一种Cagrilintide的合成方法与流程

一种cagrilintide的合成方法
技术领域
1.本发明涉及一种多肽药物合成领域，特别涉及cagrilintide的合成方法。


背景技术：

2.英文名：cagrilintide。
3.肽序列为：
4.eicosanedioic acidγ-glu-lys-cys-asn-thr-ala-thr-cys-ala-thr-gln-arg-leu-ala-glu-phe-leu-arg-his-ser-ser-asn-asn-phe-gly-pro-ile-leu-pro-pro-thr-asn-val-gly-ser-asn-thr-pro-nh2(disulfide bridge:cys4-cys9)
5.cagrilintide，是诺和诺德在研的一种胰淀素类似物cagrilintide，此前已在2期临床试验中证明对肥胖症治疗有效。cagrilintide是一种长效胰淀素类似物，半衰期约为7-8天。与普兰林肽(一种胰淀素类似物，具有非常短的血浆半寿期，因此必须每天注射2-3次)相比，显著提高了提高半衰期。wo2010046357和wo2009034119公开了包含具有白蛋白结合残基的胰岛淀粉样多肽类似物的多肽(称为胰岛淀粉样多肽衍生物)。即使这些具有白蛋白结合部分的多肽与普兰林肽相比显示改进的药代动力学(pk)或药效学(pd)性质，它们在某些条件下仍可能显示物理稳定性差。胰淀素(amylin)是glp-1信号通路以外，另一种与饥饿和饱腹感相关的激素。cagrilintide能够减少能量摄入，调节食物选择和偏好，其与胰岛素共同分泌而发挥葡萄糖调节作用，抑制餐后胰高血糖素释放，并延迟胃排空。在治疗糖尿病，肥胖症，代谢综合症以及心血管疾病等方面具有明显的优势，需求应用前景广泛。市场需要一种反应操作简单、反应速率高、成本低适于规模化生产的cagrilintide的合成方法，本发明解决这样的问题。


技术实现要素：

6.为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种cagrilintide的合成方法，本发明合成cagrilintide反应操作简单、反应速率高、成本低适于规模化生产，且纯度和收率高，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。
7.为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
8.一种cagrilintide的合成方法，包括如下步骤：
9.步骤一，选取cagrilintide序列的第7-8位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh，以cagrilintide序列的第10-11位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh，以cagrilintide序列的第21-22位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ser-ser(pro-me-me)-oh；
10.步骤二，按照氨基酸序列fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-ser-ser(pro-me-me)-oh、fmoc-his(trt)-oh、
fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-glu-otbu、eicosanedioic acid进行如下偶联反应：
11.rink amideam树脂加入dcm溶胀后，经过抽干溶剂、洗涤，加入脱保护试剂脱除fmoc，洗涤，茚检结果呈阳性；加入活化后的fmoc-pro-oh、hobt、dic混合液反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干、洗涤完成偶联反应；氨基树脂、fmoc-pro-oh、hobt、dic混合液按照摩尔比范围为1：2-4：2.2-4.4：2.2-4.4；
12.偶联结束后，经过洗涤干燥，得到cagrilintide肽树脂；
13.步骤三，将全保护肽加入裂解试剂，经过沉淀、干燥得到cagrilintide线肽；
14.步骤四，用环化试剂和vc试剂对线性粗肽进行环化，再经过过滤得到cagrilintide粗品。
15.前述的一种cagrilintide的合成方法，偶联反应具体为：称取rink amideam树脂5.71g(树脂替代度为0.35mmol/g)加入到固相反应器中，加入50ml dcm溶胀树脂0.5h；抽干溶剂，加入50ml dmf溶液洗涤多次，抽干溶剂；加入50ml脱保护试剂脱除fmoc 30分钟，温度不超过20摄氏度，加入dmf 50ml洗涤多次，茚检结果呈阳性；称取fmoc-pro-oh 5.03g，hobt 1.13g，dic1.2ml，加入dmf20ml溶解，冰浴活化10min；将活化后的溶液加入到反应器中，反应1h，茚检检测结果呈阴性后，抽干；加入dmf洗涤多次，每次200ml。
16.前述的一种cagrilintide的合成方法，脱保护试剂为哌啶和dmf的混合液，哌啶和dmf的混合液由质量百分数20％的哌啶和质量百分数为80％的dmf组成。
17.前述的一种cagrilintide的合成方法，步骤三，配制200ml裂解试剂，冰浴条件下加入全保护肽，0.5h后恢复至室温继续反应2h，反应结束后，加入无水乙醚沉淀，离心沉淀多次，每次加入乙醚300ml，干燥后所得产品即为cagrilintide线肽。
18.前述的一种cagrilintide的合成方法，裂解试剂为tfa:edt:tis:h2o体积比＝87.5:5:2.5:5。
19.前述的一种cagrilintide的合成方法，步骤四中的环化的具体步骤包括：按照1g线性肽粗品溶于100ml的50％乙腈水溶液的剂量将线性肽粗品溶于乙腈水溶液，将线性肽溶清后加入纯化水稀释至1g/l；滴加环化试剂至环化液显微黄搅拌5分钟左右颜色未褪去，滴加适量vc试剂至环化液澄清无色即可。
20.前述的一种cagrilintide的合成方法，环化试剂由每克碘溶于30-40ml乙醇配置而成。
21.前述的一种cagrilintide的合成方法，vc试剂由每克vc溶于20-30ml纯化水配置而成。
22.前述的一种cagrilintide的合成方法，步骤四中过滤为微孔滤膜过滤。
23.本发明的有益之处在于：
24.本发明采用fmoc固相策略合成cagrilintide，利用二肽片段代替常用的氨基酸逐个偶联方法；反应操作简单、反应速率高、成本低适于规模化生产；
25.本发明发现以cagrilintide序列的第7-8位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ala-thr
(pro-me-me)-oh，以cagrilintide序列的第10-11位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh，以cagrilintide序列的第21-22位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ser-ser(pro-me-me)-oh，三者在提高cagrilintide纯度和收率上具有协同作用；
26.本发明的方法得到的cagrilintide纯度和收率高，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。
附图说明
27.图1是本发明实施例1的色谱结果图；
28.图2是本发明对比实施例1的色谱结果图；
29.图3是本发明对比实施例2的色谱结果图。
具体实施方式
30.以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
31.实施例1：以7-8fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh，10-11fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh，21-22fmoc-ser-ser(pro-me-me)-oh制备cagrilintide肽树脂：
32.以cagrilintide序列的第7-8位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh，以cagrilintide序列的第10-11位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh，以cagrilintide序列的第21-22位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ser-ser(pro-me-me)-oh；
33.称取rink amideam树脂5.71g(树脂替代度为0.35mmol/g)加入到固相反应器中，加入50ml dcm溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，加入50ml dmf溶液洗涤三次，抽干溶剂。加入50ml v/v20％哌啶/dmf脱除fmoc 30分钟，温度不超过20摄氏度，加入dmf 50ml洗涤6次。茚检结果呈阳性。称取fmoc-pro-oh 5.03g，hobt 1.13g，dic1.2ml，加入dmf20ml溶解，冰浴活化10min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应1h，茚检检测结果呈阴性后，抽干。加入dmf洗涤3次，每次200ml。需要说明的是：这里的数值都只是一种实施例，只要是按照氨基树脂、fmoc-pro-oh、hobt、dic混合液按照摩尔比1：2-4：2.2-4.4：2.2-4.4都适用于本发明。这里v/v20％哌啶/dmf是由质量百分数20％的哌啶和质量百分数为80％的dmf组成的混合液，只是一种脱保护试剂，也可以选用其他脱保护剂，例如1％的dbu/dmf溶液(dbu为1,8-二氮杂环[5,4,0]-7十一碳烯)，5％的哌嗪/dmf溶液。
[0034]
重复以上步骤，按照氨基酸序列fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-ser-ser(pro-me-me)-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-glu-otbu、eicosanedioic acid进行偶联反应。偶联结束后，dcm与甲醇交替洗涤3次，每次400ml，真空干燥，得到cagrilintide肽树脂。
[0035]
裂解：
[0036]
配制200ml裂解试剂为tfa:edt:tis:h2o体积比＝87.5:5:2.5:5，冰浴条件下加入全保护肽，0.5h后恢复至室温继续反应2h，反应结束后，加入无水乙醚沉淀。离心沉淀4次，每次加入乙醚300ml。干燥后所得产品即为cagrilintide线肽，线肽得到9.24g。
[0037]
环化：
[0038]
1)环化试剂的配制：每克碘溶于30-40ml乙醇
[0039]
2)vc试剂的配制：每克vc溶于20-30ml纯化水
[0040]
3)环化：线性粗肽溶于20％乙腈水溶液(1g线性肽粗品溶于100ml的50％乙腈水溶液)，线性肽溶清后加入纯化水稀释至1g/l。滴加环化试剂至环化液显微黄搅拌5分钟左右颜色未褪去，滴加适量vc试剂至环化液澄清无色即可。
[0041]
4)后处理：环化结束后，用微孔滤膜过滤得cagrilintide粗品。
[0042]
纯化制备冻干粉为为3.18g，推算收率40.76％，纯度97.55％。
[0043]
纯化分析方法：c18色谱柱
[0044]
梯度：
[0045]
流动相:mpa:0.1％tfa
[0046]
mpb:95％乙腈
[0047]
图谱结果图如图1所示。
[0048]
对比实施例1：10-11fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh，21-22fmoc-ser-ser(pro-me-me)-oh cagrilintide制备肽树脂：
[0049]
以cagrilintide序列的第10-11位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh，以cagrilintide序列的第21-22位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ser-ser(pro-me-me)-oh
[0050]
称取称取rink amideam树脂2.85g(sub＝0.35mmol/g)加入到固相反应器中，加入25ml dcm溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，加入25ml dmf溶液洗涤三次，抽干溶剂。加入25ml v/v20％哌啶/dmf脱除fmoc 30分钟，温度不超过20摄氏度，加入dmf 25ml洗涤6次。茚检结果呈阳性。称取fmoc-pro-oh 2.80g，hobt 1.13g，dic1.2ml，加入dmf20ml溶解，冰浴活化10min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应1h，茚检检测结果呈阴性后，抽干。加入dmf洗涤3次，每次200ml。
[0051]
重复以上步骤，按照氨基酸序列fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-ser-ser(pro-me-me)-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-thr-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-glu-otbu、eicosanedioic acid 1进行偶联反应。偶联结束后，dcm与甲醇交替洗涤3次，每次400ml，真空干燥，得到cagrilintide肽树脂。
[0052]
裂解
[0053]
配制100ml裂解试剂为tfa:edt:tis:h2o体积比＝87.5:5:2.5:5，冰浴条件下加入全保护肽，0.5h后恢复至室温继续反应2h，反应结束后，加入无水乙醚沉淀。离心沉淀4次，每次加入乙醚150ml。干燥后所得产品即为cagrilintide线肽，线肽得到4.16g。
[0054]
环化
[0055]
1)环化试剂的配制：每克碘溶于30-40ml乙醇
[0056]
2)vc试剂的配制：每克vc溶于20-30ml纯化水
[0057]
3)环化：线性粗肽溶于20％乙腈水溶液(1g线性肽粗品溶于100ml的50％乙腈水溶液)，线性肽溶清后加入纯化水稀释至1g/l。滴加环化试剂至环化液显微黄搅拌5分钟左右颜色未褪去，滴加适量vc试剂至环化液澄清无色即可。
[0058]
4)后处理：环化结束后，用微孔滤膜过滤得cagrilintide粗品。
[0059]
纯化制备冻干粉为为1.31g，推算收率33.5％，纯度96.75％
[0060]
纯化分析方法：c18色谱柱
[0061]
梯度：
[0062]
流动相:mpa:0.1％tfa
[0063]
mpb:95％乙腈。
[0064]
图谱如图2所示。
[0065]
对比实施例2：7-8fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh，21-22fmoc-ser-ser(pro-me-me)-oh制备cagrilintide肽树脂：
[0066]
以cagrilintide序列的第7-8位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh，以cagrilintide序列的第21-22位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ser-ser(pro-me-me)-oh
[0067]
称取称取rink amideam树脂2.85g(树脂替代度为0.35mmol/g)加入到固相反应器中，加入50ml dcm溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，加入50ml dmf溶液洗涤三次，抽干溶剂。加入50ml v/v20％哌啶/dmf脱除fmoc 30分钟，温度不超过20摄氏度，加入dmf 50ml洗涤6次。茚检结果呈阳性。称取fmoc-pro-oh 2.80g，hobt 1.13g，dic1.2ml，加入dmf20ml溶解，冰浴活化10min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应1h，茚检检测结果呈阴性后，抽干。加入dmf洗涤3次，每次200ml。
[0068]
重复以上步骤，按照氨基酸序列fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-ser-ser(pro-me-me)-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-glu-otbu、eicosanedioic acid
[0069]
进行偶联反应。偶联结束后，dcm与甲醇交替洗涤3次，每次400ml，真空干燥，得到cagrilintide肽树脂。
[0070]
裂解：
[0071]
配制100ml裂解试剂为tfa:edt:tis:h2o体积比＝87.5:5:2.5:5，冰浴条件下加入
全保护肽，0.5h后恢复至室温继续反应2h，反应结束后，加入无水乙醚沉淀。离心沉淀4次，每次加入乙醚150ml。干燥后所得产品即为cagrilintide线肽，线肽得到4.23g。
[0072]
环化：
[0073]
1)环化试剂的配制：每克碘溶于30-40ml乙醇
[0074]
2)vc试剂的配制：每克vc溶于20-30ml纯化水
[0075]
3)环化：线性粗肽溶于20％乙腈水溶液(1g线性肽粗品溶于100ml的50％乙腈水溶液)，线性肽溶清后加入纯化水稀释至1g/l。滴加环化试剂至环化液显微黄搅拌5分钟左右颜色未褪去，滴加适量vc试剂至环化液澄清无色即可。
[0076]
4)后处理：环化结束后，用微孔滤膜过滤得cagrilintide粗品。
[0077]
纯化制备冻干粉为1.36g，推算收率34.8％，纯度97.06％。
[0078]
纯化分析方法：c18色谱柱
[0079]
梯度：
[0080]
流动相:mpa:0.1％tfa
[0081]
mpb:95％乙腈
[0082]
图谱如图3所示。
[0083]
由实施例1和对比实施例1、2的实验结果可知：本发明以cagrilintide序列的第7-8位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh，以cagrilintide序列的第10-11位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ala-thr(pro-me-me)-oh，以cagrilintide序列的第21-22位氨基酸作为伪脯二肽fmoc-ser-ser(pro-me-me)-oh，三者在提高cagrilintide纯度和收率上具有协同作用。
[0084]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。