一种新型冠状病毒荧光PCR检测试剂盒及其使用方法与流程

一种新型冠状病毒荧光pcr检测试剂盒及其使用方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒荧光pcr检测试剂盒及其使用方法。


背景技术：

2.新冠肺炎(covid-19)是由新型冠状病毒sars-cov-2感染所致的肺部炎症，可引起人类呼吸道感染，人群普遍易感。冠状病毒是在动物和人体中发现的一个大型病毒家族，最早由鸡胚中分离出来。在此之前，已知可感染人类的冠状病毒共有6种，其中低危型hcov-229e、hcov-0c43、hcov-nl63和hcov-hku1这4种只会引起普通的感冒症状，而高危型sars-cov和mers-cov则会引起全球恐慌的呼吸道疾病。新型冠状病毒sars-cov-2是冠状病毒β属的新成员，属于单链rna病毒，经过测序，其基因组序列全长约为30kb，拥有10个基因，可有效编码10个蛋白。
3.新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版修订版)中明确将核酸检测阳性为确诊的首要标准。临床病例或疑似病例具备实时荧光rt-pcr新冠病毒核酸阳性或病毒基因测序与已知的新冠病毒高度同源，即为确诊病例。然而病毒测序对实验室技术、人员、设备等要求较高，及时准确地鉴定出sars-cov-2，是新冠肺炎得以合理临床治疗和疫情科学防控的前提基础，通过实时荧光pcr检测新型冠状病毒核酸，窗口期短，检测灵敏度高，特异性好，因此实时荧光定量pcr是目前新冠肺炎确诊中使用最广泛的方法。
4.目前，市面上用于新冠病毒的荧光pcr检测试剂盒的灵敏度和准确性仍然较低，试剂盒的其他成分、反应体系以及样本的加入量都会影响检测分析敏感性、特异性以及检测重现性。因此，开发一种新型冠状病毒检测试剂盒以及使用方法用于解决上述问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种特异性好、灵敏度高、重现性好、能够有效避免产生假阴性结果的新冠病毒荧光pcr检测方法及试剂盒。
6.本发明的技术方案是这样实现的：本发明还提供了一种新型冠状病毒荧光pcr检测试剂盒，包括检测新冠病毒orflab基因的引物和探针，检测新冠病毒n基因的引物和探针；检测内标病毒rnase p基因的引物和探针；所述检测orflab基因、n基因和rnase p基因的探针均为锁核酸修饰的探针，5'端均标记荧光基团，3'端均标记猝灭基团。
7.在以上技术方案的基础上，优选的，所述检测新冠病毒orflab基因的引物和探针包括seq id no:1所示的正向引物，seq id no:2所示的反向引物，seq id no:3所示的探针；所述检测新冠病毒n基因的引物和探针包括seq id no:4所示的正向引物，seq id no:5所示的反向引物，seq id no:6所示的探针；检测内标病毒rnase p基因的引物和探针包括seq id no:7所示的正向引物，seq id no:8所示的反向引物，seq id no:9所示的探针。
8.在以上技术方案的基础上，优选的，所述检测orflab基因和n基因的引物在pcr反应体系中的终浓度均为0.2-0.3μmol/l，探针在pcr反应体系中的终浓度均为0.05-0.1μ
mol/l；所述检测rnase p基因的引物在pcr反应体系中的终浓度为0.05-0.1μmol/l，探针在pcr反应体系中的终浓度为0.02-0.05μmol/l。
9.在以上技术方案的基础上，优选的，所述检测orflab基因、n基因和rnase p基因的探针的1个或多个位置的碱基被锁核酸修饰。
10.在以上技术方案的基础上，优选的，所述检测orflab基因、n基因和rnase p基因的探针的5'端起第13位、第15位、第18位、第20位和第21位中的1个或多个碱基被锁核酸修饰。
11.在以上技术方案的基础上，优选的，还包括taq dna聚合酶、ung酶、dntps、tris-hcl和mgso4。
12.在以上技术方案的基础上，优选的，所述taq dna聚合酶的终浓度为6-10u，ung酶的终浓度为1-3u、dntps的终浓度为0.65-0.15mmol/l，tris-hcl的浓度为50-55mmol/l，mgso4的终浓度为2-8mmol/l，甘油的质量分数为1-5％，明胶的质量分数为0.01-0.05％。
13.在以上技术方案的基础上，优选的，所述荧光基团为fam、vic、rox、cy3和cy5中的一种或多种，所述猝灭基团为eclipse、bhq1和dabcyl中的一种或多种。
14.本发明还提供了一种新型冠状病毒荧光pcr检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
15.s1，取含有新型冠状病毒基因组的假病毒颗粒用阴性血清稀释，然后提取模板dna；
16.s2，pcr扩增，步骤为：55℃逆转录15min；95℃预变性30s；95℃变性10s，60℃退火、延伸45s，收集荧光信号，变性、退火和延伸共45个循环；
17.s3，荧光检测，以荧光pcr仪上的检测通道扩增模板的荧光信号强弱和循环阈值来判定结果。
18.本发明的一种新型冠状病毒荧光pcr检测试剂盒及其使用方法相对于现有技术具有以下有益效果：
19.(1)本发明提供了新型冠状病毒sars-cov-2荧光pcr检测的引物、探针、试剂盒和检测方法，能够准确且灵敏地检测出新冠病毒sars-cov-2，特异性强，重复性好，适用于临床快速检测诊断。
20.(2)本发明利用锁核酸修饰的探针以及ung酶、甘油和明胶，可以改善dna变性复性情况、去除非特异扩增，提高反应效率和特异性。
21.(3)本发明的试剂盒检测限为200copies/ml，重现性好、能够有效避免产生假阴性结果，且与结核分枝杆菌、肺炎链球菌、沙眼衣原体、乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒染样本均无交叉反应。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为本发明的试剂盒在orflab基因通道的荧光扩增曲线图；
24.图2为本发明的试剂盒在n基因通道荧光扩增曲线图；
25.图3为本发明的试剂盒在内标cy5通道的荧光扩增曲线图；
26.图4为本发明的试剂盒特异性检测图。
具体实施方式
27.下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
28.sars-cov-2引物和探针包括新冠病毒orflab基因、n基因、内标rnase p基因的引物和探针。具体如下：
29.新冠病毒orflab基因引物、探针序列为：
30.正向引物：5'-atgctcgaactgcacct-3'(seq id no:1)；
31.反向引物：5'-taagccactggtatttcgc-3'(seq id no:2)；
32.探针：5'-tgagggacaaggacaccaagtgtctcacca-3'(seq id no:3)。
33.pcr扩增的序列为：atgctcgaactgcacctcatggtcatgttatggttgagctggtagcagaactcgaaggcattcagtacggtcgtagtggtgagacacttggtgtccttgtccctcatgtgggcgaaataccagtggctta(seq id no:10)。
34.新冠病毒n基因引物、探针序列为：
35.正向引物：5'-gcgatcaaaacaacgtcggc-3'(seq id no:4)；
36.反向引物：5'-gtcttccttgccatgttgagt-3'(seq id no:5)；
37.荧光探针：5'-ctgcgtcttggttcaccgctctca-3'(seq id no:6)。
38.pcr扩增的序列为：gggcgcgatcaaaacaacgtcggccccaaggtttacccaataatactgcgtcttggttcaccgctctcactcaacatggcaaggaagaccttaaattccctcgaggacaaggcgttccaattaacaccaa(seq id no:11)。
39.内标病毒样rnase p基因引物、探针序列为：
40.正向引物：5'-ggcggtgtttgcagatttgg-3'(seq id no:7)；
41.反向引物：5'-ctgtctccacaagtccgc-3'(seq id no:8)；
42.探针：5'-tgcgagcgggttctgacctgaaggct-3'(seq id no:9)。
43.pcr扩增的序列为：ggcggtgtttgcagatttggacctgcgagcgggttctgacctgaaggctctgcgcggacttgtggagacag(seq id no:12)。
44.上述探针为锁核酸修饰的探针，seq id no:3、seq id no:6和seq id no:9所示探针的5'端起第13位、第15位、第18位、第20位和第21位中的1个或多个碱基均被锁核酸修饰。锁核酸对dna具有很好的识别能力和强大的亲和力，且不易被酶解，因此本发明将锁核酸作为探针与dna链结合的复合体具有很高的热稳定性。通过加入锁核酸探针，在pcr过程中对目的片段进行富集，进一步提高检测灵敏度和特异性。
45.上述探针的5'端标记不同的荧光基团：fam、vic、rox、cy3和cy5，3'端标记不同的猝灭基团：eclipse、bhq1和dabcyl，本实施例中，锁核酸修饰的荧光探针如表1所示：
46.表1荧光探针
47.病毒探针序列
orflab基因5'-fam-tgagggacaaggacaccaagtgtctcacca-eclipse-3'n基因5'-vic-ctgcgtcttggttcaccgctctca-bhq1-3'内标rnasep基因5'-cy5-tgcgagcgggttctgacctgaaggct-dabcyl-3'
48.备注：其中小写字母表示该碱基被锁核酸修饰。
49.pcr扩增反应体系包括：包括检测orflab基因、n基因和内标rnase p基因的引物和探针、taq dna聚合酶、ung酶、dntps、tris-hcl、mgso4甘油和明胶；检测orflab基因和n基因的引物在pcr反应体系中的终浓度均为0.2-0.3μmol/l，探针在pcr反应体系中的终浓度均为0.05-0.1μmol/l；所述检测rnase p基因的引物在pcr反应体系中的终浓度为0.05-0.1μmol/l，探针在pcr反应体系中的终浓度为0.02-0.05μmol/l；taq dna聚合酶的终浓度为6-10u，ung酶的终浓度为1-3u，dntps的终浓度为0.65-0.15mmol/l，tris-hcl的浓度为50-55mmol/l，mgso4的终浓度为2-8mmol/l；甘油的质量分数为1-5％，明胶的质量分数为0.01-0.05％。在本实施例中，pcr反应液的各组分及含量见表2。
50.表2 pcr反应液组分及浓度
51.组分每一个反应中的体积/浓度taq10uung2udntps0.1mmol/ltris-hcl54mmol/lmgso47mmol/l甘油5％明胶0.01％seq id no:1-2、4-50.3mmol/lseq id no:30.1mmol/lseq id no:7-80.08mmol/lseq id no:60.04mmol/l加无菌水至45μl
52.pcr反应液中的甘油和明胶可改善dna变性复性情况、去除非特异扩增，本试剂盒对各组分进行针对性优化，提高了反应效率和特异性。
53.pcr扩增步骤：
54.s1，取含有新型冠状病毒基因组的假病毒颗粒用阴性血清稀释至105copies/ml、1000copies/ml、200copies/ml。用武汉百泰基因工程有限公司的核酸提取试剂提取核酸，其中105copies/ml、1000copies/ml各提取10次，200copies/ml提取20次。
55.s2，依照本文pcr扩增体系按每反应15μl配制反应体系，并按每反应15μl反应液+10μl样本核酸进行混合。
56.s3，pcr扩增：55℃逆转录15min，1个循环；95℃预变性30s，1个循环；95℃变性10s，60℃退火、延伸45s，收集荧光信号，变性、退火和延伸共45个循环，结果见图1-3。
57.图1-3所示，样本浓度为105copies/ml、1000copies/ml和200copies时orflab和n基因均可以检测出，且有明显的s型扩增曲线，表现为阳性，表明本试剂盒3种病毒检测限可达到200copies/ml。
58.表3试剂盒精密度测试
[0059][0060]
表3是orflab和n基因105copies/ml和1000copies/ml浓度检测10次的平均ct值，数据表明：105copies/ml orflab和n基因的cv值分别为0.53％和0.33％，1000copies/ml orflab和n基因的cv值分别为1.06％和0.5％，均小于5％，表明本试剂盒检测重复性好。
[0061]
为证明试剂盒的交叉反应性，利用上述试剂盒及检测方法来验证检测体系的特异性，对结核分枝杆菌、肺炎链球菌、沙眼衣原体、乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒样本检测，检测方法如下：
[0062]
s1，取结核分枝杆菌、肺炎链球菌、沙眼衣原体、乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒用武汉百泰基因工程有限公司的核酸提取试剂提取核酸。
[0063]
s2，依照本文pcr扩增体系按每反应15μl配制反应体系。
[0064]
s3，按每反应15μl反应液+10μl样本核酸进行混合。
[0065]
s4，pcr扩增：55℃逆转录15min，1个循环；95℃预变性30s，1个循环；95℃变性10s，60℃退火、延伸45s，收集荧光信号，变性、退火和延伸共45个循环，结果见图4。
[0066]
图4所知，所有结果均无起线，表明试剂盒与结核分枝杆菌、肺炎链球菌、沙眼衣原体、乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒感染样本均无交叉反应，特异性较好。
[0067]
以orflab基因、n基因、内标rnase p基因的探针不加锁核酸修饰，pcr反应体系不加ung酶、甘油和明胶为对比例，检测样本浓度为105copies/ml、1000copies/ml和200copies的含有新型冠状病毒基因组的假病毒颗粒。检测结果显示，重复检测10次时，检测结果重复性较差。而且采用本试剂盒检测结核分枝杆菌、肺炎链球菌、沙眼衣原体、乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒样本检测时，有交叉反应，出现假阳性，特异性较差。
[0068]
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的
精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。