具有改进的效应子功能的乙肝抗体的制作方法

本发明属于抗体，提供了一种具有改进的效应子功能的乙肝抗体，抗体与乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)特异性结合，以及包含该抗体药物组合物及其用途。

背景技术：

0、发明背景

1、1.fc受体及其在免疫系统中的作用

2、免疫系统细胞与抗体-抗原复合物的相互作用产生广泛的反应，其范围遍及效应因子功能到免疫调节信号，前者如抗体依赖的细胞毒性反应、肥大细胞脱颗粒和吞噬作用，后者如调节淋巴细胞增殖和抗体分泌。所有这些相互作用都是通过抗体或免疫复合物的fc结构域与造血细胞上的特定细胞表面受体结合来启动的。fc受体的异源性导致由抗体和免疫复合物引发的细胞反应具有多样性。fc受体共享可能介导细胞间信号转导的结构相关的配体结合区。fc受体，作为免疫球蛋白基因蛋白超家族的成员，是能够结合免疫球蛋白分子的fc部分的表面糖蛋白。通过fc受体链上的识别结构域，该家族的每一成员识别一种或多种同种型免疫球蛋白。通过其对免疫球蛋白亚型的特异性来定义fc受体。igg的fc受体称为fcγr，ige的称为fcεr，iga的称为fcαr。

3、fcγ受体(fcγr)

4、此家族的每一成员为完整的细胞膜糖蛋白，具有不同长度的与免疫球蛋白相关结构域的c2组合有关的细胞外结构域、单一的跨膜结构域和细胞内胞浆结构域。已定义了哺乳类五种中多种不同类型的igg fc受体：如在小鼠中的fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)、fcγriii(cd16)和fcγriv，和如在人类中的fcri、fcrii a、b、c，fcriiia和b。fcγri表现对抗体恒定区的高亲和力和受限的同种型特异性，而fcγrii和fcγriii具有针对igg fc区域的低亲和力但更广的同种型结合模式(ravetch和kinet，1991；hulett和hogarth，advimmunol 58,1-127(1994))。fcγriv是新近鉴定的受体，其在所有哺乳类物种中保守，具有中等亲和力和受限的亚类特异性(mechtina等人，immunogenetics 54,463-468(2002)；davis等人，immunol rev190,123-126(2002)；nimmerjahn等人，immunity 23,41-51(2005))。fcγri、fcγrii和fcγriii这三种受体由不同的基因编码，但是这三种家族成员间的广泛同源性表明它们可能通过基因复制而来源于共同的起源。本发明特别关注fcγrii(cd32)。

5、fcγrii(cd32)

6、fcγrii蛋白为40kda的完整的膜糖蛋白，因为对单体ig的低亲和性(106m-1)，其只结合复合igg。此受体是最广泛表达的fcγr，存在于所有造血细胞上，包括单核细胞、巨噬细胞、b细胞、nk细胞、中性粒细胞、肥大细胞以及血小板。fcγrii在其免疫球蛋白结合链中仅有两个免疫球蛋白样区域，并因此对igg的亲和性比fcγri要低得多。有三种fcγrii(fcγrii-a，fcγrii-b，fcγrii-c)基因，所有这些以聚集体或免疫复合物的形式结合igg。

7、fcγrii-a(cd32a)和fcγrii-b(cd32b)胞浆结构域中的明显差异产生受体结合的两种异源功能性应答。该基本原理的区别在于a同种型引发导致细胞活化如吞噬作用和呼吸暴发的细胞内信号，而b同种型引发抑制性信号，例如抑制b细胞活化。fcγra(“活化型受体”)和fcγriib(“抑制型受体”)，其具有相似的氨基酸序列且主要区别在于其胞质结构域。活化型受体fcγriia在其胞质结构域含有基于免疫受体络氨酸活化型基序(itam)。抑制型受体fcγriib在其胞质结构域含有基于免疫受体络氨酸的抑制型基序(itim)(参见综述daron annu rev immunol，15,203-234(1997)；fcr综述于ravetch和kinet，annu revimmunol，9,457-92(1991)；capel等人，immunomethods，4,25-34(1994)和de haas等人，jlab clin med，126,330-41(1995)，nimmer jahn和ravetch 2006，ravetch fc receptorsin fundamental immunology，william paul编，第五版)。

8、通过fcγr的信号事件

9、结合后，活化和抑制信号均由fcγr转导。不同受体同种型间的结构差异导致这些截然不同的相反功能。所述受体的胞浆内的信号发生结构域的两种不同结构域称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)或基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)，它们引起不同反应。招募这些结构的不同胞浆酶使fcγr介导的细胞反应发生。含itam的fcγr复合物包括fcγri、fcγriia、和fcγriiia，而含itim的复合物仅包括fcγriib。

10、人中性粒细胞表达fcγriia基因。通过免疫复合物或特异性抗体交联聚集的fcγriia使itam与受体相关激酶聚集在一起，这促进itam磷酸化。itam磷酸化作为syk激酶的锚定位点，该syk激酶的活化使下游底物(例如pi3k)活化。细胞的活化使前炎性介质释放。

11、fcγriib基因在b淋巴细胞上表达，其细胞外结构域与fcγriia有96％相同，且以不能区别的方式结合igg复合物。根据fcγriib细胞浆结构域中的itim的存在来确定fcγr的这种抑制性亚族。最近，建立了此抑制的分子基础。当与活化的fcγr结合时，fcγriib中的itim出现磷酸化并吸引肌醇多磷酸5’-磷酸酶(ship)的sh2结构域，其水解磷酸肌醇信使，该信使是由于含itam的fcγr介导的酪氨酸激酶活化而释放的，从而防止了细胞内ca++的内流。因此fcγriib的交联阻断了对fcγr连接的活化反应并抑制了细胞反应性。由此破坏了b细胞活化、b细胞增殖和抗体分泌。

12、wo2019125846公开了一种具有改进的效应子功能的人igg fc结构域变体，根据eu编号，通过将igg1 fc结构域的g236a/a330l/i332e的氨基酸突变方式，可以获得针对hfcγriia、hfcγriiia、hfcrn或/和hfcγriiib的更高的结合亲和力，且针对hfcγriib更低的结合亲和力；进一步地，在此基础上，增加m428l/n 434s突变方式，可以获得更长的半衰期。

13、wo2012115241公开了一种fcγriib特异性fc抗体，与亲本多肽相比，与fcγriia遗传多态性的h型、r型的任一种结合活性维持或降低，且与fcγriib的结合活性增强，改变的方式为，根据eu编号，igg fc区域的p238d突变方式即可达到，为获得更佳的效果，在对igg fc区域的p238d突变的基础上，进一步地包含如下中的任意一种或多种的组合：e233d；l234w或y；g237w、f、a、d、e、l、m或y；s239d、g、l或e；s267v、q、a、m、e或d；p271g或l、y296d、v323i、l或m；k326l、q、e、m、d、s、t、a、n、w、i、f、v、y、p或h，比如p238d/l234y、p238d/l234w、p238d/g237a、p238d/g237d、p238d/g237e、p238d/g237f、p238d/g237l、p238d/g237m、p238d/g237w、p238d/g237y、p238d/g239d；e233d/g237d/p238d/h268d/p271g/a330r、g237d/p238d/h268d/p271g/a330r、g237d/p238d/p271g/a330r、g237d/p238d/p271g/a330r、g237d/p238d/h268d/p271g/k326a/a330r、e233d/l234y/g237d/p238d/p271g/k326d/a330r、e233d/g237d/p238d/h268d/p271g/a330k、e233d/g237d/p238d/p271g/a330k、e233d/l234y/g237d/p238d/p271g/k326d/a330k、l234y/g237d/p238d/k326a/a330r、e233d/l234y/g237d/p238d/k326a/a330r、e233d/l234y/g237d/p238d/y296d/k326a/a330r等方式。chu,s.y.等通过对igg1 fc区域的s267e/l328f的突变方式，也获得了与fcγriib结合活性提高的变体(chu,s.y.et al.,2008:inhibition of b cellreceptor-mediated activation of primary human b cells.molecular immunology45,3926-3933)。

14、对于fcγriii的结合，shields,r.l.等通过突变e233-g236、p238、d265、a327、p329、d270、q295、a327、s239、e269、e293、y296、v303、a327、k338和d376中的至少一个氨基酸，发现其突变后与fcγriiia的结合活性降低，此外也测定了与fcγriia和fcγri的结合活性(shields,r.l.et al.,j biol.chem.276(2001)6591-6604)。bruhns等发现，f158的突变可以降低与fcγriiia的结合活性，而v158的突变可以增强与fcγriiia的结合活性(bruhns et al.,blood 113:3716-3725(2009))。

15、抗体fc结构域变体

16、从以上所述机理及许多fda批准的单克隆抗体的临床应用中可以得出结论，改变抗体的fc结构域可以调节抗体与fcγ受体(fcγr)之间的相互作用，进而调节抗体功能和活性。已有研究表明多种治疗性mab的体内保护活性显示依赖于fc-fcγr相互作用，优化出增强的fcγr结合能力的fc结构域变体显示改进的治疗结果(非专利文献1)。例如，fda批准的抗cd20mab奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)已显示相较于未进行fc改造的抗cd20 mab更为优秀的疗效，奥滨尤妥珠单抗被工程化以增强结合活化型fcγr，fcγriiia(非专利文献1)。

17、还有报告称，fcγriib的调节缺陷与人的自身免疫疾病相关。例如有报告指出：fcγriib的启动子区或细胞跨膜区的遗传多态性与系统性红斑狼疮(sle)的发病频率相关(非专利文献2、非专利文献3、非专利文献4、非专利文献5、非专利文献6)、或sle患者的b细胞表面的fcγriib的表达低下(非专利文献7、非专利文献8)。

18、2.治疗领域

19、乙型肝炎病毒(hbv)感染呈世界性流行，但不同地区hbv感染的流行强度差异很大。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染hbv，其中2.4亿人为慢性hbv感染者，每年约有65万人死于hbv感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌(hcc)。全球肝硬化和hcc患者中，由hbv感染引起的比例分别为30％和45％。我国肝硬化和hcc患者中，由hbv感染引起的比例分别为60％和80％。我国是慢性乙型肝炎的人口大国，流调显示目前尚有超过7％的人为乙型肝炎病毒感染者，总人数接近1亿人。截至2015年底，只有9％的乙型肝炎病毒感染者得到了检测和诊断；在诊断为乙型肝炎病毒感染的患者中，仅有8％接受了治疗(中国肝炎防治基金会数据)。他们不仅需要长期甚至终身治疗，为家庭、社会带来巨大负担，而且还有发展成肝硬化、肝癌的危险。据测算，我国有2800万慢性乙型肝炎患者，每年新增近百万肝硬化病人和约30万肝癌病人。按照慢性肝炎患者5％的就诊率和肝硬化、肝癌患者95％的就诊率推算，我国每年用于治疗乙型肝炎相关的直接医疗费用达到800亿元-1200亿元。

20、乙型肝炎患者经抗病毒治疗后，虽可降低体内病毒载量，延缓严重疾病进程，但很多人不能完全清除乙型肝炎病毒。乙型肝炎患者需要长期服药，患者经济负担严重。根据中国疾控动态公布的数据显示，慢性肝炎患者的年平均诊疗费用占家庭年均总收入的56.24％，代偿性肝硬化占81.53％，失代偿性肝硬化占157.21％，肝癌占96.76％。沉重的经济负担造成很多患者或者放弃治疗或者导致家庭因病返贫。此外，从近十余年肝病的诊疗费用演变过程看，肝病的诊疗费用呈现逐年递增势态，每年增幅10％～20％左右，个人承担部分也随之增加。

21、研究显示乙型肝炎患者血液中大量存在的由hbsag组成的亚病毒颗粒是抑制免疫系统使感染肝细胞无法清除的主要原因。依靠某种技术降低血液中hbsag水平10-100倍，可激活人体自身的t细胞免疫，使得机体自身免疫系统可开始有效杀伤被感染肝细胞。因此有效降低血液中的hbsag水平不但是乙型肝炎重要的治愈标准之一，更是治疗乙型肝炎清除被感染细胞的前提。

22、最新的临床研究结果显示,经过核苷酸类似物治疗清除病毒dna的患者，如果hbsag低于某个水平(如hbsag<1500iu/ml)，其干扰素清除hbsag的几率可超过50％，远大于我们通常认为的干扰素治愈率只有5-10％的比例。

23、但由于目前缺少有效降低hbsag的药物，绝大部分患者(超过90％)hbsag水平均超过这个指标，导致干扰素无法治愈这些病人(这就是干扰素治愈率只有5-10％的原因)。这些新的临床证据对降低hbsag的治疗方法有了更现实更迫切的需要。

24、目前研究发现降低表面抗原主要有3种途径：抑制hbsag的表达(sirna)、阻止hbsag从细胞释放(naps)、hbsag抗体。

25、现有技术文献

26、非专利文献1：goede,v.等人，n engl j med 370,1101-1110(2014)

27、非专利文献2：hum genet,117(2-3),220-227,2005

28、非专利文献3：j biol chem,282(3),1738-1746,2007

29、非专利文献4：arthritis rheum,54(12),3908-3917,2006

30、非专利文献5：nat med,11(10),1056-1058,2005

31、非专利文献6：j immunol,176(9),5321-5328,2006

32、非专利文献7：j exp med,203(9),2157-2164,2006

33、非专利文献8：j immunol,178(5),3272-3280,2007

技术实现思路

1、本发明提供了一种与乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)特异性结合的抗体及其fc结构域变体来满足治疗与乙型肝炎病毒(hbv)感染相关疾病的需求。

2、经过筛选我们已经获得了多株抗体，体外研究表明本发明抗体可特异性结合hbsag，动物模型研究结果显示可有效降低hbsag水平。进一步地，通过引入突变或改变fc区域中的某些氨基酸来操纵、改变或控制抗体/免疫球蛋白的生物活性，其中包括例如下列的一个或多个方面：fc受体结合、fc受体亲和力、fc受体特异性、补体激活、信号传递活性、靶向活性、效应子功能(如程序化细胞死亡或细胞吞噬作用)、半衰期、清除和转胞吞作用。

3、在第一方面，本发明提供了一种特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(vh)序列和轻链可变区(vl)序列，其中：

4、所述重链可变区包含如下所示的互补决定区(cdr)氨基酸序列：所述重链可变区包含如下所示的互补决定区(cdr)氨基酸序列：

5、hcdr1：x1yx3fx5x6x7y，

6、hcdr2：x11nx13x14x15x16x17x18，

7、hcdr3：ardx21wx23x24x25x26dx28ygmdx33；

8、所述轻链可变区包含如下所示的cdr氨基酸序列：

9、lcdr1：x34x35x36sx38x39，

10、lcdr2：x40x41x42，

11、lcdr3：qqsystplx51；

12、其中：

13、x1选自g或a，x3选自t、a或s，x5选自t、a或i，x6选自g、a、y或d，x7选自y或a，x11选自i或a，x13选自p或a，x14选自n、a或y，x15选自s、a或n，x16选自g或a，x17选自g或a，x18选自t或a，x21选自l、v或a，x23选自n、q或a，x24选自d、q或a，x25选自d、g或a，x26选自v、g或a，x28选自y或a，x33选自v或a，x34选自q或a，x35选自s或a，x36选自i、a或v，x38选自t、a或s，x39选自y或a，x40选自a、g、d、t或s，x41选自a或s，x42选自a或s，x51选自t或a，

14、所述抗体重链恒定区选自igg1恒定区区，所述恒定区包含至少一个氨基酸的突变，相对于突变前的抗体，具有升高或降低的结合fcγriia和/或fcγriib的活性；一个优选的实施方案是，所述的恒定区氨基酸的突变，为选自igg恒定区的fc结构域中的至少一个氨基酸。

15、本领域技术人员应当知晓，所述通式中各xn(其中n代表通式中各x的整数角标)的各个取值均可互相组合。例如，在一些实施方案中，hcdr1中x1、x3、x5、x6和x7依次选自下述的任一种组合：g、t、t、g、y；a、t、t、g、y；g、a、t、g、y；g、t、a、g、y；g、t、t、a、y；g、t、t、g、a；g、s、i、g、y；g、t、t、d、y；g、t、t、y、y。在一些特定的实施方案中，hcdr1选自gytftgyy(seq id no：17)；gysfigyy(seq id no：18)；gytftdyy(seq id no：19)；gytftyyy(seq id no：20)。

16、hcdr2中x11、x13、x14、x15、x16、x17、x18依次选自下述的任一种组合：i、p、n、s、g、g、t；a、p、n、s、g、g、t；i、a、n、s、g、g、t；i、p、a、s、g、g、t；i、p、n、a、g、g、t；i、p、n、s、a、g、t；i、p、n、s、g、a、t；i、p、n、s、g、g、a；i、p、y、n、g、g、t。在一些特定的实施方案中，hcdr2选自inpnsggt(seq id no：21)；inpynggt(seq id no：22)。

17、hcdr3中x21、x23、x24、x25、x26、x28、x33依次选自下述的任一种组合：l、n、d、d、v、y、v；a、n、d、d、v、y、v；l、a、d、d、v、y、v；l、n、a、d、v、y、v；l、n、d、a、v、y、v；l、n、d、d、a、y、v；l、n、d、d、v、a、v；l、n、d、d、v、y、a；v、q、q、g、g、y、v。在一些特定的实施方案中，hcdr3为ardlwnddvdyygmdv(seq id no：23)或ardvwqqggyyyymdv(seq id no：24)。

18、lcdr1中x34、x35、x36、x38、x39依次选自下述的任一种组合：q、s、i、t、y；a、s、i、t、y；q、a、i、t、y；q、s、a、t、y；q、s、i、a、y；q、s、i、t、a；q、s、i、s、y；q、s、v、s、y。在一些特定的实施方案中，lcdr1选自qsisty(seq id no：25)；qsissy(seq id no：26)；qsvssy(seq id no：27)。

19、lcdr2中x40、x41、x42依次选自下述的任一种组合：a、a、s；s、a、s；a、s、s；a、a、a；g、a、s；d、a、s；t、a、s；在一些特定的实施方案中，lcdr2选自aas(seq id no：28)；gas(seq idno：29)；das(seq id no：30)；tas(seq id no：31)。

20、lcdr3中的x51选自：t或a。在一些特定的实施方案中，lcdr3为qqsystplt(seq idno：32)。

21、在一些实施方案中，所述vh包含：

22、如seq id no：17所示的hcdr1，如seq id no：21所示的hcdr2，如seq id no：23所示的hcdr3；或

23、如seq id no：20所示的hcdr1，如seq id no：21所示的hcdr2，如seq id no：24所示的hcdr3；或

24、如seq id no：18所示的hcdr1，如seq id no：22所示的hcdr2，如seq id no：23所示的hcdr3；或

25、如seq id no：19所示的hcdr1，如seq id no：21所示的hcdr2，如seq id no：23所示的hcdr3。

26、在一些实施方案中，所述vl包含：

27、如seq id no：25所示的lcdr1；如seq id no：28所示的lcdr2，如seq id no：32所示的lcdr3；或

28、如seq id no：26所示的lcdr1；如seq id no：28所示的lcdr2，如seq id no：32所示的lcdr3；或

29、如seq id no：27所示的lcdr1；如seq id no：29所示的lcdr2，如seq id no：32所示的lcdr3；或

30、如seq id no：27所示的lcdr1；如seq id no：30所示的lcdr2，如seq id no：32所示的lcdr3；或

31、如seq id no：26所示的lcdr1；如seq id no：30所示的lcdr2，如seq id no：32所示的lcdr3；或

32、如seq id no：26所示的lcdr1；如seq id no：31所示的lcdr2，如seq id no：32所示的lcdr3。

33、优选地，本发明所述抗体或片段，其中vh序列与vl序列选自如下任一组的序列：seq id no：1与seq id no：7、seq id no：1与seq id no：8、seq id no：2与seq id no：8、seq id no：2与seq id no：12、seq id no：2与seq id no：13、seq id no：3与seq id no：8、seq id no：4与seq id no：8、seq id no：5与seq id no：9、seq id no：5与seq id no：10、seq id no：5与seq id no：11、seq id no：6与seq id no：7、与上述vh序列或vl序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。

34、所述乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)特异性结合的抗体及其抗体片段，其vh区中还包含人类通用框架区(fr)。

35、vh包含如下所示的fr氨基酸序列：

36、hfr1：z1z2z3lz4z5sgaevkkpgasz6kvsckas

37、hfr2：z7hwvrqapgqgz8ewmgw

38、hfr3：nyaqkfqgrvtz9tz10dz11sz12staymelsz13lrsz14dtavyyc

39、hfr4：wgz15gtz16vtvss

40、vl包含如下所示的fr氨基酸序列：

41、lfr1：z17z18z19ltqspz20z21lsz22sz23gz24rz25tz26z27cras

42、lfr2：lz28wyqqkpgz29apz30lliz31

43、lfr3：z32z33z34z35gz36pz37rfsgsgsgtz38ftltiz39slz40z41z42dz43atyyc

44、lfr4：fgz44gtz45z46z47ikr

45、其中，

46、z1选自q或e，z2选自v或i，z3选自q或t，z4选自v或k，z5选自e或q，z6选自v或m，z7选自m、i或l，z8选自l或p，z9为m或i，z10为r或a，z11为t或k，z12为i或t，z13为r或s，z14为d或e，z15选自k或q，z16选自l或m，z17选自d或e，z18选自i或t，z19选自q、t或v，z20选自s、a或g，z21选自s或t，z22选自a或l，z23选自v或p，z24选自d或e，z25选自v或a，z26选自i或l，z27选自t或s，z28选自n或a，z29选自k或q，z30选自k、q或r，z31选自y或s，z32选自s或n，z33选自l或r，z34选自q或a，z35选自s或t，z36选自v或i，z37选自s或a，z38选自d或e，z39为s或r，z40选自q或e，z41选自p或s，z42选自e或g，z43选自f或l，z44选自g、q或p，z45选自k或r，z46选自v或l，z47选自d或e。

47、本发明中，所述的重链恒定区，为选自人igg1的fc区域，一个具体的实施方案中，所述fc区域为野生型的序列(如seq id no：14所示)：

48、在一个实施方案中，所述抗体重链恒定区的fc区结构域的1个氨基酸被取代。在另一个实施方案中，所述抗体fc区结构域的2个氨基酸被取代。在另一个实施方案中，所述抗体fc区的3个氨基酸被取代。在又一个实施方案中，所述抗体fc区的4、5、6或7个氨基酸被取代。

49、本发明所述抗体的重链恒定区的fc结构域氨基酸改变是选自以下的至少一个置换，且其中根据kabat中的eu索引进行编号：

50、eu编号第233位的glu置换为asp；

51、eu编号第234位的leu置换为trp或tyr；

52、eu编号第236位的gly置换为ala；

53、eu编号第237位的gly置换为trp、phe、ala、asp、glu、leu、met或tyr；

54、eu编号第238位的pro置换为asp；

55、eu编号第239位的ser置换为asp、ala、thr或lys；

56、eu编号第267位的ser置换为val、gln、ala或glu；

57、eu编号第268位的his置换为asn、asp或glu；

58、eu编号第271位的pro置换为gly；

59、eu编号第272位的glu置换为asp；

60、eu编号第296位的tyr置换为asp；

61、eu编号第323位的val置换为ile、leu或met；

62、eu编号第326位的lys置换为leu、gln、glu、met、asp、ser、thr、ala或asn；

63、eu编号第328位的leu置换为phe或tyr；

64、eu编号第330位的ala置换为lys、arg、met或leu；

65、eu编号第332位的ile置换为glu；

66、eu编号第428位的met置换为leu；

67、eu编号第434位的asn置换为ser。

68、在一些实施方案中，所述抗体fc结构域的2个氨基酸被取代：在一些实施方案中，抗体fc结构域氨基酸改变是eu编号第267位的ser置换为val、gln、ala或glu、第328位的leu置换为phe或tyr。在一些实施方案中，抗体fc结构域氨基酸改变是eu编号第326位的lys置换为leu、gln、glu、met、asp、ser、thr、ala或asn、第328位的leu置换为phe或tyr。

69、在一些实施方案中，所述抗体fc结构域的3～6个氨基酸被取代：在一些实施方案中，抗体fc区氨基酸改变是eu编号第236位的gly置换为ala、第330位的ala置换为lys、arg、met或leu、第332位的ile置换为glu。以上各突变序列可进一步包含第239位的ser置换为asp、ala、thr或lys。在一些实施方案中，为了增加抗体的半衰期，fc变体可进一步在位点428包含leu和/或在位点434包含ser。

70、一个具体的实施方案是，所述抗体fc结构域的改变可以获得更好的与fcγriia的结合活性，并且降低与fcγriib的结合活性，所述的变体包括：g236a/a330l/i332e、或g236a/s239d/a330l/i332e、或g236a/s239a/a330l/i332e、或g236a/s239t/a330l/i332e、或g236a/s239k/a330l/i332e的突变，还可以是如g236a/a330k/i332e、g236a/a330r/i332e、g236a/s239a/a330r/i332e g236a/s239t/a330m/i332e、g236a/s239k/a330r/i332e、g236a/s239k/a330l/i332e、s267e/l328f、s267q/l328f等方式的突变。

71、为了延长抗体的半衰期，本发明所述抗体的fc结构域氨基酸，在上述fc结构域改变的基础上，进一步包括在m428 l和n434s的突变方式，一个具体的方式是：所述的变体包括或g236a/a330l/i332e/m428l/n434s、g236a/s239d/a330l/i332e/m428l/n434s、或g236a/s239a/a330l/i332e/m428l/n434s、或g236a/s239t/a330l/i332e/m428l/n434s、或g236a/s239k/a330l/i332e/m428l/n434s、或s267e/l328f/m428l/n434s的突变。

72、在一些实施方案中，所述抗体fc结构域至少包含有eu编号第238位的pro置换为asp的改变，使得该抗体与fcγriib的结合活性增强，与h型和r型中任意遗传多态性的fcγriia的结合活性均维持或降低。所述氨基酸改变是eu编号第238位的pro置换为asp和选自以下的至少一个另外的置换：

73、eu编号第233位的glu置换为asp；

74、eu编号第234位的leu置换为trp、tyr；

75、eu编号第237位的gly置换为trp、phe、ala、asp、glu、leu、met或tyr；

76、eu编号第239位的ser置换为asp；

77、eu编号第267位的ser置换为val、gln或ala；

78、eu编号第268位的his置换为asn、asp或glu；

79、eu编号第296位的tyr置换为asp；

80、eu编号第271位的pro置换为gly；

81、eu编号第272位的glu置换为asp；

82、eu编号第323位的val置换为ile、leu或met；

83、eu编号第326位的lys置换为leu、gln、glu、met、asp、ser、thr、ala或asn；

84、eu编号第330位的ala置换为lys、arg或met。

85、一个具体的实施方案中，本发明所述的抗体，fc结构域突变以获得针对fcγriib结合活性提升，但对fcγriia结合活性不变或降低的突变方式可以是：p238d/l234y、p238d/l234w、p238d/g237a、p238d/g237d、p238d/g237e、p238d/g237f、p238d/g237l、p238d/g237m、p238d/g237w、p238d/g237y、p238d/g239d、s267e/l328f；e233d/g237d/p238d/h268d/p271g/a330r、g237d/p238d/h268d/p271g/a330r、g237d/p238d/p271g/a330r、g237d/p238d/p271g/a330r、g237d/p238d/h268d/p271g/k326a/a330r、e233d/l234y/g237d/p238d/p271g/k326d/a330r、e233d/g237d/p238d/h268d/p271g/a330k、e233d/g237d/p238d/p271g/a330k、e233d/l234y/g237d/p238d/p271g/k326d/a330k、l234y/g237d/p238d/k326a/a330r、e233d/l234y/g237d/p238d/k326a/a330r、e233d/l234y/g237d/p238d/y296d/k326a/a330r、g237m/p238d/e272d/k326s/a330r、g237e/p238d/e272d/k326n/a330r、g237e/p238d/e272d/k326t/a330r等。

86、一个优选的实施例中，本放所述的抗体fc结构域突变为p238d/s267e/l328f、g237d/p238d/p271g/e272d/a330r、g237d/p238d/e272d/k326a/a330r或e233d/g237d/p238d/h268d/p271g/a330r。

87、如本文所公开，本发明提供具有人igg fc变体(如higg1 fc)的抗体。在一些实施方案中，fc结构域包含一个或多个氨基酸序列的取代。尽管不局限于此，下文提供了示例性突变的fc区域序列。在每个序列中，突变的氨基酸残基加粗加下划线。残基编号遵循eu编号系统，且第一个残基a对应于eu编号系统下的位点118。

88、野生型：

89、astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：14)

90、(g236a/a330l/i332e):

91、

92、

93、(g236a/a330l/i332e/m428l/n434s):

94、

95、(g236a/s239t/a330l/i332e):

96、

97、(g236a/s239t/a330l/i332e/m428l/n434s):

98、

99、(g236a/s239a/a330l/i332e):

100、

101、

102、(g236a/s239a/a330l/i332e/m428l/n434s):

103、

104、(g236a/s239k/a330l/i332e):

105、

106、(s267e/l328f):

107、

108、(e233d/g237d/p238d/h268d/p271g/a330r):

109、

110、(g237d/p238d/p271g/e272d/a330r):

111、

112、

113、(g237d/p238d/e272d/k326a/a330r):

114、

115、本发明的抗体，所述的重链可变区(vh)包含如seq id no：1-6任意所示的序列，所述重链可变区任意第可连接如选自seq id no：33～43序列中的恒定区序列。

116、在第二方面，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区选自κ链或λ链，在一些实施方案中，所述轻链恒定区包含seq id no：15中所示的氨基酸序列，或包含与seq id no：15具有70％或以上序列同一性的氨基酸序列(例如75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列)。

117、轻链恒定区：

118、tvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no：15)

119、在第三方面，抗体可选自由嵌合抗体、人源化抗体或人抗体组成的组。本发明所述抗体可具有以下一种或多种特征：(1)相较于恒定区未突变前的抗体，针对fcγriib的结合活性增强，与fcγriia的结合活性维持或降低；或者，(2)相较于恒定区未突变前的抗体，针对fcγriib的结合活性降低，与fcγriia的结合活性增强；或者，(3)相较于恒定区未突变前的抗体，具有相同或更长的血清半衰期；或者(4)相较于恒定区未突变前的抗体，具有相同或更优的消除半衰期。

120、在第四方面，本发明还涉及包含编码上述抗体的序列的分离核酸(isolatednucleic acid)，包含该核酸的表达载体，和包含该核酸的宿主细胞。宿主细胞可用于生产目标抗体。该方法包括在允许核酸编码的抗体表达的条件下在培养基中培养宿主细胞，和从培养的细胞或细胞培养基中纯化抗体。

121、在第五方面，本发明提供一种药物配方产品，其包含：本发明所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、构建体、宿主细胞。

122、在第六方面，本发明提供了治疗或预防乙型肝炎病毒(hbv)感染，或缓解乙型肝炎症状的方法，该方法包括将治疗有效量的上述抗体或核酸等施用给有需要的受试者。

123、定义

124、如本文所用，术语“抗体”也称为“免疫球蛋白”，涵盖具有天然抗体结构特征的抗体和具有不同于天然抗体的结构特征但表现出对抗原分子的结合特异性的抗体样分子。术语抗体旨在包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)或亚型(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。

125、在本文中，抗体的“抗原结合片段”可以通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促切割或化学切割产生。抗原结合片段尤其包括fab、fab’、f(ab’)2、fv、dab和互补决定区(cdr)片段、单链抗体(scfv)、单结构域抗体、嵌合抗体、双体抗体和这样的多肽，其至少含有免疫球蛋白足以赋予该多肽特异性抗原结合的部分。本文所述的抗原抗体片段实例包括但不限于：(i)具有vl、cl、vh和ch1结构域的fab片段；(ii)fab’片段，即在ch1结构域的c末端具有一个或多个半胱氨酸残基的fab片段；(iii)具有vh和ch1结构域的fd片段；(iv)具有vh和ch1结构域以及在ch1结构域的c-末端的一个或多个半胱氨酸残基的fd’片段；(v)具有抗体单臂的vl和vh结构域的fv片段；(vi)由vh结构域组成的dab片段(ward等，nature 341，544-546(1989))；(vii)分离的cdr区；(viii)f(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫键桥接的两个fab’片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如，单链fv；scfv)(bird等，science242：423-426(1988)；和huston等，pnas(usa)85：5879-5883(1988))；(x)具有两个抗原结合位点的“双抗体”，其包含与同一多肽链中的轻链可变区(vl)连接的重链可变区(vh)(参见，例如，ep404,097；wo93/11161；和hollinger等，pr℃.natl.acad.sci.usa，90：6444-6448(1993))；(xi)“线性抗体”，其包含一对串联fd区段(vh-ch1-vh-ch1)，所述fd区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(zapata等，protein eng.8(10)：1057-1062(1995)；和美国专利no.5,641,870)。

126、术语“重链”(“ch”)、“轻链”(“cl”)、“轻链可变区”(“vl”)、“重链可变区”(“vh”)、“框架区”(“fr”)是指天然存在的免疫球蛋白中的结构域和合成(例如重组)结合蛋白(例如人源化抗体)的相应结构域。天然存在的免疫球蛋白(例如igg)的基本结构单元是具有两条轻链和两条重链的四聚体。每条链的氨基末端(“n”)部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。羧基末端(每条链的“c”部分定义了一个恒定区，轻链具有单个恒定区，重链通常具有三个恒定区和一个铰链区。因此，天然存在的轻链结构igg分子为n'-vl-cl-c'，igg重链结构为n'-vh-ch1-h-ch2-ch3-c'(其中h为铰链区)。igg分子的可变区包含互补决定区(cdr)，其负责识别与接触抗原，非cdr片段，即框架区(fr)，框架区维持可变区结构并决定cdr环的位置。因此，vl和vh域具有结构n'-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4-c'。在本技术中，vh的3个cdr分别称为hcdr1、hcdr2、和hcdr3；vh的4个框架区分别称为hfr1、hfr2、hfr3、hfr4；vl的3个cdr分别称为lcdr1、lcdr2、和lcdr3；vl的4个框架区分别称为lfr1、lfr2、lfr3、lfr4。

127、在本技术中，所述cdr和fr根据immunogenetics(imgt)编号系统(参见,例如,lefranc m.p.the imgt unique numbering for immunoglobulins,t-cell receptors,and ig-like domains.the immunologist 7,132-136,1999(1999)))进行确定。

128、在本文中，术语“纳米抗体”，即仅由抗体重链的可变区组成的单域抗体。由于其相对分子尺寸为纳米级，故被称为纳米抗体。纳米抗体能像正常抗体一样与抗原紧密结合，但不像单链抗体那样容易相互粘连聚集成块。术语“单域抗体”是由一个可变区或一个仅协助靶标结合的工程化的恒定结构域组成的独立的抗原结合单元。术语“双体抗体”是scfv的二聚体，两个scfv片段通过vh和vl结构域的链间配对(交叉配对)共表达形成双体抗体。同样的，由多条scfv形成的多聚体称为多体抗体。例如，由三条scfv形成的三体抗体，由四条scfv形成的四体抗体等。其中，各scfv可以具有相同的抗原特异性，也可以具有不同的抗原特异性。

129、如本文所用，“单特异性抗体”、“双特异性抗体”和“多特异性抗体”分别指可以与一个、两个和多个不同抗原或同一抗原的一个、两个和多个不同抗原表位相结合的单个抗体分子。

130、如本文所用，术语“嵌合抗体”是指组合有来自不同物种的抗体片段的抗体。具体的，例如来自一个物种(例如小鼠)的一种单克隆抗体，其fc恒定区经由dna重组技术替换为来自一个物种(例如人)的fc恒定区。参见例如专利申请pct/us86/02269；ep/173,494。

131、如本文所用，术语“人源化抗体”是指包含人免疫球蛋白框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠、兔或合成)免疫球蛋白的一个或多个cdr的抗体。除cdr以外，人源化抗体中的所有其他部分与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。通过基因工程构建人源化抗体的方法参见例如专利申请us/5,585,089。

132、如本文所用，术语“全人源抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本技术的全人源抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“全人源抗体”不旨在包括其中源自另一哺乳动物物种(例如兔)的种系的cdr序列已移植到人框架序列上的抗体。因此，如本文所用，术语“全人源抗体”是指其蛋白质分子的几乎各个部分(例如，cdr、fr、cl、hc结构域(例如，ch1、ch2、ch3)、铰链、vl、vh)在人体中几乎无免疫原性，其相对于人天然免疫球蛋白只有很小的序列变化或变异。因此，全人源抗体不同于嵌合或人源化抗体。需要指出的是，全人源抗体可由能够表达功能重排的人免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞产生。

133、如本文所用，术语“fc片段”或“fc区域”用于定义免疫球蛋白重链的c-端区域。该fc区域是与fc受体和补体系统中的一些蛋白相互作用的抗体尾部区域。fc区域可为天然序列fc区域或变体fc区域。尽管免疫球蛋白重链的fc区域边界可以变化，人igg重链fc区域通常定义为从位置cys226或pro230的氨基酸残基伸展至其羧基末端。天然序列fc区域包含与自然界中发现的fc区域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。本领域普通技术人员所知晓的变体fc区域包含与天然序列fc区域的氨基酸序列相比区别在于存在至少一个“氨基酸修饰”的氨基酸序列。

134、在igg、iga和igd抗体同种型中，fc区域由两个相同的、源自抗体两条重链上第二和第三恒定结构域的蛋白片段组成；igm和ige的fc区域在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(ch结构域2-4)。igg的fc区域具有一个高度保守的n-糖基化位点。fc片段的糖基化对fc受体介导的活性来说是重要的。连接至这个位点上的n-聚糖主要为复合物类型的核心-果糖化的双触角结构。此外，少量的这些n-聚糖还带有等分的glcnac和α-2,6连接的唾液酸残基。参见如us20170349662、us20080286819、us20100278808、us20100189714、us2009004179、us20080206246、20110150867和wo2013095966，其每一个均通过引用并入本文。

135、“天然序列fc区域”包含与自然界中发现的fc区域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。本领域普通技术人员所知晓的“变体fc区域”或“fc变体”或“fc结构域变体”包含与天然序列fc区域的区别在于至少一个“氨基酸修饰”的氨基酸序列。优选地，变体fc区域与天然序列fc区域或亲本多肽fc区域相比具有至少一个氨基酸取代，例如，在天然序列fc区域或亲本多肽fc区域中的约一个至约十个氨基酸取代，且优选约一个至约六个、五个、四个、三个或两个氨基酸取代。本文中的变体fc区域优选与天然序列fc区域和/或亲本多肽fc区域具有至少约75％或80％的同源性，且更优选至少约90％的同源性，更优选至少约95％的同源性，甚至更优选至少约96％、97％、98％或99％的同源性。术语“天然”或“亲本”指包含fc氨基酸序列的未修饰多肽。亲本多肽可包含天然序列fc区域或具有早先存在的氨基酸序列修饰(如添加、缺失和/或取代)的fc区域。

136、如本文所用，术语“fc受体”或“fcr”用于描述与抗体fc区域结合的受体。fc受体是在有助于免疫系统保护功能的某些细胞表面发现的蛋白-包括b淋巴细胞、滤泡树突细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞以及其他细胞。其名字源于其对抗体fc区域(片段结晶区)的结合特异性。

137、fc受体介导多种抗体功能。例如，fc受体与附着于被感染的细胞或入侵病原体的抗体结合。其活性刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞以通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性破坏微生物或被感染的细胞。本领域还已知，抗体fc区域保证每个抗体均通过与特定种类的fc受体和其他免疫分子(如补体蛋白)的结合产生针对给定抗原的合适免疫应答。利用其对免疫球蛋白同种型的特异性定义fcr：fcγr指针对igg抗体的fc受体，fcεfr针对ige，fcαr针对iga等。针对免疫球蛋白g的表面受体存在两种不同的类型-通过其交联激活细胞的那些(“活化型fcr”)和通过共同参与抑制激活的那些(“抑制型fcr”)。

138、如本文所用，核酸指dna分子(例如，cdna或基因组dna)，rna分子(例如，mrna)，或dna或rna类似物。dna或rna类似物可合成自核苷酸类似物。核酸分子可为单链或双链，且优选为双链dna。“分离的核酸”指具有不同于任何自然发生的核酸或自然发生的基因组核酸的任何片段的结构的核酸。因此，该术语包括如(a)具有自然发生的基因组dna分子的部分序列的dna，但其不与在其自然发生的生物基因组内和该部分序列相邻的两个编码序列相邻；(b)引入载体或引入原核生物或真核生物的基因组dna的核酸，引入方式使所得分子不同于任何自然发生的载体或基因组dna；(c)分隔的分子，如cdna、基因组片段、通过聚合酶链式反应(pcr)生成的片段或限制性片段；和(d)作为杂合基因(即编码融合蛋白的基因)的部分的重组核苷酸序列。上述核酸可用于表达本发明的多肽、融合蛋白或抗体。为此，可将核酸有效连接到合适的调控序列以生成表达载体。

139、如本文所用，“构建体”是指通过其可以将多核苷酸序列(例如外来基因)引入宿主细胞中，以转化宿主并促进引入序列的表达(例如转录和翻译)的载体，包括质粒、噬菌粒、病毒载体等。

140、如本文所用，术语“噬菌粒”是丝状噬菌体衍生的载体，其基本成分主要包括质粒的复制起点、选择标记、基因间隔区(ig区)，通常还包含负链和正链的包装序列和复制起点、噬菌体外壳蛋白的基因、限制性内切酶识别位点、启动子和编码信号肽的dna片段。此外，噬菌粒还可以包含一个分子标签，以方便筛选基于噬菌粒的文库。噬菌粒无法独立完成子代噬菌体颗粒的组装，完成其生命周期所需的其他结构和功能蛋白质由辅助噬菌体提供。而辅助噬菌体是一种自身dna复制效率极低的丝状噬菌体突变型，因此辅助噬菌体与噬菌粒包装形成的噬菌体共同感染宿主菌时，可包装大量含有噬菌粒的噬菌体，而仅包装少量辅助噬菌体。

141、如本文所用，“质粒”是指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的dna分子，存在于细胞质或细胞核中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。

142、如本文所用，“病毒载体”是指以病毒为基础的基因载体，是一种经过基因工程改造的病毒基因组，其可携带外源基因和相关基因元件，并被包装成病毒颗粒，通过病毒侵染将其携带的外源基因导入细胞中。

143、“有效量”指给予治疗对象以治疗效果所需要的活性化合物/药剂的量。如本领域技术人员认识到的，有效剂量取决于下述因素而变化：所治疗病况的类型、施用途径、赋形剂使用和与其他治疗处理共同使用的可能性。

144、除非本文另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。