含TPE-NIM荧光探针的引导组织再生膜及制备方法

含tpe-nim荧光探针的引导组织再生膜及制备方法
技术领域
1.本发明涉及一种含tpe-nim荧光探针的引导组织再生膜及制备方法，属于口腔生物医学材料技术领域。


背景技术：

2.牙周炎会导致牙周骨组织的进行性丧失，是造成成年人牙齿脱落的首位原因。由牙周炎所导致的牙齿缺失严重影响了患者的口腔咀嚼功能，增加患者患口腔疾病的风险，进而影响其生活质量。
3.针对牙周炎所造成的》3mm以上的骨缺损，临床上常使用翻瓣刮治术结合“屏障膜”进行治疗从而实现牙或种植体周围骨组织的再生。引导组织再生技术(guided tissue regeneration,gtr)，其原理是利用膜材料作为隔离屏障，放置在牙周组织缺损处以阻挡牙龈上皮，防止其在愈合过程中沿根面生长，阻挡纤维结缔组织与牙根表面接触，从而引导具有形成新附着能力的牙周膜细胞优先占领根面，从而形成新附着，并为骨组织再生提供生长空间，形成真正的牙周组织再生。其中引导组织再生膜起着至关重要的作用，也是该研究领域的热点和难点。
4.gtr膜材料根据在体内是否能够被降解又分为生物可吸收性和不可吸收性两大类。不可吸收膜虽然结构稳定可以为牙周组织再生提供适合的环境，但是膜材料需要二次手术取出，会对缺失区内已修复的软组织造成创伤并增加感染风险。
5.因此在临床治疗领域我们更多的选用生物可吸收膜，生物可吸收膜又分为天然可降解生物高分子材料和合成可降解生物高分子材料。天然可降解生物高分子材料中胶原膜在体内可自行降解、具有良好的生物相容性等特点，作为gtr膜已广泛应用于临床。如bio-gide胶原膜，但是其存在强度低，不易操作、价格昂贵等缺点，而且由于加工工艺特殊很难对其载入药物，术后有感染风险。另一种天然可降解生物高分子材料壳聚糖也常作为gtr膜材料，但同样存在某些不足，如成膜后质地较脆，柔韧性差，不能满足临床操作的要求。而合成可降解生物高分子材料如聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid，plga)制成的gtr膜具有低硬度，成型性能好，降解性好等优点，但是其成骨活性较低。因此将可降解生物高分子合成材料与具有生物活性的无机物联合使用，利用无机物的生物活性来提高可降解生物高分子合成材料的细胞粘附力、成骨活性，从而促进新骨形成，为解决以现有可降解生物高分子合成材料为原料的gtr膜的缺陷提供了新思路。目前常用的生物活性无机物有羟基磷灰石颗粒，磷酸三钙颗粒，生物活性玻璃颗粒。
6.另外，gtr术后感染是手术后并发症之一，易导致gtr手术失败。口腔感染多属于混合性感染，多种细菌在其生物膜形成和毒力等方面存在着协同作用。因此理想的抗菌药物治疗最好是在精准鉴别病原体种类的基础上进行，这样有助于对致病菌进行针对性的防治，以便在较短的时间内控制感染，降低感染的严重程度，提高gtr手术的成功率。
7.临床认为治疗感染确切有效的方法是明确致病菌种类，彻底清除感染病灶，并且局部给予抗生素持续治疗。局部使用抗生素，虽然对全身副作用低，但药物作用时间短，而
如果长期用药又易产生耐药性。因此，研究具有细菌示踪性、长效抗菌性的gtr膜用来在治疗牙周组织缺损的同时能够鉴别病原体种类、缓释抗菌成分，而不产生耐药性，从而达到对抗菌过程实时监控、有效防治术后感染的目的，已经成为一种趋势。
8.aie(aggregation-induced emission)聚集诱导发光材料是一种具有高光稳定性和低细胞毒性的生物探针，由于分子内运动的限制，aie材料在溶液状态下通常没有荧光或弱荧光，但在聚集状态下却可以发出强烈荧光。这些优点使它在细胞和病原体的成像中有多种应用。而其他常规的荧光探针，如若丹明、荧光素、bodipy和花青等，由于存在聚集引起荧光猝灭、并且在长期成像过程中会遭受光致漂白等缺点，极大限制了它们的实际临床应用。而无机纳米粒子，例如量子点，虽然具有较高的亮度和光稳定性，但是其重金属含量引起的潜在毒性也影响了它的临床应用。


技术实现要素：

9.针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种含tpe-nim荧光探针的引导组织再生膜及制备方法。
10.为了实现上述目的，本发明采用的tpe-nim荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)tpe-br的合成：将2.3-2.8g 4-溴-苯基苯甲酮、1.5-2.0g二苯甲酮溶解在四氢呋喃中，加入锌粉，搅拌反应，后加入四氯化钛溶液，0-25℃条件下反应10-14小时，将混合物缓慢倒入冰水中，搅拌淬灭，加乙酸乙酯，萃取，过滤，浓缩，柱层析纯化粗产物，真空干燥，得到浅橙色固体tpe-br；
12.(2)tpe-b(oh)2的合成：取3.5-4.5g tpe-br溶解在干燥无水的四氢呋喃中，缓慢滴加6-10ml 1.0mol/l的正丁基锂溶液，搅拌反应半小时，滴加4.5-5.5ml硼酸三甲酯，反应2.5-3.5小时后，缓慢升温，再将混合物缓慢倒入碳酸氢钠溶液中，搅拌淬灭，用甲苯萃取，有机相干燥，过滤，减压浓缩，柱层析纯化粗产物，真空下干燥过夜，得到浅橙色固体tpe-b(oh)2；
13.(3)4-溴-n-(二甲氨基丙基)-1,8-萘酰亚胺的合成：向0.8-1.2g 4-溴-1,8-萘酸酐中加入25-35ml无水乙醇并加热至75-85℃，在沸腾悬浮液条件下，滴入0.3-0.5g 3-二甲氨基丙胺并回流反应1.5-2.5小时，冷却后在室温下搅拌一段时间，形成厚沉淀物，收集固体，在55-65℃下真空干燥过夜，得到呈浅棕色固体的化合物dap-nim；
14.(4)tpe-nim的合成：先将0.15-0.25g dap-nim、0.15-0.2g 4-(二苯氨基)苯硼酸、0.01-0.02g四三苯基膦钯和0.15-0.2g的碳酸钠放入烧瓶中，再将12-16ml甲苯、3-5ml无水乙醇和1.5-2.5ml去离子水分别注入烧瓶，然后在85-95℃氮气下回流12小时，完成反应后，将混合物冷却至室温并用二氯甲烷萃取，有机相干燥，过滤，并在减压下浓缩，柱层析纯化粗产物，真空下干燥过夜，得到浅橙色固体tpe-nim。
15.另外，本发明还提供了tpe-nim荧光探针，所述tpe-nim荧光探针是由上述制备方法制得的基于萘二甲酰亚胺的aie荧光探针。
16.另外，本发明还提供了引导组织再生膜，所述引导组织再生膜为薄片状可降解复合材料，按质量百分比计，包括4％的tpe-nim、10-30％的45s5生物活性玻璃粉及66-86％的聚乳酸-乙醇酸共聚物；
17.所述tpe-nim、45s5生物活性玻璃粉以聚乳酸-乙醇酸共聚物为载体成膜。
18.作为改进，所述45s5生物活性玻璃粉为纳米颗粒，直径为80-120μm。
19.作为改进，所述纳米颗粒的制备方法是通过将45s5生物活性玻璃加热直到熔融，将直径为80-150μm且孔径为3μm-4μm的介孔二氧化硅纳米颗粒，浸入到熔融的生物活性玻璃中，使熔融的生物活性玻璃覆盖在二氧化硅纳米颗粒表面；所述45s5生物活性玻璃与二氧化硅的质量比为2:1。
20.作为改进，按质量百分比计，所述45s5生物活性玻璃粉包括45％sio2、24.5％na2o、24.5％cao和6％p2o5。
21.作为改进，所述聚乳酸-乙醇酸共聚物中la与ga的质量比为75:25。
22.作为改进，所述聚乳酸-乙醇酸共聚物的相对分子量m＝7000-17000。
23.进一步的，本发明还提供了所述引导组织再生膜的制备方法，包括以下步骤：通过超声将plga粉末状固体溶解在四氢呋喃中，再分别加入45s5bgs和tpe-nim，超声分散，在氮气流下将四氢呋喃蒸发得悬浊液，取悬浊液倒入底面积为10cm2聚四氟乙烯模具中，室温下，静置通风24h后即可得到复合膜。
24.最后，本发明还提供了一种所述引导组织再生膜在口腔生物医学材料中的应用。
25.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
26.1)本发明合成了具有aie特征的免洗生物荧光探针tpe-nim，它是一种基于萘二甲酰亚胺的aie荧光探针，以萘二甲酰亚胺核作为吸电子基团，它进一步用具有生物活性的叔胺修饰tpe以产生给电子结构，从而增加了π-π键的共价效应，继而使tpe-nim具有了aie荧光聚集发光特性。叔胺的碱性基团与g+细菌细胞壁中存在的脂磷壁酸和糖醛酸磷壁酸通过静电相互作用，并在病原体的选择性染色中起关键作用。tpe-nim可以通过免洗且快速(15分钟)的染色程序，选择性地对g+菌进行染色。与其他常规荧光探针相比具有高光稳定性和低细胞毒性，且克服了其他常规荧光探针的缺点。
27.2)本发明合成一种具有缓释抗菌成分且不产生耐药性，同时又具有细菌示踪性的gtr膜，用于引导组织再生技术(gtr)中，利用膜材料作为隔离屏障，放置在牙周组织缺损处以阻挡牙龈上皮，防止其在愈合过程中沿根面生长，阻挡纤维结缔组织与牙根表面接触，从而引导具有形成新附着能力的牙周膜细胞优先占领根面，从而形成新附着，并为骨组织再生提供生长空间。
28.3)本发明选用plga作为gtr膜基质材料，将45s5生物活性玻璃颗粒及tpe-nim荧光探针添加进所合成的可降解生物高分子合成材料plga中复合成膜，在本发明所述gtr膜的降解过程中可以缓慢释放45s5bgs生物活性玻璃颗粒，利用其显著的抗菌作用，抑制和杀灭引起牙周疾病的多种厌氧菌、非厌氧菌，有效防控术后感染，同时释放tpe-nim荧光探针，并通过免洗且快速(15min)的染色程序，快速鉴别病原体，选择性的对g+菌进行染色，从而实现对革兰氏菌进行区分，对所合成的gtr膜的抗菌效果进行实时监控，达到更好的预防和控制gtr术后感染的目的。
29.4)本发明采用的聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid,plga)是乳酸和乙醇酸的共聚物，具有不同的分子量和分子比例，plga作为pla和pga的二元共聚物，可明显改进pla和pga的不足，降解速度比其任一单体更快，更适合应用于人体。
30.5)本发明采用的45s5生物活性玻璃颗粒具有生物活性，它由无机氧化物单体组成，含有24.5％cao、24.5％na2o、6％p2o5、45％sio2，在体液环境中可以缓慢释放钙磷离子，
这些离子沉淀形成无定型磷酸钙层，继而在表面结晶形成(ca5[po4]3oh)(hca)层。由于其微/纳米级复杂性，hca层支持粘附蛋白的吸附，这将进一步将整联蛋白锚定在成骨细胞中，从而促使成骨细胞附着，扩散并产生矿化的骨基质，最终生物活性材料缓慢溶解直至完全被新骨替代。因此在可降解生物高分子合成材料plga共聚物中加入45s5生物活性玻璃颗粒制成复合物，可以有效提高高分子合成材料的成骨活性，同时刺激干细胞的分化。
[0031]
此外，45s5生物活性玻璃的抗菌作用显著，对多种厌氧菌、非厌氧菌及其他口腔临床常见游离微生物及菌斑有一定抑制和杀灭作用，且未发现耐药菌株，可作为潜在的抗菌剂用于治疗细菌相关的口腔疾病。在透射电子显微镜下观察到45s5生物活性玻璃表面和靠近细胞的区域有大量针状碎片，能够刺破细菌的细胞壁，使细菌失去完整的结构。另外，45s5生物活性玻璃在液体环境中释放na
+
、ca
2+
、po
43-等离子，与周围的h
+
或h3o
+
发生交换，导致溶液ph值增加。其产生的碱性环境可以减少体内细菌在表面的定植并对细菌造成一定的压力，从而使细菌改变自身的形态以适应环境的变化，细胞质膜完整性破坏，蛋白质表达模式改变，蛋白质变性，dna受损，细胞代谢必不可少的酶的活性也发生了变化。而45s5生物活性玻璃释放出na+、ca
2+
、si
4+
等还可以提高环境的渗透压，作用于细菌使细胞内容物流出，导致细菌死亡，且45s5bgs释放出的高浓度的ca
2+
可能会引起细菌膜电位的扰动或攻击细胞膜上的某些靶点，使细胞内容物流出，抑制细菌各种生理活动，这也是45s5bgs的抗菌机制之一。
[0032]
6)本发明制备的引导组织再生膜抗菌疗效持久，无细胞毒性，生物相容性好，生物活性佳，可以促进新骨形成，另外对病原菌荧光成像稳定，避免了传统抗生素治疗牙周炎带来的耐药性和短效性。通过本发明的实施，有望拓展生物活性玻璃材料和tpe-nim荧光示踪材料在慢性牙周炎治疗的新途径，改善抗生素治疗牙周病的传统理念，避免耐药性的产生，达到对病原菌有效示踪、长效抗菌、促进牙周病损组织再生的目的，同时能有效降低牙周病患者医疗费用。
附图说明
[0033]
图1为实施例1制得的tpe-nim荧光探针的核磁共振氢谱图；
[0034]
图2为实施例3制得的引导组织再生膜在场发射扫描电镜(fesem)下表面微观形貌图；
[0035]
图3为实施例3制得的引导组织再生膜的表面元素成分测定；
[0036]
图4为实施例3制得的引导组织再生膜的cck-8细胞毒性实验；
[0037]
图5为实施例3制得的引导组织再生膜降解后表面元素eds能谱分析；
[0038]
图6为实施例3制得的引导组织再生膜与细菌共培养后细菌live/dead染色后的正置荧光显微图像；(a)空白组：未经处理的s.m菌液，(b)引导骨组织再生膜组：经膜处理的s.m菌液；
[0039]
图7为实施例3制得的引导组织再生膜浸提液对于细菌染色的激光共聚焦图像。
具体实施方式
[0040]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发
明的范围。
[0041]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0042]
实施例1
[0043]
一种tpe-nim荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0044]
1)tpe-br的合成：2.5g 4-溴-苯基苯甲酮、1.8g二苯甲酮溶解在四氢呋喃中，加入1.6g锌粉，搅拌反应，后加入20ml四氯化钛溶液，25℃条件下反应12小时，将混合物缓慢倒入冰水中，搅拌淬灭，加50ml乙酸乙酯，分两次萃取，过滤，浓缩；以乙酸乙酯和石油醚的1:5混合物为洗脱液，通过柱层析纯化粗产物，真空干燥，得到浅橙色固体tpe-br；
[0045]
2)tpe-b(oh)2的合成：4.0g tpe-br溶解在干燥无水的四氢呋喃中，缓慢滴加8ml1.0mol/l的正丁基锂溶液，搅拌反应约半小时，滴加5.0ml硼酸三甲酯，反应3小时后，缓慢升温，再将混合物缓慢倒入碳酸氢钠溶液中，搅拌淬灭，用甲苯萃取，有机相干燥，过滤，减压浓缩；以二氯甲烷和甲醇的混合物为洗脱液，通过柱层析纯化粗产物，将所得产物在真空下干燥过夜，得到浅橙色固体tpe-b(oh)2；
[0046]
3)4-溴-n-(二甲氨基丙基)-1,8-萘酰亚胺(dap-nim)的合成：向1.0g 4-溴-1,8-萘酸酐中加入30.0ml无水乙醇并加热至80℃，在沸腾悬浮液条件下中滴入0.4g 3-二甲氨基丙胺并回流反应2小时，冷却后在室温下搅拌一段时间，形成厚沉淀物，收集固体，然后在60℃下真空干燥过夜，得到呈浅棕色固体的化合物dap-nim；
[0047]
4)tpe-nim的合成：0.2g dap-nim，0.176g 4-(二苯氨基)苯硼酸(tpe-b(oh))2，0.016g(0.014mmol)四三苯基膦钯(pd(pph3)4)和0.176g(1.66mmol)的碳酸钠被放入烧瓶中，将14.0ml甲苯、4.0ml无水乙醇和2.0ml去离子水分别注入烧瓶，然后在90℃氮气下回流12小时，完成反应后，将混合物冷却至室温并用二氯甲烷萃取，有机相干燥，过滤，并在减压下浓缩；以乙酸乙酯和甲醇的1:1混合物为洗脱液，通过柱层析纯化粗产物，将所得产物在真空下干燥过夜，得到浅橙色固体tpe-nim(产率：88％)。
[0048]
上述合成的tpe-nim最终产物于室温下溶解在dmso中，通过碳核磁共振(nmr，bruker 400m)氢谱进行表征，结果见附图1。
[0049]
与传统荧光探针材料相比，本发明的tpe-nim荧光探针具有以下优点：
[0050]
(1)聚集诱导发光特性：常规的荧光探针，如若丹明，荧光素，bodipy和花青，由于存在聚集引起的猝灭作用，并且在长期成像过程中会遭受光致漂白，这极大地限制了它们的实际临床应用，而tpe-nim由于分子内运动的限制，在溶液状态下通常没有荧光或弱荧光，但在聚集状态下却强烈荧光，且荧光强度稳定。
[0051]
(2)免洗特性：大多数基于荧光的病原体成像方法都需要清洗步骤以去除未结合的染料，以减少背景噪声，从而经常导致病原体损失，这一方面降低了实验的准确性，另一方面导致额外的实验步骤。本发明所述tpe-nim具有免洗生物医学成像特性可以通过免洗且快速(15分钟)的染色程序，选择性地对革兰氏阳性细菌进行染色，达到有效区分病原体的目的。
[0052]
(3)细胞毒性低：某些用于荧光成像的无机纳米粒子，例如量子点，通常具有较高的亮度并且是光稳定的，但是当用于生物医学目的时，由于其含有一定量的重金属，因此具
有潜在毒性始。本发明所述tpe-nim细胞毒性小，对细胞增殖无显著影响。
[0053]
实施例2
[0054]
45s5生物活性玻璃粉的制备方法，包括以下步骤：
[0055]
将2g 45s5生物活性玻璃加热直到熔融，将1g直径为80-150μm且孔径为3μm-4μm的介孔二氧化硅纳米颗粒，浸入到熔融的生物活性玻璃中，使熔融的生物活性玻璃覆盖在二氧化硅纳米颗粒表面，得到纳米颗粒的45s5生物活性玻璃粉，直径为80-120μm；
[0056]
所得45s5生物活性玻璃粉包括45％sio2、24.5％na2o、24.5％cao和6％p2o5。
[0057]
本发明的生物活性玻璃(45s5 bgs)粉体，具有以下优点：
[0058]
(1)粒径小，比表面积大，本发明所用的bgs，是由熔融法制成的45s5bgs粉体，白色无味，粒径为80-120μm，其遇水迅速形成碱性环境，处于口腔环境时ph值大于8，有利于钙磷沉积。
[0059]
(2)抗菌效果显著，在透射电子显微镜下可见，45s5bgs表面和靠近细胞的区域有大量针状碎片，能够刺破细菌的细胞壁，使细菌失去完整的结构，且45s5bgs的部分碎片可以进入胞体内与细胞内物质发生反应，使细胞质出现凝集现象；另外bgs在液体环境中释放na
+
、ca
2+
等离子，与周围的h
+
或h3o
+
发生交换，使局部ph值增加。碱性环境可以减少体内细菌在表面的定植并对细菌造成一定的压力，从而使细菌改变自身的形态以适应环境的变化。当ph值增加时，细胞膜中的磷脂或不饱和脂肪酸受损，破坏了细胞膜的完整性以及蛋白质的三维结构，膜蛋白变性使膜ph梯度发生变化，细胞内外的酶丧失生物活性，细胞代谢减弱；碱性溶液中的氢氧根离子能与细菌dna发生反应，使基因丢失，抑制dna复制，引起基因致死性突变；45s5bgs释放出na
+
、ca
2+
、si
4+
等可以提高环境的渗透压，作用于细菌使细胞内容物流出，也会导致细菌死亡；并且45s5bgs释放出的高浓度的ca
2+
可能会引起细菌膜电位的扰动或攻击细胞膜上的某些靶点，使细胞内容物流出，抑制细菌各种生理活动，这也是45s5bgs的抗菌机制之一。目前已证实45s5bgs对多种厌氧菌、非厌氧菌及其他口腔临床常见游离微生物及菌斑有一定抑制和杀灭作用，且未发现耐药菌株。
[0060]
(3)具有成骨活性：45s5bgs由无机氧化物单体组成，在体液环境中可以缓慢释放钙磷离子，这些离子沉淀形成无定型磷酸钙层，继而在表面结晶形成(ca5[po4]3oh)(hca)层。由于其微/纳米级复杂性，hca层支持粘附蛋白的吸附，这进一步将整联蛋白锚定在成骨细胞中，从而促使成骨细胞附着，扩散并产生矿化的骨基质，促进新骨形成。在45s5bgs表面生长的成骨细胞与惰性塑料材料表面的细胞相比，呈更紧密堆积状，具有更多丝状和纤维状突起的结合处，细胞具有更多的皱褶和微溶毛，这些都是活性细胞的标志。45s5bgs产生的弱碱性环境同样可以激活成骨相关基因的表达上调。
[0061]
实施例3
[0062]
一种引导组织再生膜的制备方法，包括以下步骤：
[0063]
通过超声将76mg plga(la与ga质量比为75:25，相对分子量m＝7000-17000)粉末状固体溶解至1ml四氢呋喃中，再分别加入20mg实施例2制得45s5bgs和4mg实施例1制得tpe-nim，超声分散，在氮气流下将四氢呋喃蒸发约0.5ml，取剩下的悬浊液倒入底面积为10cm2聚四氟乙烯模具中，室温下，静置通风24h后即可得到所述45s5生物活性玻璃-tpe-nim荧光探针-聚乳酸乙醇酸共聚物引导组织再生膜，常温避光干燥保存。
[0064]
用场发射扫描电镜及eds能谱仪对实施例3制得引导组织再生膜的表面形貌和元
素成分进行了研究和分析，结果如图2、图3所示，分析可知：电镜观察到引导组织再生膜表面散在分布45s5生物活性玻璃晶体，eds分析发现引导组织再生膜表面出现了钠、钙、磷、硅四种元素的局部聚集，与生物活性玻璃组成相符；
[0065]
另外，取本发明制得的引导组织再生膜进行了再矿化实验(表面再矿化物元素成分测定)。
[0066]
取本发明制得的10wt％bg和4wt％的plga/bg/tpe-nim引导组织再生膜在模拟体液(1
×
sbf)中浸泡3d后，用2.5％戊二醛(solarbio，beijing，china)固定，4℃保存过夜，1
×
pbs漂洗，乙醇梯度脱水，干燥，镀金。用场发射扫描电镜及eds能谱分析对其表面形貌及表面元素成分进行了定性分析研究，如图5所示。结果发现膜表面形成了与骨组织成分相似的类磷灰石再矿化物，类磷灰石层可以支持粘附蛋白的吸附，这将进一步将整联蛋白锚定在成骨细胞中，从而促使成骨细胞附着，扩散并产生矿化的骨基质，促进新骨形成。
[0067]
另外取本发明制得的10wt％bg和4wt％的plga/bg/tpe-nim引导组织再生膜进行了cck-8细胞毒性实验。设置5组：
[0068]
(i)无细胞(空白对照)；
[0069]
(ii)含6.3％苯酚的细胞(阳性对照)；
[0070]
(iii)单纯细胞(阴性对照)；
[0071]
(iv)plga/bg片(plga/bg组)；
[0072]
(v)plga/bg/tpe-nim片(plga/bg/tpe-nim组)；
[0073]
结果发现阴性对照组与空白对照组相比有显着差异(p《0.05)。阴性对照组、plga/bg组、plga/bg/tpe-nim组之间无显著性差异(p》0.05)。证实所合成的plga/bg/tpe-nim引导组织再生膜无显著细胞毒性。具体如图4。
[0074]
另外，取本发明制得的引导组织再生膜进行抗菌性能测试，分别设置4组：
[0075]
(i)blank control：不加膜；
[0076]
(ii)negative control：加plga膜；
[0077]
(iii)plga/bg组：加plga/bg膜；
[0078]
(iv)plga/bg/tpe-nim组：加plga/bg/tpe-nim膜。
[0079]
实验结果发现plga/bg组和plga/bg/tpe-nim组与阴性对照组相比表现出显著抗菌性能(p《0.01)，plga/bg组和plga/bg/tpe-nim组的杀菌性能有差异(p《0.01)；plga/bg膜的杀菌率为98.62％，plga/bg/tpe-nim膜的杀菌率为99.99％。live/dead细菌染色后，用正置荧光显微镜观察(图6)显示，经过膜处理的细菌溶液中发出绿色荧光的活细菌数量(图6b)与未经膜处理的细菌(图6a)相比大大减少。
[0080]
另外取本发明制得的引导组织再生膜进行病原菌荧光示踪实验，取plga/bg/tpe-nim引导组织再生膜，以1cm2/ml的比例浸出膜24小时，取提取液，用细菌过滤器过滤bg。以变形链球菌(s.mutans，g+)和牙龈卟啉单胞菌(p.gingivalis，g-)为研究对象，研究所设计的tpe-nim对牙周病常见致病菌的联合作用。将变形链球菌和牙龈卟啉单胞菌与提取物在37℃孵育15分钟，用共聚焦显微镜观察引导组织再生膜降解出的tpe-nim对两种细菌的染色性能，见图7。结果发现在不同视野下，提取物处理的杆状牙龈卟啉单胞菌无蓝色荧光信号，而链球菌状变形链球菌细胞膜上可见蓝色荧光信号，说明tpe-nim对变形链球菌(g+细菌)有染色作用，对牙龈卟啉单胞菌无染色作用，这是首次将聚集诱导发射物质tpe-nim作
为生物探针加入到gtr膜中，对临床诊断具有重要的辅助意义。该过程简单且微创。gtr手术后，手术区的体液可随时抽取，无需任何洗脱或处理。
[0081]
本发明制得的引导组织再生膜具有广泛的临床应用前景，其良好的生物相容性、强大的抗菌性能，可以有效预防gtr后感染，且无抗生素抵抗作用，另外本发明首次将聚集诱导发射物质tpe-nim作为荧光探针加入到gtr膜中，对临床诊断具有重要的辅助意义。该过程简单且微创。gtr手术后，手术区的体液可随时抽取，无需任何洗脱或处理，可在荧光显微镜下直接观察，快速诊断是否感染，并辨别感染致病菌的种类，以便医生及时防控潜在感染，并对已经发生的感染进行快速、微创、便捷的临床诊断。本发明的引导组织再生膜再矿化实验中，薄膜中的45s5bgs经过短时间浸泡后发生降解，膜表面出现磷灰石状结构，可以促进体液中生物活性分子通过吸附、聚集和化学键结合，有利于手术区域的新骨形成。
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以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。