一种体外扩增外周血NK的方法与流程

一种体外扩增外周血nk的方法
技术领域
1.本发明涉及生物细胞培养技术领域，尤其是一种体外扩增外周血nk的方法。


背景技术：

2.自然杀伤细胞(natural killer cell，nk)是淋巴细胞的一种，来源于cd34+造血祖细胞。既往的研究表明，源自外周血中的nk细胞大部分(90％左右)表达cd16+cd56dim亚群，这群细胞通过产生穿孔素、颗粒酶和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用而发挥细胞毒作用；而占少部分(10％左右)的cd16-cd56bright亚群通过分泌细胞因子发挥功能。总体而言，nk细胞是人类先天免疫中的一类具有重要作用的细胞，它是通过细胞毒性作用，分泌多种细胞因子，进而调控机体的抗感染能力以及抗肿瘤的能力，是人体防御肿瘤的第一道防线，在过继免疫治疗恶性肿瘤中具有良好的应用前景，也是常见的免疫细胞治疗种类之一。
3.在实际临床应用中，由于nk细胞在外周血中占比较小，仅占淋巴细胞5％～15％，从外周血获得的nk细胞数量有限，不能用于肿瘤治疗。若要用于肿瘤免疫治疗，需将外周血中的nk细胞进行体外诱导扩增技术，进而获得大量的nk细胞。对于nk细胞体外扩增的方法的研究中，人们进行了很多的探索，如磁株分选法。此外，研究发现，一些肿瘤细胞，如k562和hfwt等也能够刺激其增殖，于是研究者们利用辐线照射致死的hfwt或k562细胞，再和pbmc一起培养，相当于为nk添加一层滋养层细胞，继而刺激nk的增殖，最终也能够让pbmc中的nk细胞扩增。但经过不断实践发现，单纯的细胞因子法培养nk，所获nk纯度及数量不稳定，而肿瘤细胞刺激(滋养层)法培养nk，虽然使用的是经辐照后的肿瘤细胞，但对其安全性仍然存在争议。
4.另一种培养方法，以相应的细胞因子(例如il-2)和成分明确的基础培养基和来培养pbmc，诱导其向nk细胞分化和增殖。以业内知名厂家为例：友康(nk细胞无血清培养基)：重组细胞因子与无血清培养基体系，50ml外周血或50ml脐带血，培养14天后可达到40-60亿/2l的细胞总数，60-90％的cd3-cd56+阳性率的培养结果。同立海源(nk细胞培养试剂盒套装)：重组细胞因子与无血清培养基体系，使用前需包被培养瓶，50ml外周血或50ml脐带血，培养14天后可获得接近40亿的细胞总数，cd3-cd56+阳性率可达90.4％。这些方法还存在一些不足：
①
nk的扩增数量和比例不稳定：受限于供者来源的不同，培养数量和比例波动范围大，一般而言，nk数量可达到15-25亿/l，nk表型cd3-cd56+可达到20％-90％左右；
②
nk扩增数量少，比例低：50ml血液用目前市面大多纯因子培养基培养，收获细胞总数40亿左右，比例最高在90％左右，影响nk的治疗效果；
③
价格昂贵。
5.现有专利cn107974431a公开了一种自然杀伤细胞的快速扩增方法。该方法所获得nk比例低，仅为40.6％。专利cn104593324a公开了一种自然杀伤细胞的培养基及自然杀伤细胞的扩增培养方法，该方法提供了包含无血清培养基、人血浆、il-2、il-21、il-15和okt-3的扩增培养自然杀伤细胞的培养基。用于扩增培养nk细胞，可以避免外源血清带来的风险。但是该方法分离pbmc后，需进行分选。分选操作繁琐，容易染菌，成本高。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有nk扩增培养方法存在的上述问题，尤其是扩增倍数低和nk比例低，培养过程复杂的问题，提供了一种体外扩增外周血nk的新方法。
7.本发明提供的体外扩增外周血nk的方法，采用的nk完全培养基是以贝索基础培养基为基液，在基液中加入il-2、il-15、il-21、肽聚糖、灭活自体血浆制备而成。其中各组分的含量如下：
8.250～1000iu/ml的il-2、10～500ng/ml的il-15、10～500ng/ml的il-21、2～20ug/ml的肽聚糖、5％～10％的灭活自体血浆。
9.优选的是，所述nk完全培养基中各组分含量：1000iu/ml的il-2、10ng/ml的il-15、10ng/ml的il-21、5ug/ml的肽聚糖、10％的灭活自体血浆。
10.本发明的体外扩增外周血nk的方法，具体步骤如下：
11.(1)自体血浆分离：将新鲜血液离心分离，吸取上层淡黄色血浆于离心管，56℃水浴30min灭活，然后离心去除沉淀，将上层血浆转移至新的离心管置于4℃冰箱保存备用；下层血细胞层用于提取pbmc。
12.(2)将获取的pbmc以nk完全培养基进行重悬，并将浓度调整至1～2
×
106cells/ml，接种于75cm2培养瓶中混合，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
13.(3)第3天换液：培养的细胞离心后更换新鲜nk完全培养基，调整细胞浓度至1～2
×
106cells/ml。
14.(4)第4-6天补液：每天观察细胞，根据细胞悬液颜色或细胞量添加nk完全培养基，每次添加体积不宜超过现有体积一倍。
15.(5)第7天计数，加入含il-2的贝索基础培养基使nk细胞浓度在1～2
×
106cells/ml，当培养液体积大于250ml则转移至培养袋培养。
16.(6)第8-12天每天观察或计数，根据培养液颜色变化或细胞浓度添加含il-2的贝索基础培养基培养液，使得细胞浓度低于1～2
×
106cells/ml；第12-14天收集细胞。
17.优选的是，所述步骤(5)和(6)中，添加的贝索基础培养基中il-2浓度为1000iu/ml。
18.优选的是，所述培养瓶使用前需要进行培养瓶包被：nk培养所需培养瓶用5ug/ml的cd16或nkg2d进行包被，置于4℃过夜，备用。
19.优选的是，所述pbmc提取方法：将步骤(1)的血细胞层用生理盐水1：1稀释混匀，加至装有ficoll分离液的离心管中，不能破坏液体分界面；400g离心30min；吸取中间的白细胞层，pbs清洗两次并计数，离心350g，10min。
20.与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
21.(1)本发明的nk完全培养基中加入了肽聚糖。肽聚糖是乳酸菌细胞壁上一层厚而有弹性的结构，是保护细胞的主要功能性物质，肽聚糖能激活免疫体系，诱导免疫因子释放或表达，从而提高免疫功能。而且研究表明，肽聚糖可明显激活tlr-nf-κb和jak-stat，而jak/stat信号通路对nk细胞发育、活化和杀伤活性有着极为重要的影响。
22.(2)本发明培养基所培养nk数量可扩增170倍左右，而nk纯度更是高达97％以上，远超行业水平。
23.(3)本发明培养过程中不需要从pbmc中分选nk即可获得高纯度nk，操作简单，成本
低。
24.(4)由成分明确的培养基和重组细胞因子组成，其成分明确，不含动物源成分，不存在引入动物源抗原的风险。
25.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
26.图1、本发明实施例1的nk流式检测结果图。
27.图2、对比例1的nk流式检测结果图。
28.图3、对比例2的nk流式检测结果图。
29.图4、本发明实施例1的nk杀伤能力流式检测结果图。
30.图5、对比例1的nk杀伤能力流式检测结果图。
31.图6、对比例2的nk杀伤能力流式检测结果图。
具体实施方式
32.以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
33.实施例1
34.本发明的体外扩增外周血nk的方法，具体步骤如下：
35.(1)培养瓶包被：nk培养所需培养器皿用5ug/ml的cd16(或nkg2d)进行包被，置于4℃过夜，备用。使用前弃去包被液，并用pbs清洗一次。
36.(2)自体血浆分离：将新鲜血液于2500转/分离心10分钟，吸取上层淡黄色血浆于50ml离心管，56℃水浴30min灭活，然后2500转/分离心10min去除沉淀，将上层血浆转移至新的50ml离心管置于4℃冰箱保存备用。下层细胞层用于提取pbmc。
37.(3)pbmc提取：将上一步获得的血细胞层用生理盐水1：1稀释混匀，加至装有ficoll分离液的离心管中，不能破坏液体分界面。400g离心30min。吸取中间的白细胞层，pbs清洗两次并计数，离心350g，10min。
38.(4)起始培养：获得的pbmc以本发明的nk完全培养基进行重悬，并将浓度调整至1～2
×
106cells/ml，接种于完成包被的75cm2培养瓶中混合，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
39.nk完全培养基配方：贝索基础培养基+10％自体灭活血浆+il-2(1000iu/ml)+il-21(10ng/ml)+il-15(10ng/ml)+肽聚糖(5ug/ml)
40.(5)第3天换液：培养的细胞离心后更换新鲜nk完全培养基，调整细胞浓度至1～2
×
106cells/ml。
41.(6)第4-6天补液：每天观察细胞，根据细胞悬液颜色或细胞量添加nk完全培养基，每次添加体积不宜超过现有体积一倍。
42.(7)第7天计数，加入含il-2的贝索基础培养基使nk细胞浓度在1～2
×
106cells/ml，当培养液体积大于250ml则转移至培养袋培养。贝索基础培养基中il-2浓度是1000iu/ml。
43.(8)第8-12天每天观察或计数，根据培养液颜色变化或细胞浓度添加含il-2的贝索基础培养基，贝索基础培养基中il-2浓度是1000iu/ml。初次用该方法培养者最好通过计数添加培养液，使得细胞浓度低于1～2
×
106cells/ml。当细胞生长至所需数量时即可进行收集使用或冻存。一般情况下，12-14天收集细胞最佳，因为此时细胞处于对数生长期，状态最好，越往后细胞状态会缓慢下滑。
44.培养结果：
45.培养14d后，通过流式细胞仪检测nk表型，结果显示nk比例高达97.08％(见图1)。培养14d后，检测其数量扩增178倍(71亿)。通过流式细胞仪检测nk杀伤能力，nk与靶细胞k562比例调整至5：1，共培养3小时。结果显示nk杀伤能力53.3％(见图4)。
46.对比例1
47.nk培养方法同实施例1。区别点在于，nk完全培养基中不添加肽聚糖。
48.培养瓶包被、自体血浆分离和pbmc提取同实施例1。
49.起始培养：获得的pbmc以本发明的nk完全培养基进行重悬，并将浓度调整至1～2
×
106cells/ml，接种于完成包被的75cm2培养瓶中混合，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
50.nk完全培养基配配方：贝索基础培养基+10％自体灭活血浆+il-2(1000iu/ml)+il-21(10ng/ml)+il-15(10ng/ml)。
51.第3天换液、第4-6天补液、第7天计数、第8-12天每天观察或计数同实施例1。
52.培养结果：
53.培养14d后，通过流式细胞仪检测nk表型，结果显示nk比例为76.95％(见图2)。培养14d后，检测其数量扩增124倍(49亿)。通过流式细胞仪检测nk杀伤能力，nk与靶细胞k562比例调整至5：1，共培养3小时。结果显示nk杀伤能力41.7％(见图5)。由此说明，在nk完全培养基中加入一定量的肽聚糖能够提升nk比例、细胞数量和杀伤能力，有利于体外扩增外周血nk。
54.对比例2
55.购买某品牌商品化培养基(同立海源)，按其说明书进行培养。
56.结果：
57.培养14d后，通过流式细胞仪检测nk表型，结果显示nk比例高达66.87％(见图3)。培养14d后，检测其数量扩增113倍(45亿)。通过流式细胞仪检测nk杀伤能力，nk与靶细胞k562比例调整至5：1，共培养3小时。结果显示nk杀伤能力38.42％(见图6)。
58.由实施例1和两个对比例可以看出，按本发明方法进行培养的nk在培养14d后细胞数量可扩增170倍左右，而且nk纯度更是高达97％以上，杀伤能力远高于对比例。且多个样本的结果显示无论在细胞数量、nk纯度还是杀伤能力均稳定可靠。
59.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。