A型肉毒素轻链突变体的优化及其应用

本发明属于医药，公开了a型肉毒毒素轻链第49和50位氨基酸缺失和52位至54位氨基酸被替代的任一形式突变。具体地讲，是bont/a lc突变体49deletion、52ddd、52rrr、52srn。该轻链突变体在采用基因工程技术手段替换a型肉毒毒素野生型轻链部分后，可在以将全长肉毒毒素作为载体制备神经系统给药靶向递送药物，或在制备对a型肉毒毒素不响应的医美产品及相关药物，或在制备syntaxin介导的高分泌疾病药物以及在制备肌张力障碍相关疾病的药物中应用。

背景技术：

1、肉毒毒素(botulinum neurotoxins，bonts)由厌氧芽孢革兰氏阳性细菌肉毒梭菌和相关物种产生，是人类肉毒杆菌中毒的病原体，根据免疫抗原的不同，可分为a-g七种型别。而所有的肉毒素血清型都有相似的整体结构，其成熟加工形式为150kda的二硫键异二聚体，由50kda的轻链和100kda的重链组成。该异源二聚体包括3个主要功能域，重链c端域(hcc)，负责毒素与神经元受体特异性结合，形成毒素-受体复合物，通过胞吞作用进入细胞，后囊泡腔酸化，重链n端域(hcn)，在囊泡薄膜上形成一个蛋白质传导通道，将轻链转运到细胞质，在靶神经元的胞浆中，轻链(lc)域显示其锌金属蛋白酶活性，特异性水解snares(可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体)，而snare复合物是神经递质胞吞所必需的，所以肉毒素中毒会导致神经肌肉接点突触前神经递质释放的抑制，进而使得神经肌肉麻痹[1]。不同的血清型在蛋白水解靶点上存在差异，其中bont/b，bont/d，bont/f，bont/g切割vamp(也称为synaptobrevin)/vesicle-associated membrane protein isoforms 1，2，3；bont/a，bont/e切割snap25(25kda的突触体相关蛋白)；bont/c切割snap25和syntaxin1，2，3[2]。

2、bont/a毒性最强，作用时间最久，应用也最广，bont/a最初被批准用于眼睑痉挛、面肌痉挛和斜视的治疗，后应用范围逐步扩大，现在包括各种神经肌肉疾病、自主神经和其他非神经元疾病[3]。随着bont/a的临床应用越来越广，一些患者对这种血清型的毒素不响应或者在长期治疗后由于特异性免疫反应而产生耐药性，从而产生bont/a无效[4]。因此，本发明拟采用基因工程手段对a型肉毒毒素进行突变改造，使bont/a对除snap25以外的底物产生切割活性，从而克服上述bont/a存在的缺陷。由于这种突变改造仅改造轻链部分即可，在获得适宜轻链突变体后，可以方便地采用基因工程技术手段替换a型肉毒毒素野生型轻链部分获得全长突变体野生型毒素，这是同领域技术人员可以理解的。

3、此外，syntaxin在ca2+触发的神经元突触囊泡和内分泌细胞致密核心囊泡的胞吐中至关重要，syntaxin 1a的裂解显著减少了胞吐。除了胞吐外，syntaxin还有许多其他功能，包括调节k+通道，ca2+通道和k-atp通道，其中k-atp通道在ii型糖尿病治疗中非常重要，syntaxin的裂解会增加k-atp通道的活性，从而减少β细胞的激活，恢复正常的胰岛素分泌[5]。bont/c具有切割syntaxin的活性，将其轻链突变后，去除其snap25切割活性，可用于涉及syntaxin介导的高分泌疾病的治疗。最后，研究表明，bont/c经过突变仅保留对syntaxin的切割活性后，其优势在于失去对snap25的切割活性将不导致肌肉麻痹，但可有效减低神经传递，这提示毒素在这种情况下可以在制备调节肌肉的紧张度治疗卒中后痉挛、局部肌张力障碍的药物中应用[6]。毒素对snap25的切割活性决定了其引起肌肉麻痹的毒性，毒素突变体对snap25的切割活性下降，毒素的毒性随之下降[6]。

4、但是，由于bont/c进入其靶细胞的受体尚不清楚，这阻止了它在临床上的进一步应用。另一方面，由于bont/a已在临床上被广泛应用，因此，本发明拟采用基因工程手段对a型肉毒毒素进行突变改造，使bont/a具有可切割syntaxin的活性，最终令其有望用于在制备syntaxin介导的高分泌疾病药物中的应用以及在制备治疗卒中后痉挛、局部肌张力障碍的药物中应用。

5、肉毒素bonts能够以运动神经元为靶标，将其轻链运送到神经元中。因此它们可充当药物载体，将其运送到神经元中。但是，bonts要想成为一种传递工具，必须先“解毒”。如果简单删除毒素轻链lc通常会造成毒素溶解性下降，而通过突变关键氨基酸残基来消除轻链lc蛋白酶的活性[7]。

6、本发明利用定点突变的方法得到4种a型肉毒毒素突变体，并在细胞水平检测这4种突变体对底物snap25、syntaxin的切割活性，意外地，本发明获得了仅对syntaxin有活性，对snap25无活性a型肉毒毒素轻链突变体，对syntaxin和snap25均无活性的a型肉毒毒素轻链突变体和对syntaxin和snap25均有活性的突变体。本发明公开的a型肉毒毒素轻链突变体，可替换a型肉毒毒素轻链部分，在以将全长肉毒毒素作为载体制备神经系统给药靶向递送药物，或在制备对a型肉毒毒素不响应的医美产品及相关药物，或在制备syntaxin介导的高分泌疾病药物中应用以及在制备治疗卒中后痉挛和肌张力障碍相关疾病的药物中应用。

7、参考文献

8、[1]vazquez-cintron e j,beske p h,tenezaca l,et al.engineeringbotulinum neurotoxin c1 as a molecular vehicle for intra-neuronal drugdelivery[j].scientific reports,2017,7:42923.

9、[2]sikorra s,litschko c,müller c,et al.identification andcharacterization of botulinum neurotoxin a substrate binding pockets andtheir re-engineering for human snap-23[j].journal ofmolecularbiology,2016,428(2pta):372-84.

10、[3]胡平,陈平.a型肉毒毒素在前列腺疾病中的作用及机制研究进展[j].医学综述,2021,27(08):1556-61.

11、[4]eleopra r,tugnoli v,quatrale r,et al.clinical use of non-abotulinum toxins:botulinum toxin type c and botulinum toxin type f[j].neurotoxicity research,2006,9(2-3):127-31.

12、[5]wang d,zhang z,dong m,et al.syntaxin requirement for ca2+-triggeredexocytosis in neurons and endocrine cells demonstrated with an engineeredneurotoxin[j].biochemistry,2011,50(14):2711-3.

13、[6]zanetti g,sikorra s,rummel a,krez n,duregotti e,negro s,etal.botulinum neurotoxin c mutants reveal different effects of syntaxin orsnap-25proteolysison neuromuscular transmission[j].plos pathogens,2017,13(8):e1006567.

14、[7]miyashita s i,zhang j,zhang s,et al.delivery ofsingle-domainantibodies into neurons using a chimeric toxin-basedplatform is therapeuticin mouse models of botulism[j].science translational medicine,2021,(13)575.

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种a型肉毒毒素突变体及其在制备相关疾病药物中的应用。

2、本发明公开了a型肉毒毒素轻链(bont/alc)第49和50位氨基酸缺失和52位至54位氨基酸被替代的任一形式的突变体。具体地讲，本发明采用定点突变技术，以全合成野生型bont/alc(seq id no:10)载体为模板，pcr获得了4种a型肉毒毒素轻链(bont/alc)突变体，挑取克隆，提取质粒，外协委托金唯智公司进行测序，测序结果(seq id no:6,seq id no:7,seq id no:8,seq id no:9)与理论突变序列比对，验证一致后，将保存的菌种复苏，采用大提试剂盒提取无内毒素质粒，然后使用脂质体转染法，将质粒转染hek293t细胞，进行病毒包装，包装72h后，超速离心收集病毒，以病毒感染原代培养的海马神经元细胞，感染48h后，裂解细胞提蛋白，采用western blot检测本发明所获得的bont/alc突变体切割底物snap25、syntaxin的活性。

3、本发明涉及bont/alc突变体的优化改造及其应用。本发明以含野生型bont/alc的lenti载体为模板，采用定点突变的方式获得4种突变体，并对获得的bont/alc突变体进行细胞水平酶切活性检测分析实验，评价它们对底物snap25和syntaxin的切割活性，结果表明：bont/a lc突变体49deletion和52rrr对bont/a的底物snap25均无切割活性，bont/a lc突变体52ddd和52srn对snap25仍保留切割活性，但显著低于bont/alc野生型。此外，bont/alc突变体52rrr和52srn对c型肉毒毒素的底物syntaxin具有显著的切割活性。

4、本发明提供的bont/alc突变体49deletion对底物snap25和syntaxin均无切割活性，它可替换全长肉毒毒素的轻链部分，在以将全长肉毒毒素作为载体制备神经系统给药靶向递送药物中应用。本发明提供的bont/a lc突变体52rrr和52srn对syntaxin有切割活性，可在制备对a型肉毒毒素不响应的医美产品及相关药物中应用。本发明提供的bont/alc突变体52rrr仅对syntaxin具有切割活性，可在syntaxin介导的高分泌疾病的药物中应用以及在制备治疗卒中后痉挛和肌张力障碍相关疾病的药物中应用。

5、本发明的结果表明bont/alc轻链第49和50位缺失，第52至54位氨基酸替代可引起bont/a活性显著改变，这提示在所述位置的其他任一形式的氨基酸缺失或替换将带来与之相适应的临床应用。

6、下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下实施例。