用于检测淋球菌的引物探针组合物、试剂盒及方法与流程

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于检测淋球菌的引物探针组合物、试剂盒及方法。


背景技术：

2.淋球菌(neisseria gonorrheae，ng)于1987年由neisser发现，俗称淋病双球菌获淋球菌，是引起人类淋病的致病病原体，属于奈瑟菌属。淋球菌有严格的人类寄生性，对人体有较强的适应和侵袭能力，其主要致病物质包括菌毛、外膜蛋白、蛋白酶、脂多糖等，是发病率较高的性传播疾病之一。ng主要通过性接触直接感染，还可以通过产道感染分娩时的胎儿。
3.目前淋球菌的实验室诊断方法主要有分离培养法、涂片镜检法、免疫学法、基于pcr技术的检测方法等。分离培养法的操作简单，特异性较高，被认为是诊断淋球菌的金标准，但是培养时间较长，且敏感性较低容易延误病情；涂片镜检法简便易行，价格低廉，但其特异性受取材、涂片、染色等各种因素的影响，且镜下淋病双球菌极易与其他的格兰氏阴性双球菌混淆，易发生误诊和漏诊；免疫学方法主要包括免疫胶体和酶联免疫法，操作简单且灵敏性优于培养法。近年来荧光pcr法逐渐显现了其在检测上的优势，是一种更灵敏、更特异、更精确的核酸检测技术，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及临床的关系，为临床提供更加准确，客观的检测结果，并及时的了解病情及预后。
4.目前国内外已有基于实时荧光定量pcr技术检测ng-dna的试剂盒应用于临床检测中，灵敏度约在500-1000copies/ml，这些试剂盒大多缺乏完善的质控体系，还需进一步完善和提高技术水平，使之更加满足临床准确诊断的需要。


技术实现要素：

5.本发明的目的是克服现有技术中淋球菌检测灵敏度低，缺乏完善质控体系等问题。
6.为此，本发明提供了一种用于检测淋球菌的引物探针组合物，包括目的基因引物探针组合物；所述目的基因引物探针组合物包括：
7.目的基因上游引物，其序列为：acgctccatatcgctatgaac；
8.目的基因下游引物，其序列为：tatctgtggagcttgctaggtata；
9.目的基因探针，其序列为：ctatgactatcaaccctgccgcc。
10.具体的，上述用于检测淋球菌的引物探针组合物，还包括内标引物探针组合物；所述内标引物探针组合物包括：
11.内标上游引物，其序列为：tgacaatgttggcaagactgttg；
12.内标下游引物，其序列为：gccgacaaactgggaatgaac；
13.内标探针，其序列为：tggagatcgttttgtggcttgtga。
14.具体的，上述内标为重组质粒，作为pcr扩增体系中的内控，预防样本中可能存在
的pcr干扰物质导致的假阴性，内标的序列为tgacaatgttggcaagactgttgatggagagccttttgtggcttgtgatttttg ttcattcccagtttgtcggc。
15.本发明还提供了一种用于检测淋球菌的试剂盒，包括pcr反应液；所述pcr反应液包括上述任意一项所述的用于检测淋球菌的引物探针组合物。
16.具体的，上述pcr反应液还包括10
×
pcr反应缓冲液、dntp。
17.具体的，上述用于检测淋球菌的试剂盒还包括核酸提取液，所述核酸提取液包括10-50mm的tris、0.1-1m的nacl、0.1-1mm的edta、10-50mm的naoh、0.01-0.5mm的莎梵婷、5％-20％的chelex-100和0.01-2％的十二烷基磺酸钠。核酸提取液在很大程度上简化了核酸检测的步骤，而且灵敏度有了很大的提高。
18.具体的，上述用于检测淋球菌的试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液包括5u/μl的dna聚合酶和1u/μl热启动修饰抗体，能够在低温条件下有效抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增。
19.具体的，上述用于检测淋球菌的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为淋球菌强阳性样本；所述阴性对照为不含有淋球菌、单纯疱疹病毒、沙眼衣原体的灭活阴性样本。
20.本发明还提供了一种用于检测淋球菌的方法，包括以下步骤：
21.(1)提取待测样本的dna；
22.(2)以待测样本的dna为模板，进行荧光定量pcr反应，所述pcr反应体系包括上述任意一项所述的用于检测淋球菌的引物探针组合物；
23.(3)pcr反应结束后，根据ct值判定检测结果。
24.具体的，上述步骤(2)中pcr反应程序为：95℃，3min；94℃，15sec，60℃，30sec，40个循环。
25.与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
26.本发明提供的这种用于检测淋球菌的引物探针组合物可以快速扩增目的基因，设计的内标作为pcr扩增体系中的内控，能预防样本中可能存在的pcr干扰物质导致的假阴性。本发明提供的以引物探针组合物作为主要成分的用于淋球菌核酸检测的试剂盒及检测方法，样本处理过程简单，对淋球菌核酸有很强的特异性，检测方法耗时较少，能对生殖道分泌物等未知样本中的淋球菌核酸进行准确的检测，与可经性传播、易引起相同或相似的临床症状的其他病原体无交叉反应，解决了现有技术中样本处理方法繁琐，试剂盒特异性差等问题。并且，本试剂盒灵敏度高，检测限为200copies/ml，为诊断淋球菌提供可靠的实验依据。
27.以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
28.图1是本发明实施例2中pcr反应结果。
具体实施方式
29.下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的
代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
30.本发明提供了一种用于检测淋球菌的引物探针组合物，包括目的基因引物探针组合物；所述目的基因引物探针组合物包括：
31.目的基因上游引物，其序列为：acgctccatatcgctatgaac；
32.目的基因下游引物，其序列为：tatctgtggagcttgctaggtata；
33.目的基因探针，其序列为：ctatgactatcaaccctgccgcc。
34.为了预防样本中可能存在的pcr干扰物质导致的假阴性，引物探针组合物还包括内标引物探针组合物；所述内标引物探针组合物包括：
35.内标上游引物，其序列为：tgacaatgttggcaagactgttg；
36.内标下游引物，其序列为：gccgacaaactgggaatgaac；
37.内标探针，其序列为：tggagatcgttttgtggcttgtga。
38.所述内标的序列为：
39.tgacaatgttggcaagactgttgatggagagccttttgtggcttgtgattt ttgttcattcccagtttgtcggc。
40.本发明还提供了一种用于检测淋球菌的试剂盒，包括pcr反应液、核酸提取液、酶混合液、阳性对照和阴性对照。
41.其中，pcr反应液包括上述用于检测淋球菌的引物探针组合物、10
×
pcr反应缓冲液、dntp。
42.核酸提取液包括10-50mm的tris、0.1-1m的nacl、0.1-1mm的edta、10-50mm的naoh、0.01-0.5mm的莎梵婷、5％-20％的chelex-100和0.01-2％的十二烷基磺酸钠。
43.酶混合液包括5u/μl的dna聚合酶和1u/μl热启动修饰抗体，能够在低温条件下有效抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增。
44.阳性对照为淋球菌强阳性样本；阴性对照为不含有淋球菌、单纯疱疹病毒、沙眼衣原体的灭活阴性样本。
45.本发明还提供了一种用于检测淋球菌的方法，包括以下步骤：
46.(1)提取待测样本的dna；
47.(2)以待测样本的dna为模板，进行荧光定量pcr反应，所述pcr反应体系包括上述任意一项所述的用于检测淋球菌的引物探针组合物；pcr反应程序为：95℃，3min；94℃，15sec，60℃，30sec，40个循环。
48.(3)pcr反应结束后，根据ct值判定检测结果。
49.下面通过具体实施例对本发明的用于检测淋球菌的引物探针组合物、试剂盒及方法的效果进行研究。
50.实施例1：
51.本实施例提供了一种用于检测淋球菌的试剂盒，包括如下组分：
52.(1)核酸提取液：25mm的tris、0.5m的nacl、0.5mm的edta、25mm的naoh、0.25mm的莎梵婷、12％的chelex-100、1％的十二烷基磺酸钠和浓度为5
×
105copies/ml的内标模板；内标为插入puc18t载体的一段长为74碱基对的人工合成dna序列的重组质粒，序列为：
53.tgacaatgttggcaagactgttgatggagagccttttgtggcttgtgattt ttgttcattcccagtttgtcggc；
54.(2)pcr反应液：5μl的10
×
pcr反应缓冲液、0.2mm的dntp、0.2μm的目的基因上游引物、0.2μm的目的基因下游引物、0.2μm的目的基因探针、0.2μm的内标上游引物、0.2μm的内标上游引物、0.1μm的内标探针；其中所述10
×
pcr反应缓冲液包括200mm的ph为7.5的tris-cl溶液、30mm的氯化镁溶液、500mm的氯化钾溶液；所述dntp包括datp、dctp、dttp和dgtp；
55.目的基因上游引物序列为：acgctccatatcgctatgaac；
56.目的基因下游引物序列为：tatctgtggagcttgctaggtata；
57.目的基因探针序列为：ctatgactatcaaccctgccgcc；
58.内标上游引物序列为：tgacaatgttggcaagactgttg；
59.内标下游引物序列为：gccgacaaactgggaatgaac；
60.内标探针序列为：tggagatcgttttgtggcttgtga；
61.(3)酶混合液：5u/μl的dna聚合酶和1u/μl的热启动修饰抗体；
62.(4)阳性对照；临床医院收集的淋球菌强阳性样本；
63.(5)阴性对照：不含有淋球菌、单纯疱疹病毒、沙眼衣原体的灭活阴性临床样本。
64.实施例2：
65.本实施例提供了一种使用实施例1中试剂盒检测淋球菌的方法，包括以下步骤：
66.(1)在试管中加入35.2μl的pcr反应液和0.8μl的酶混合液，充分混匀后瞬时离心，作为一份pcr-mix备用；
67.(2)向待测样本试管中加入1ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，吸取液体转至1.5ml离心管中，12000rpm离心5分钟；弃上清，向沉淀中加入50μl核酸提取液(由于核酸提取液内含固体沉淀颗粒物，为使颗粒均匀分布，每次取样时用吸头反复吸打)，混匀后2000rpm离心10sec，100℃水浴10min，12000rpm离心10min，留待测样本上清液备用；分别取50μl阴性对照和50μl阳性对照，向其中各加入50μl核酸提取液，混匀后100℃水浴10min，12000rpm离心10min，备用；
68.(3)将步骤(2)处理后的待测样本上清液、阴性对照、阳性对照各取4μl，分别各自加入到三份pcr-mix中，并将试管放入荧光定量pcr仪进行pcr扩增，反应程序为：95℃，3min；94℃，15sec，60℃，30sec，40个循环；目的基因的检测荧光为fam，内标的检测荧光为hex/vic；结果如图1所示。
69.阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。
70.阳性对照ct值小于38，阴性对照ct无数值且内标ct值＜40；在阈值以上的荧光曲线应当是具有明显的s型曲线，否则该次实验视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。
71.采用本发明提供的方法检测淋球菌时，判断标准如下：
72.1、检测样本ct≤38.0者判为阳性；
73.2、38.0＜ct≤40的检测样本建议重做，重做结果ct值《40者为阳性，否则为阴性；
74.3、如果检测样本测定的ct值无数据，需要查看内标ct值，内标ct值＜40的标本为阴性标本，内标ct值无数据则怀疑有假阴性的情况，应当重复试验。
75.以上列举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡
在与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。