一种等温HIV核酸检测试剂盒及检测方法

一种等温hiv核酸检测试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种快速便捷的等温hiv核酸检测试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.人类免疫缺陷病毒(hiv)的检测是艾滋病防治规划的关键组成部分，作为逆转录病毒，当其侵入细胞时，会将自身的rna逆转录为dna，整合到宿主细胞基因组中。目前对hiv的检测主要分为核酸检测和血清学检测。血清学检测的目标物为抗原或抗体，常用方法包括酶联免疫吸附法(de la rica and stevens,2012)、免疫荧光法(pandori et al.,2013)和蛋白质印迹法(zhou et al.,2015b)，市面上现有的可供个人检测的试纸一般采用elisa法，检测的也是hiv抗体，但由于hiv抗体水平低，需要大约六周血液中才能检测到抗体。相比而言，hiv核酸检测将能将检测窗口期缩短至一周左右，因此病毒核酸检测对尽早防治疾病有重要意义。hiv核酸的常用检测方法为聚合酶链反应法(pcr，ding et al.,2010)，此法具有高灵敏度和特异性，可检测rna和dna，在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个pcr进程，最后通过比对标准曲线也可得到定量的结果。虽然pcr法作为核酸检测的常用方法较为成熟可靠，但是也有一些不足之处，如其对设备要求较高，需要热循环和复杂的引物设计，检测成本较高，时间也较长。因此，急需开发用于hiv感染早期诊断的简单、快速和灵敏的技术。
3.目前常用的核酸扩增技术有链置换扩增(sda)、杂交链式反应(hcr)、滚环扩增(rca)和dna纳米机器等，其中dna walker是dna纳米机器的一种，它能够通过动态相互作用在线性、二维及三维轨道上进行自主且高方向性运动，可以应用于检测信号定向传导及放大，在核酸检测方面有良好的应用前景。例如，李峰团队在金球上构建了3d-dna walker，当目标dna存在时，通过链置换反应释放walker，并利用核酸内切酶驱动，使walker沿着三维表面上的轨道分子高速行走并释放大量荧光标记的底物分子,从而快速检测血清样本中的结核杆菌dna片段(文章：acs nano 2016,10,2,2324
–
2330)。何治柯等设计了基于rca反应和dna walker的hiv核酸检测方法，让hiv靶标作为rca反应的引物，而rca的产物包含数百个重复序列，用于引发dna walker的行走，释放荧光信号(文章：nanoscale,2018,10,17206-17211)。易钢等设计了双层的dna walker用于hiv核酸检测，当目标物存在时，由熵驱动的dna分子杂交反应被激活，使外层walker行走，内层walker链释放，内层walker由酶驱动，通过酶促反应剪切轨道分子产生荧光信号(文章：biosensors and bioelectronics,volume 133,2019,243-249)。梁国熙等设计了一个简单的检测mirna的磁性dna walker，利用目标物触发walker切割底物链，磁分离后，大量底物链与纳米金一起孵育，在高盐溶液中未修饰的纳米金因大量单链dna存在而不聚集，因此目标物的浓度可以通过从灰黑色到紫色的颜色变化进行可视化(文章：sensors and actuators b:chemical,volume 337,2021,129813)。
4.现有的利用dna walker进行hiv核酸检测的方法其结果大多以荧光呈现，但观测
荧光信号需一定的设备，无法直观显示，在实验室外更是难以操作，荧光基团的成本也较高，很难做到当场快速反映检测结果。而基于纳米金的比色分析法虽简单且低成本，可以用于现场检测，但其灵敏度较低，限制了其在核酸检测中的临床应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对背景技术提出的技术问题提供一种快速便捷的等温hiv核酸检测试剂盒及检测方法。本发明的试剂盒检测过程无需复杂试剂和设备，可以尽量脱离实验室环境操作，并且将结果以可视化的方式呈现，直观快速地反映检测物的有无和大致的浓度范围，实现即时检测，便于实际应用。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
7.一种等温hiv核酸检测试剂盒，该试剂盒包括a管反应试剂和b管反应试剂；所述的a管反应试剂包括walker与protect链、track单链、链霉亲和素磁珠、含nacl的缓冲体系；所述的b管反应试剂包括金a、金b和mg
2+
缓冲体系，所述的金a和金b是分别在纳米金的表面修饰a、b两种序列的dna分子制成的。
8.所述的纳米金(直径约为13nm)是用柠檬酸钠还原法制备的，后分别在其表面修饰了a、b两种序列的dna分子，为区分故在此处命名为金a、金b，所涉及的纳米金的制备方法和修饰方法为本领域技术人员公知的常规方法。
9.作为一种优选技术方案，所述a管反应试剂的制备方法包括以下步骤：
10.(1)将walker与protect链杂交，形成部分互补的杂交双链；
11.(2)将链霉亲和素磁珠、步骤(1)制备的杂交双链、track单链共同分散在含nacl的缓冲体系中得到反应体系；
12.(3)将步骤(2)得到的反应体系在旋转混匀仪中反应12-18小时得到修饰上dna的磁珠；
13.(4)洗去上清，将修饰上dna的磁珠重新分散在含nacl的缓冲体系中，得到a管反应试剂；
14.所述的b管反应试剂的制备方法为：
15.取金a和金b分散至mg
2+
缓冲体系中，得到b管反应试剂。
16.进一步优选的，步骤(1)中所述的walker与protect链以摩尔比1：2在37℃下杂交；步骤(2)中所述杂交双链：track单链(摩尔比)＝1:8，所述的反应体系中杂交双链的浓度为0.5μm。
17.进一步优选的，步骤(3)中所述反应的条件为：以20rpm转速室温旋转反应。
18.进一步优选的，制备b管反应试剂时，将金a和金b分散至mg
2+
缓冲体系中，最终每种金的浓度为16-20nm。
19.作为一种优选技术方案，所述walker与protect链、track单链的核苷酸序列分别为：
[0020][0021]
所述a、b两种序列的dna分子分别为：
[0022] sequence(5
’‑3’
)a序列的dna分子tatgaagtgatggat-shb序列的dna分子tagtgcatttaacat-sh
[0023]
进一步优选的，所述的链霉亲和素磁珠为直径1μm的链霉亲和素磁珠；所述含nacl的缓冲体系为1
×
tae 0.1m nacl；所述的mg
2+
缓冲体系为1
×
tae12.5mm mg(ac)2缓冲体系。
[0024]
上等温hiv核酸检测试剂盒的检测方法，该检测方法包括以下步骤：
[0025]
(1)取待测样品的dna溶液加入a管反应试剂进行反应；
[0026]
(2)将反应液吸干上清，将磁珠重新分散于mg
2+
的缓冲体系中进行反应，所述的mg
2+
缓冲体系为1
×
tae 12.5mm mg(ac)2缓冲体系；
[0027]
(3)将反应液分离上清，取上清于b管反应试剂中进行反应，反应结束后通过对照b管纳米金的颜色反映结果，目标物浓度增加，b管颜色由橙红加深为深红甚至紫红色。对于比色法而言，肉眼可以区分的最低浓度为0.1nm，对检测范围分析，在0.1-500nm的区间内有线性关系，浓度在500nm以上时，b管的紫色更深，并且出现较为明显的沉降。
[0028]
进一步优选的，步骤(1)中的反应条件为：30-37℃反应1-2小时；步骤(2)中的反应条件为：30-37℃反应1-2小时；步骤(3)中的反应条件为：30℃反应1小时。更进一步优选的，步骤(1)中的反应条件为：32℃反应2小时；步骤(2)中的反应条件为：32℃反应2小时；步骤(3)中的反应条件为：30℃反应1小时。
[0029]
本发明试剂盒的工作原理：本方案设计了a、b管两个反应，a管反应利用dna walker实现等温扩增，b管反应利用扩增产物引发纳米金不同程度的团聚，从而实现hiv dna的快速可视化检测。具体是将少量作为walker的dna分子和大量dna轨道分子共同负载到直径1μm的磁珠上，其中dna walker包含了脱氧核酶(dnazyme)的识别序列，轨道链track包含了dnazyme的切割序列，在mg
2+
存在时，dnazyme可以发挥作用使底物链断裂，导致dna walker与轨道的结合变弱，结果是dna walker可以沿着三维表面上的轨道分子“行走”并切割及释放大量底物分子。在此基础上，将靶核酸分子的序列引入dna walker，并用一段与之部分互补的保护序列protect链杂交使dnazyme失活。当靶分子存在时，通过toehold介导的链置换反应移除保护序列，释放dna walker，dnazyme被激活切割底物使信号扩增。利用磁分离将上清液吸出，转移至b管，b管反应实现检测结果可视化呈现，利用的是纳米金的团聚，具体是在13nm的金球上修饰dna，利用上一步的扩增产物与金球上的dna碱基互补配对，使得原本分散分布的纳米金团聚，扩增产物的浓度不同将引发不同程度的团聚，呈现梯度变化的颜色，直接对应目标物浓度梯度(a、b管反应的原理图见图1)。
[0030]
本发明的技术方案主要有两个发明点：(1)首先，是在dna walker的设计中采用了金属离子驱动的dnazyme，dnazyme本身是一段核酸序列，可以直接在walker与track的序列
设计中包含，不需要额外添加，且相比于传统的蛋白酶，dnazyme不易受温度、ph等环境因素的影响，有更高的催化活性，更加稳定。(2)其次，是将dna walker组装在三维的磁珠上，一方面能够提高步行效率，另一方面在每一步反应后都能利用磁分离简单快速地分离磁珠与上清液(洗涤磁珠)，使得后续反应体系受前反应影响较小，使加入纳米金体系的产物更加纯净。
[0031]
本发明最优选技术方案的详细过程为：一种快速便捷的等温hiv核酸检测试剂盒，该试剂盒包括a管反应试剂和b管反应试剂，其中制备a管反应试剂和b管反应试剂的具体步骤如下：
[0032]
a管反应试剂的制备：
[0033]
(1)walker与protect链以摩尔比1：2在37℃下杂交，形成部分互补的双链结构。
[0034]
(2)将0.1mg直径1μm的链霉亲和素磁珠、步骤(1)中制备的杂交双链、track单链共同分散在50μl含0.1m nacl的缓冲体系中，其中杂交双链：track单链(摩尔比)＝1:8，体系中杂交双链浓度0.5μm。
[0035]
(3)将上述体系在旋转混匀仪上以20rpm转速室温旋转反应12-18。
[0036]
(4)洗去上清，将修饰上dna的磁珠重新分散在40μl含0.1m nacl的缓冲体系中，得到a管反应试剂。
[0037]
b管反应试剂的制备：取金a和金b(修饰了不同的dna，直径约13nm)分散至1
×
tae 12.5mm mg(ac)2缓冲体系中，最终每种金的浓度为约16-20nm，得到b管反应试剂。
[0038]
上述等温hiv核酸检测试剂盒检测流程为：
[0039]
(1)取10μl未知浓度的hiv dna溶液加入a管反应试剂，30-37℃反应1-2小时。
[0040]
(2)吸干上清，将磁珠重新分散于50μl，1
×
tae 12.5mm mg(ac)2的缓冲体系中，30-37℃反应1-2小时。
[0041]
(3)分离上清，取10μl上清于10μl的b管反应试剂中，30℃反应1小时，即可观察结果。
[0042]
本发明所述的室温为30
±
10℃。
[0043]
本发明的有益效果：
[0044]
采用本发明设计的试剂盒检测hiv，整个过程在30℃左右的低温环境进行，不需要复杂试剂和设备(检测需要的试剂只有纯水、0.1m nacl缓冲液和12.5mm mg
2+
缓冲液)，检测过程最长不超过5小时，操作简单，甚至可以在实验室外操作。比色法依赖修饰dna的纳米金团聚，原理是碱基互补，比依赖盐浓度变化使裸金团聚更稳定，同时能实现裸眼信号读出，无需检测荧光信号的设备和操作。
附图说明
[0045]
图1为a、b管反应的原理图。
[0046]
图2为比色法实验结果；其中，试管编号由小至大代表目标物浓度由小到大，颜色由纳米金的橙红色逐渐加深，浓度在1nm时逐渐成深红色，浓度增加至100nm时基本呈现紫红色，浓度再增大紫色加深，同时出现较为明显的沉降现象。
[0047]
图3为添加不同浓度目标物后的b管紫外吸收光谱图。
[0048]
图4为添加不同浓度目标物b管吸收值线性拟合图(r2＝0.9897)。
具体实施方式
[0049]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0050]
实施例1
[0051]
一种快速便捷的等温hiv核酸检测试剂盒，该试剂盒包括a管反应试剂和a管反应试剂，所述的a管反应试剂包括walker与protect链、track单链、链霉亲和素磁珠、1
×
tae 0.1m nacl缓冲体系；所述的b管反应试剂包括金a、金b和1
×
tae 12.5mm mg(ac)2缓冲体系。
[0052]
其中制备a管反应试剂和a管反应试剂的具体步骤如下：
[0053]
a管反应试剂制备：
[0054]
(1)walker与protect链以摩尔比1：2在37℃下杂交，形成部分互补的杂交双链结构。
[0055]
(2)将0.1mg直径1μm的链霉亲和素磁珠、步骤(1)中制备的杂交双链、track单链共同分散在50μl 1
×
tae 0.1m nacl的缓冲体系中，其中杂交双链：track单链(摩尔比)＝1:8，体系中杂交双链浓度0.5μm。
[0056]
所述walker与protect链、track单链的核苷酸序列分别为：
[0057][0058]
(3)将上述体系在旋转混匀仪上以20rpm转速室温旋转反应约12h。
[0059]
(4)洗去上清，将修饰上dna的磁珠重新分散在40μl的1
×
tae 0.1m nacl的缓冲体系中，得到a管反应试剂。
[0060]
b管反应试剂制备：金a和金b是分别在纳米金的表面修饰a、b两种序列的dna分子制成的。先用柠檬酸钠还原法制备直径约为13nm的纳米金，然后分别在其表面修饰a、b两种序列的dna分子，为区分故在此处命名为金a、金b，所涉及的纳米金的制备方法和修饰方法为本领域技术人员公知的常规方法(纳米金通过标准柠檬酸钠法制备和修饰nat protoc 1,246
–
252(2006).)。
[0061]
取金a和金b分散至1
×
tae 12.5mm mg(ac)2缓冲体系中，最终每种金的浓度为约20nm，得到b管反应试剂。
[0062]
所述a、b两种序列的dna分子分别为：
[0063][0064]
上述等温hiv核酸检测试剂盒检测流程为：
[0065]
(1)取10μl不同浓度的hiv dna溶液加入a管反应试剂，32℃反应2小时。
[0066]
(2)吸干上清，将磁珠重新分散于50μl，1
×
tae 12.5mm mg(ac)2的缓冲体系中，32℃反应2小时。
[0067]
(3)分离上清，取10μl上清于10μl的b管反应试剂中，30℃反应1小时，即可观察结果。
[0068]
表1反应体系目标物浓度与编号对照表
[0069][0070]
实验结果：紫外吸收值反映了随目标物浓度提升，吸收值曲线上移，团聚程度变高，对应金的颜色从橙红变为深红再变成紫色，最终会聚集沉降(如图2)；吸收值线性拟合图表明目标物浓度在0.1nm至500nm时，基本呈线性变化，500nm以上趋于平缓，因此按上述步骤制备的a管，b管可以检测0.1nm至500nm以上的目标dna片段(见图3和4)。肉眼可区分的最低浓度为0.1nm，浓度在500nm以上时，b管的紫色更深，并出现较为明显的沉降。