海市党江更楼某南美白对虾养殖池塘，池塘以绿藻为主，少量蓝藻和裸甲藻，藻类老化，水面漂浮大量油膜和泡沫，透明度10-15公分，对照组池塘不做任何处理，试验组使用500g/亩
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米解淀粉芽孢杆菌hfj-7菌制剂，将菌制剂加10～20倍池水稀释后，均匀泼洒于池塘下风口有机物、油膜较多的区域，观察水体表面去除情况。
45.结果如图9和图10所示，表明池塘使用500g/亩
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米解淀粉芽孢杆菌hfj-7菌制剂，使用2d后水面清爽，油膜和泡沫大量减少，相较于375g/亩
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米用量，去除油膜时间缩短1天，因此该菌制剂用量为375～500g/亩
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米均能有效清除水体表面油膜，可根据使用成本控制用量。
46.以上实施案例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。